(10)授權(quán)公告號(hào)CN107075523B(65)同一申請(qǐng)的已公布的文獻(xiàn)號(hào)(30)優(yōu)先權(quán)數(shù)據(jù)62/018,1282014.06.27US(85)PCT國(guó)際申請(qǐng)進(jìn)入國(guó)家階段日(86)PCT國(guó)際申請(qǐng)的申請(qǐng)數(shù)據(jù)(87)PCT國(guó)際申請(qǐng)的公布數(shù)據(jù)WO2015/196275EN2(73)專利權(quán)人加拿大國(guó)家研究委員會(huì)(74)專利代理機(jī)構(gòu)北京瑞恒信達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11382代理人張偉丁磊A01H6/00(2018.01)(56)對(duì)比文件US2013267429A1,2013.1US2014057251A1,2014.02審查員王溯銘來(lái)自大麻的大麻環(huán)萜酚酸合酶本發(fā)明公開(kāi)了來(lái)自大麻的核酸分子，其已經(jīng)被分離和表征并編碼具有大麻環(huán)萜酚酸合酶活性的多肽。核酸的表達(dá)或過(guò)表達(dá)會(huì)改變大麻素化2i)所述分離的核酸分子的核苷酸序列編碼如SEQIDNO:2或6所示的多肽并編碼具有大麻環(huán)萜酚酸合酶活性的多肽；ii)所述分離的核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO:1或5所示并編碼具有大麻環(huán)萜酚酸合酶活性的多肽；iii)所述分離的核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO:8或9所示并編碼具有大麻環(huán)iv)所述分離的核酸分子的核苷酸序列是i)、ii)或iii)的補(bǔ)體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中，所述核苷酸序列如SEQIDNO:1或5中所示或?yàn)槠涿艽a子簡(jiǎn)并核苷酸序列，或前述中任何的補(bǔ)體。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子，其中，所述密碼子簡(jiǎn)并核苷酸序列如SEQIDNO:8或9所示，或前述中任何的補(bǔ)體。4.一種具有大麻環(huán)萜酚酸合酶活性的分離的多肽，其中所述分離的多肽如SEQIDNO:2或6所示。5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的分離的核酸分子或者根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離的多肽，其中，所述分離的核酸分子或所述分離的多肽與一個(gè)或多個(gè)異源部分耦合。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其中所述一個(gè)或多個(gè)異源部分為連接子、信號(hào)序列、可檢測(cè)標(biāo)記或如純化標(biāo)簽的標(biāo)簽中的一種或多種。7.一種包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)定義的核酸分子的構(gòu)建體或體外表達(dá)系統(tǒng)。8.一種重組微生物，其包含權(quán)利要求1-3、5或6中任一項(xiàng)所述的分離的核酸分子或者權(quán)利要求7所述的構(gòu)建體，和/或表達(dá)權(quán)利要求4或5中任一項(xiàng)所述的分離的多肽。9.一種調(diào)節(jié)生物體、細(xì)胞或組織中大麻素化合物的水平的方法，所述方法包括：i)引入并表達(dá)權(quán)利要求1-3、5或6中任一項(xiàng)定義的核酸分子以使生物體、細(xì)胞或組織中的大麻環(huán)萜酚酸合酶基因沉默從而降低大麻素化合物的水平；或ii)在生物體、細(xì)胞或組織中引入并表達(dá)或過(guò)表達(dá)權(quán)利要求1-3、5或6中任一項(xiàng)定義的核酸分子或權(quán)利要求7的構(gòu)建體以增加大麻素化合物的水平。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述核酸分子包含在構(gòu)建體中。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述微生物是酵母菌或大腸桿菌。13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微生物，其中所述微生物為酵母菌或大腸桿菌。