高二生物選修一第三章知識點總結(jié)微生物的實驗室培養(yǎng)需掌握培養(yǎng)基的配制與無菌技術(shù)。培養(yǎng)基按物理狀態(tài)分為固體（含瓊脂）、液體、半固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基常用于分離、鑒定微生物，液體培養(yǎng)基用于工業(yè)生產(chǎn)；按功能分為選擇培養(yǎng)基（如以尿素為唯一氮源篩選尿素分解菌）和鑒別培養(yǎng)基（如伊紅美藍鑒別大腸桿菌）。培養(yǎng)基的基本成分包括碳源（如葡萄糖、CO?）、氮源（如NH?、蛋白質(zhì)）、水、無機鹽，部分微生物需額外添加生長因子（如維生素）。配制培養(yǎng)基的步驟為計算（根據(jù)微生物需求確定各成分用量）、稱量（準(zhǔn)確稱取藥品，注意化學(xué)試劑的純度）、溶化（將稱好的藥品溶解，若需加瓊脂則需加熱至完全熔化）、滅菌（常用高壓蒸汽滅菌，121℃、100kPa下維持1530分鐘，確保殺死所有微生物包括芽孢和孢子）、倒平板（待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，在酒精燈火焰旁操作，避免雜菌污染，倒平板后需倒置，防止皿蓋冷凝水落入培養(yǎng)基）。無菌技術(shù)是微生物培養(yǎng)的關(guān)鍵，需區(qū)分消毒與滅菌：消毒是使用較為溫和的物理或化學(xué)方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物（不包括芽孢和孢子），如70%酒精擦拭雙手、巴氏消毒法（6265℃30分鐘或75℃1530秒）處理牛奶；滅菌是用強烈的理化因素殺死所有微生物（包括芽孢和孢子），如灼燒滅菌（接種環(huán)、接種針）、干熱滅菌（玻璃器皿，160170℃2小時）、高壓蒸汽滅菌（培養(yǎng)基、金屬器械）。實驗操作中需在酒精燈火焰旁進行，避免空氣中雜菌污染，接種工具使用前后需灼燒滅菌。大腸桿菌的純化培養(yǎng)常用平板劃線法和稀釋涂布平板法。平板劃線法通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線，將聚集的菌種逐步稀釋分散，最終在劃線末端形成單個菌落。操作時需注意：每次劃線前灼燒接種環(huán)（殺死殘留菌種，保證下一次劃線的菌種來自上一次末端），劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)（避免菌種污染環(huán)境或感染操作者），劃線時不能劃破培養(yǎng)基表面。稀釋涂布平板法需將菌液進行一系列梯度稀釋（如10?1至10??），取0.1mL稀釋液涂布平板，培養(yǎng)后統(tǒng)計菌落數(shù)（選擇30300個菌落的平板），該法既可用于分離純化，也可用于計數(shù)（統(tǒng)計的是活菌數(shù)）。涂布前需將涂布器浸酒精后灼燒滅菌，待冷卻后使用，避免高溫殺死菌種。微生物的計數(shù)方法包括活菌計數(shù)法（稀釋涂布平板法）和顯微鏡直接計數(shù)法。顯微鏡直接計數(shù)使用血細胞計數(shù)板，在顯微鏡下統(tǒng)計一定體積內(nèi)的菌體數(shù)量，包括活菌和死菌，優(yōu)點是快速簡便，缺點是不能區(qū)分死活。比濁法通過測量菌液的OD值（光密度）間接估計菌液濃度，OD值與菌數(shù)呈正相關(guān)，但需先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。分解尿素的細菌分離實驗中，選擇培養(yǎng)基以尿素為唯一氮源，只有能合成脲酶的細菌（將尿素分解為氨和CO?）才能生長。實驗步驟為：①土壤取樣（選擇富含有機質(zhì)的表層土，取10g土樣加入90mL無菌水制成菌懸液）；②梯度稀釋（細菌通常稀釋10?10?倍）；③接種培養(yǎng)（將不同稀釋度的菌液涂布于選擇培養(yǎng)基，3037℃倒置培養(yǎng)12天）；④菌落計數(shù)（選擇30300個菌落的平板，計算平均值）；⑤驗證（在菌落周圍滴加酚紅指示劑，若變紅則說明產(chǎn)生氨，該菌能分解尿素）。需設(shè)置空白對照（不接種的培養(yǎng)基），檢驗培養(yǎng)基是否被污染。分解纖維素的微生物分離實驗基于纖維素酶的作用，該酶由C?酶、Cx酶和葡萄糖苷酶組成，可將纖維素分解為葡萄糖。剛果紅染色法用于篩選分解菌：剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被分解后，復(fù)合物消失，出現(xiàn)透明圈（透明圈直徑與菌落直徑的比值越大，分解能力越強）。實驗步驟為：①土壤取樣（選擇富含纖維素的環(huán)境，如朽木、落葉堆積處）；②選擇培養(yǎng)（將土樣加入以纖維素為唯一碳源的液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)12天，富集纖維素分解菌）；③梯度稀釋（稀釋10310?倍）；④涂布平板（將稀釋液涂布于含剛果紅的鑒別培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)）；⑤挑選菌落（選擇產(chǎn)生明顯透明圈的菌落，進一步純化）。剛果紅染色有兩種方法：一是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅（需用NaCl洗去浮色）；二是在倒平板時加入剛果紅（需注意剛果紅會抑制部分微生物生長）。菌種保藏分為臨時保藏和長期保藏。