項目七維Ｃ銀翹片中維生素Ｃ和對乙酰氨基酚的檢驗

2引入3維Ｃ銀翹片【成份】金銀花、連翹、荊芥、淡豆豉、牛蒡子、桔梗、薄荷油、蘆根、淡竹葉、甘草、維生素Ｃ、馬來酸氯苯那敏、對乙酰氨基酚。輔料為硬脂酸鎂、淀粉、滑石粉、蔗糖、明膠、檸檬黃。【性狀】本品為糖衣片，除去糖衣后顯灰褐色，略帶有少許白色斑點，或顯灰褐色與白色或淡黃色層；氣微，味微苦?！竟δ苤髦巍啃翛鼋獗?，清熱解毒。用于流行性感冒引起的發(fā)熱頭痛、咳嗽、口干、咽喉疼痛。4思考如何測定維Ｃ銀翹片中維Ｃ含量呢？一般我們采用紫外可見分光光度法。那么我們來介紹一下紫外可見分光光度計。5任務(wù)1維生素Ｃ含量的測定

1．能力目標：（1）掌握紫外-可見分光光度計法對維生素C含量進行測定；（2）能對儀器進行熟練操作及使用（3）能對儀器進行保養(yǎng)和簡單的維護；（4）能分析所測的數(shù)據(jù)；并給出結(jié)果6知識目標1、實驗?zāi)康模?、實驗注意事項；3、紫外-可見分光光度法基本原理以及基本構(gòu)造；4、紫外-可見分光光度法的實驗條件；5、對紫外-可見分光光度的定量分析；６、常見有機化合物的紫外吸收光譜特征；7、測定出維生素C的含量。7認知紫外可見分光光度計8紫外可見分光光度計9紫外可見分光光度計10一、基本組成光源單色器樣品室檢測器顯示1.光源在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。

可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。

紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜。11

2.單色器

將光源發(fā)射的復合光分解成單色光并可從中選出一任波長單色光的光學系統(tǒng)。①入射狹縫：光源的光由此進入單色器；②準光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。123.樣品室樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。4.檢測器利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)檢流計、數(shù)字顯示、微機進行儀器自動控制和結(jié)果處理13二、分光光度計的類型1.單光束簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。2.雙光束自動記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復雜，價格較高。143.雙波長

將不同波長的兩束單色光(λ1、λ2)快束交替通過同一吸收池而后到達檢測器。產(chǎn)生交流信號。無需參比池?！?/p>

=1～2nm。兩波長同時掃描即可獲得導數(shù)光譜。15有機物分子中外層價電子有三種存在形式：σ電子、π電子、n電子。三

方法原理分子軌道理論：一個成鍵軌道必定有一個相應(yīng)的反鍵軌道。通常外層電子均處于分子軌道的基態(tài)，即成鍵軌道或非鍵軌道上。1.有機化合物紫外吸收光譜的產(chǎn)生有機分子包括:成鍵軌道、；反鍵軌道

*、*非鍵軌道n

。例如HCHO分子的軌道，有機分子能級躍遷.可能的躍遷類型。16四.幾個概念(1)生色團：最有用的紫外—可見光譜是由π→π＊和n→π＊躍遷產(chǎn)生的。這兩種躍遷均要求有機物分子中含有不飽和基團。這類含有π鍵的不飽和基團稱為生色團。簡單的生色團由雙鍵或叁鍵體系組成，如乙烯基、羰基、亞硝基、偶氮基—N＝N—、乙炔基、腈基—C三N等。17(2)助色團有一些含有n電子的基團(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X等)，它們本身沒有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但當它們與生色團相連時，就會發(fā)生n—π共軛作用，增強生色團的生色能力(吸收波長向長波方向移動，且吸收強度增加)，這樣的基團稱為助色團。18(3)紅移與藍移有機化合物的吸收譜帶常常因引入取代基或改變?nèi)軇┦棺畲笪詹ㄩLλmax和吸收強度發(fā)生變化:λmax向長波方向移動稱為紅移，向短波方向移動稱為藍移(或紫移)。