14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，在與編碼大麻素生物合成途徑中的一種或多種酶的一種或多種其它核酸的表達(dá)或過(guò)表達(dá)相組合的情況下，表達(dá)或過(guò)表達(dá)所述核酸分子。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述大麻素生物合成途徑中的一種或多種酶是PT1中的一種或多種。16.根據(jù)權(quán)利要求9-12、14或15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，被調(diào)節(jié)的大麻素中的一種或多種是具有甲基或丙基側(cè)鏈的。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述大麻素是大麻萜酚酸、大麻萜酚、△?-四氫大3物的具有甲基或丙基側(cè)鏈的變體。18.一種組合物，所述組合物包含(a)根據(jù)權(quán)利要求1-3、5或6中任一項(xiàng)所述的分離的核酸；和/或(b)根據(jù)權(quán)利要求4或5中任一項(xiàng)所述的分離的多肽，根據(jù)權(quán)利要求7所述的構(gòu)建體；根據(jù)權(quán)利要求8或13所述的微生物。4來(lái)自大麻的大麻環(huán)萜酚酸合酶[0001]相關(guān)申請(qǐng)[0002]這是一項(xiàng)專利合作條約申請(qǐng)，其在于2014年6月27日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No.62/018,128的基礎(chǔ)上要求35U.S.C.§119的權(quán)益，該申請(qǐng)以引用的方式全文并入本文。發(fā)明領(lǐng)域[0003]本發(fā)明涉及來(lái)自大麻的大麻環(huán)萜酚酸合酶(CBCAS),編碼基于酶CBCAS的試劑的核苷酸序列，和用于生產(chǎn)大麻素和/或改變大麻素生產(chǎn)的方法。[0004]發(fā)明背景[0005]大麻(CannabissativaL.;cannabis,hemp,marijuana)是一種最古老且用途最廣的種植植物，現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)它可用作藥品、食品、化妝品和工業(yè)產(chǎn)品的來(lái)源。大麻還因含有作用于精神的大麻素(如△?-四氫大麻酚，THC)而用作非法毒品而聞名。目前正在探索作用于哺乳動(dòng)物大麻素受體的源自植物的大麻素和其它藥物作為藥品和/或用于不同病癥的治[0006]已知來(lái)自大麻的超過(guò)80種大麻素(Elsohly和Slade,2005)。主要的酸性大麻素是△?-四氫大麻酚酸(THCA)、大麻二酚酸(CBDA)和大麻環(huán)萜酚酸(CBCA)。加熱或長(zhǎng)期儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致酸性大麻素的脫羧(如THCA形成THC、CBDA形成大麻二酚(CBD)和CBCA形成大麻環(huán)萜酚[0007]在分子和酶水平上越來(lái)越多地了解大麻素生物合成途徑。第一酶是己酰輔酶A合成酶(Stout等，2013)。將己酰輔酶A(CoA)用作涉及兩種酶(丁烯酮(tetraketide)合酶和戊基二羥基苯酸(olivetolicacid)環(huán)化酶)的反應(yīng)的底物，這兩種酶一起起作用以合成戊基二羥基苯酸(Gagne等，2012)。通過(guò)芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶將戊基二羥基苯酸香葉基化(geranylated)以形成大麻萜酚酸(CBGA)(Fellermeier和Zenk,1998),其是通過(guò)氧化環(huán)化[0008]在vanBakel等(2011)中報(bào)道了大麻(Cannabisstativa)的基因組序列。然而沒(méi)有鑒定CBCA合酶的序列。[0009]遺傳證據(jù)表明，盡管THCA合酶和CBDA合酶在相同的基因座上可以是等位的，但是[0011]大麻素是珍貴的源自植物的天然產(chǎn)物。編碼大麻素生物合成酶的基因可用于含有超低水平THC和其它大麻素的大麻種類(lèi)的代謝工程中。這些基因還可證明可用于產(chǎn)生特定大麻種類(lèi)，用于生產(chǎn)基于大麻素的藥物，用于生產(chǎn)催化大麻素形成步驟的酶，或用于在其它生物體如細(xì)菌或酵母菌中重建大麻素生物合成。5發(fā)明內(nèi)容[0012]一方面，提供一種分離的和/或純化的核酸分子，所述核酸分子包含：i)核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1或5具有至少、大于或約96%的序列同一性；ii)核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1、5或8或9具有至少、大于或約78%的序列同一性并編碼具有大麻環(huán)萜酚酸合酶活性的多肽；iii)i)或ii)的補(bǔ)體；或者i)、ii)或iii)的大于、至少或約15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段。[0013]此外，另一方面，提供引物和探針，所述引物和探針包含與SEQIDNO:1、5或8或9的片段具有至少、大于或約96%的序列同一性的核苷酸序列或其補(bǔ)體。[0014]另一方面是一種核酸分子，所述核酸分子編碼與SEQIDNO:2或6具有至少、大于或約95%的序列同一性的多肽，可選地針對(duì)在除大麻之外的生物體中的表達(dá)進(jìn)行了密碼子[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子包含具有SEQIDNO:1、5、8或9的序列的核苷酸[0016]另一方面，提供一種分離的和/或純化的多肽，所述多肽包含與SEQIDNO:2或6具有至少、大于或約95%的序列同一性的氨基酸序列。[0017]另一方面，還提供一種本文描述的連接至異源信號(hào)序列或標(biāo)簽的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子包含編碼多肽的核苷酸序列，該多肽具有的氨基酸序列與連接至異源信號(hào)序列或標(biāo)簽的SEQIDNO:2或6具有至少、大于或約95%的序列同一性。[0018]另一方面，還提供一種抗體或其結(jié)合片段，所述抗體或其結(jié)合片段特異性結(jié)合本文所述的SEQIDNO:2或6或者其片段中的氨基酸序列的表位。[0019]另一方面包括一種核酸分子，所述核酸分子包含：i)核苷酸序列或其補(bǔ)體，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1或5具有至少約96%的序列同一性；或ii)核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1、5、8或9具有至少、大于或約78%的序列同一性并編碼具有大麻環(huán)萜酚酸合酶活性的多肽；可操作地與適于在細(xì)胞或生物體中表達(dá)的異源核酸序列連接。[0020]還提供載體構(gòu)建體，所述載體構(gòu)建體包含：i)核苷酸序列或其補(bǔ)體，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1或5具有至少約96%的序列同一性；或ii)核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1、5、8或9具有至少、大于或約78%的序列同一性并編碼具有大麻環(huán)萜酚酸合酶活性的多肽；可操作地與適于在細(xì)胞或生物體中表達(dá)的異源核酸序列連接。[0021]另一方面包括一種包含核酸的細(xì)胞或生物體，所述核酸包含：與SEQIDNO:1或5具有至少約96%的序列同一性的核苷酸序列，或與SEQIDNO:1、5、8或9具有至少、大于或約78%的序列同一性的核苷酸序列并編碼具有大麻環(huán)萜酚酸合酶活性的多肽；和/或表達(dá)包含與SEQIDNO:2或6具有至少約95%的序列同一性的氨基酸序列的重組多肽。[0022]再一方面包括一種組合物，所述組合物包含本文所述的分離的核酸、分離的多肽、[0023]再又一方面，提供一種改變生物體、細(xì)胞或組織中大麻素化合物的水平的方法，所述方法包括在生物體、細(xì)胞或組織中表達(dá)或過(guò)表達(dá)本發(fā)明的核酸分子或多肽。[0024]另一方面，提供一種改變生物體、細(xì)胞或組織中大麻素化合物的水平的方法，所述方法包括引入本發(fā)明的核酸分子或載體構(gòu)建體或其片段，以使生物體、細(xì)胞或組織中的CBCAS沉默和/或低表達(dá)。6[0025]大麻環(huán)萜酚酸合酶和編碼這種酶的核苷酸序列現(xiàn)已經(jīng)被鑒定和表征。所述核苷酸序列可用于通過(guò)篩選或遺傳工程產(chǎn)生過(guò)量或不足量產(chǎn)生大麻素化合物或其混合物的大麻植物。包含SEQIDNO:1和5的核苷酸序列的片段(如至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度)的引物和探針可用于鑒定大麻環(huán)萜酚酸合酶中的突變體或變體。這種大麻環(huán)萜酚酸合酶的核苷酸序列還可單獨(dú)或與編碼大麻素合成途徑中其它酶的核酸分子組合表達(dá)，以在其它植物或在微生物(如酵母菌、細(xì)菌、真菌)或其它原核或真核生物體中工程化大麻素生物合成。此外，敲除大麻中該基因的表達(dá)可以用來(lái)阻斷大麻素生物合成和由此降低大麻素的產(chǎn)量。