吸收強度即摩爾吸光系數(shù)ε增大或減小的現(xiàn)象分別稱為增色效應(yīng)或減色效應(yīng)。(4)增色效應(yīng)與減色效應(yīng)19五、常見有機化合物紫外吸收光譜1.飽和烴：由于C－H只有σ電子，只產(chǎn)生σ－σ*躍遷，而σ－σ*躍遷需要能量大，在200nm以上無吸收，常用作紫外吸收的溶劑。2.含有孤立不飽和鍵的烴類化合物：都會產(chǎn)生π－π*躍遷，但多數(shù)在200nm以上無吸收，如乙烯(165、182)、乙炔(173)、丁烯(178)有吸收。對于含有=C=O、=C=S的不飽和烴類吸收紅移至遠紫外區(qū)甚至可見光區(qū)。20

共軛雙烯及多烯化合物：對于共軛雙烯和多烯化合物π－π*躍遷(K帶)，隨著取代基的變化及共軛體系延伸，吸收譜帶發(fā)生一些規(guī)律性的變化，其中伍德沃德總結(jié)出一個取代共軛雙烯的經(jīng)驗規(guī)則。3.含有共軛體系的不飽和烴類：共軛體系的化合物中的π－π*躍遷由于能量降低，因此發(fā)生明顯的紅移。大多數(shù)出現(xiàn)在200nm以上的區(qū)域。如乙烯的π－π*躍遷在182nm，而1，3-丁二烯在217nm。21常見有機化合物紫外吸收光譜表中的環(huán)指六員環(huán)，若是五環(huán)或七員環(huán)，則基本值分為228nm和241nm.22練習：求下列幾種有機物的λmax：23有色溶液對光選擇性吸收，那么一些無色的有機溶液是否對光沒有吸收呢？紫外吸收光譜與可見吸收光譜的異同點？紫外吸收光譜有哪些具體的應(yīng)用，如何指導實踐？

紫外吸收曲線的繪制與應(yīng)用24

紫外光、紫外吸收曲線

紫外光區(qū)域的波長范圍：10－400nm;

可見分光光度法的波長范圍：200nm-400nm紫外吸收曲線繪制：

即用一束具有連續(xù)波長的紫外光照射一定濃度的樣品溶液，分別測量不同波長下溶液的吸光度，即得到該化合物的紫外吸收曲線。茴香醛紫外吸收曲線

25紫外光譜的特點、原因產(chǎn)生原因特點可用來定性鑒定和結(jié)構(gòu)分析無需加顯色劑，測量簡單方便靈敏度高，準確度σ→σ*＞n→σ*＞π→π*

＞n→π*分子中價電子的能級躍遷產(chǎn)生。26紫外吸收光譜的應(yīng)用定性鑒定未知樣品采用比較光譜法，標準物對照，或者標準圖譜對照。推測結(jié)構(gòu)

推定化合物的共扼關(guān)系、部分骨架；區(qū)分化合物的構(gòu)型；互變異構(gòu)體的鑒別；化合物純度的檢測化合物在紫外區(qū)沒有明顯的吸收峰，而雜質(zhì)在紫外區(qū)有較強的吸收，就可以紫外吸收曲線檢測出該化合物所含的雜質(zhì)。如乙醇中雜質(zhì)苯測定檢查如四氯化碳中二硫化碳測定檢查27操作規(guī)程(使用方法)注意：儀器面板的測量模式應(yīng)按要求選擇操作開機預熱選擇光源選擇波長調(diào)透射比為零調(diào)透射比為100%樣品測定281儀器與試劑

UV-725紫外分光光度計，VitC對照品及銀翹片，硫酸溶液（pH=6）。292實驗操作

2.1標準曲線的繪制精密稱取VitC對照品0.05g溶于100ml硫酸溶液，再稀釋成一系列不同濃度的對照品溶液（0～14μg/ml），分別測出其吸光度。然后以濃度為橫坐標，以相應(yīng)的吸光度為縱坐標繪制出標準曲線。該曲線是經(jīng)過原點的一條直線，可求出該曲線的斜率。

30

2.2樣品測定取VitC20片，精密稱定，研細，精密稱出適量（相當于VitC50mg），置于100ml量瓶中，加硫酸溶液溶解并稀釋至刻度，濾過，精密量取續(xù)濾液2ml置于另一100ml量瓶中，加硫酸溶液稀釋至刻度，測出其吸光度A樣。由標準曲線查出樣品的濃度C樣品。31子任務(wù)1設(shè)計用紫外分光光度法測定維生素C含量的方案。并且測試含量配制一定濃度的維生素C溶液------在波長220—320nm內(nèi)分別測定其吸光度值-----以測定波長為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制吸收曲線---確定最大吸收波長32注意：

1、維生素C的還原能力強而易被氧化，特別是在堿性溶液中易被氧化。另外在堿性溶液或強酸性溶液中還能進一步發(fā)生水解。因此，選擇硫酸溶液使成弱酸性。

2、測定時溶液pH的選擇:維生素C的紫外最大吸收波長與溶液的pH值有著密切關(guān)系。在pH=2.0時，溶液的最大吸收波長在245nm;在pH=12時，溶液的最大吸收波長在300nm;在pH=5～10范圍時，溶液的最大吸收波長在267nm，況且在pH=6.0時吸收度值最大。所以，選擇測定溶液的pH=6.0。

33任務(wù)2配制標準溶液，分別在測定波長下測定吸光度值34任務(wù)2測定銀翹片中VC吸光度值，并確定待測樣濃度.35思考題目為什么紫外分光光度計定量測定中沒有加顯色劑

項目七維Ｃ銀翹片中維生素Ｃ和對乙酰氨基酚的檢驗

37思考如何測定維Ｃ銀翹片中對乙酰氨基酚呢？

一般我們采用高效液相色譜法。那么我們來介紹一下高效液相色譜。38能力目標（1）能利用高效液相色譜測定對乙酰氨基酚的含量；（2）會使用液相色譜對產(chǎn)品進行定量分析；（3）能熟練對儀器進行操作及使用；（4）能對儀器進行保養(yǎng)和簡單的維護；（5）能分析所測的數(shù)據(jù)，并給出結(jié)果。39知識目標（一）液相色譜法測定對乙酰氨基酚的含量；1、實驗注意事項；2、液相色譜法的基本原理以及基本構(gòu)造；3、液相色譜法的實驗條件；4、對液相色譜圖的定性定量分析；2007-4-10

40液相色譜儀（1）41液相色譜儀（2）42液相色譜儀（3）43

液相色譜儀（4）44一、高效液相色譜法的特點

特點：高壓、高效、高速高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。

45二、流程及主要部件

1.流程

462.主要部件(1)高壓輸液泵

主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。

為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕.47(2)梯度淋洗裝置外梯度:利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。484950(3)進樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：512007-4-10

(4)高效分離柱柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。

52(5)高效液相色譜檢測器

紫外光度檢測器（UV）：最小檢測量10-9g·mL-1，對流量和溫度的波動不敏感，可用于梯度洗脫。最常用的檢測器。53光電二極管陣列檢測器

光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。

54553、固定相、流動相及分離柱

氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。選擇短柱、細內(nèi)徑提高分析速度.564.流動相及流動相的極性（1）可顯著改變組分分離狀況的流動相選擇在液相色譜中顯得特別重要。液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。575、流動相組成

流動相按組成不同可分為單組分和多組分；按極性可分為極性、弱極性、非極性；按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。

586、選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題：（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。

（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。

59三、高效液相色譜法的主要分離類型

1.吸附色譜（液-固吸附色譜）以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。2.分配色譜（液-液分配色譜）早期通過在擔體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學鍵合固定相，即用化學反應(yīng)的方法通過化學鍵將固定液結(jié)合在擔體表面。

603.離子交換色譜固定相為離子交換樹脂，流動相為無機酸或無機堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換基團的交換能力的不同而得到分離。4.凝膠色譜（空間排阻色譜）

以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠；611.1儀器與試劑日本島津LC-6A高效液相色譜儀,C-R3A數(shù)據(jù)處理機,SPD-6AV紫外檢測器.對乙酰氨基酚對照品為中國生物藥品檢定所出品,甲醇為色譜純,高氯酸為分析純,水為二次蒸餾水.實驗部分621.2色譜條件(色譜柱為大連依利特公司Hypersil-C184.6mm×150mm,流動相為甲醇/水30:70,V/V,用高氯酸調(diào)至pH4.0,檢測波長285nm,流速0.8ml/min.1.3對照品溶液的配制精密稱取經(jīng)105℃干燥恒重的對乙酰氨基酚對照品50mg,置于50ml容量瓶中,用流動相定容,制成濃度為1.0mg/ml的對乙酰氨基酚對照品儲備液.63操作步驟1)．過濾流動相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。

2)．對抽濾后的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。

3)．打開HPLC工作站（包括計算機軟件和色譜儀），連接好流動相管道，連接檢測系統(tǒng)。

4)．進入HPLC控制界面主菜單，點擊manual，進入手動菜單。

64操作步驟5)．有一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口