[0026]根據(jù)以下的詳細(xì)描述過(guò)程，進(jìn)一步特征將得以闡釋或變得顯而易見(jiàn)。[0028]為了更清晰地理解本發(fā)明，結(jié)合附圖將其實(shí)施方案以實(shí)施例的形式進(jìn)行詳細(xì)描[0029]圖1示出一種在大麻中得到主要大麻素類(lèi)型的建議途徑?？s寫(xiě)：THCA合酶是△?-四[0030]圖2示出純的大麻素標(biāo)準(zhǔn)品和CBCAS反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC色譜圖。A:CBGA標(biāo)準(zhǔn)品(保留反應(yīng)產(chǎn)物表明重組酶產(chǎn)生CBCA(保留時(shí)間9.9分鐘)。插圖是這一反應(yīng)產(chǎn)生的CBCA的紫外光[0031]圖3示出了在巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中表達(dá)的純化重組CBCAS的SDS-純化的CBCAS。上面的條帶示出了EndoHf(70kDa),下面的條帶示出了去糖基化的CBCAS[0032]圖4示出了CBCAS活性的最佳條件。小圖A顯示了緩沖液和緩沖液pH對(duì)CBCA產(chǎn)量的具體實(shí)施方式[0033]本文描述了一種來(lái)自大麻的編碼CBCA合酶(CBCAS)的多核苷酸及編碼的多肽。描述了包括通過(guò)植物育種、誘變或遺傳工程使用所述CBCAS的方法，以及用于制備重組細(xì)胞和重組生物體(比如，如具有增加的CBCA含量的大麻植物的重組植物)以及無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的方和/或降低大麻細(xì)胞或植物的CBCA生物合成和CBCA含量。一些實(shí)施方案描述了所述CBCA與編碼其它酶的核酸組合在大麻素途徑中的用途。合酶具有高度相似性的基因，從而鑒定了與THCA合酶具有96%的核苷酸相似性的基因?；陔S后的生物化學(xué)表征，將所鑒定的基因命名為大麻環(huán)萜酚酸合酶(CBCAS)。測(cè)的信號(hào)序列。[0036]CBCAS開(kāi)放閱讀框的相應(yīng)氨基酸序列提供于SEQIDNO:2.SEQIDNO:2包含在氨基酸1-28處發(fā)現(xiàn)的預(yù)測(cè)的信號(hào)序列。SEQIDNO:6不包含該預(yù)測(cè)的信號(hào)序列。7[0037]一個(gè)實(shí)施方案提供一種分離的核酸，所述核酸編碼由SEQIDNO:2或6或其片段編碼的多肽。[0038]在一個(gè)實(shí)施方案中，使所述分離的或純化的核酸缺失全部或部分編碼信號(hào)序列的[0039]5'密碼子ATG(和或另外的密碼子，可選地1-50個(gè)另外的密碼子，可選地27個(gè)另外的密碼子)可被另一核酸序列替換，例如以引入編碼5'異源部分的序列，所示5'異源部分例如標(biāo)簽或如α交配因子信號(hào)序列的信號(hào)序列。[0040]在一個(gè)實(shí)施方案中，使所述分離的或純化的多肽缺失全部或部分信號(hào)序列，例如[0041]5'甲硫氨酸和/或5'端另外的氨基酸(例如，多達(dá)50個(gè)另外的氨基酸)可被如5'異源部分(例如標(biāo)簽或如α交配因子信號(hào)序列的信號(hào)序列)的另一氨基酸序列替換。[0042]其它信號(hào)序列可包括：例如來(lái)自黑曲霉(Aspergillusniger)的α-淀粉酶信號(hào)序列、來(lái)自泡盛曲霉(Aspergillusawamori)的葡糖淀粉酶信號(hào)序列、來(lái)自智人的血清白蛋白信號(hào)序列、來(lái)自Kluyveromcyesmaxianus的菊糖酶信號(hào)序列、來(lái)自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的轉(zhuǎn)化酶信號(hào)序列、來(lái)自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的殺傷蛋白信號(hào)序列或來(lái)自原雞(Gallusgallus)的溶菌酶信號(hào)序列。[0043]CBCAS的信號(hào)序列還可通過(guò)添加精氨酸殘基或用精氨酸殘基替換氨基酸而突變。[0044]SEQIDNO:8和9提供分別針對(duì)大腸桿菌和酵母菌優(yōu)化的密碼子優(yōu)化的核酸序列。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，該序列是密碼子優(yōu)化的序列。所述密碼子優(yōu)化的序列與SEQIDNO:1具有約78%和79%的序列同一性并其編碼的SEQIDNO:2。在一個(gè)實(shí)施方案中，使所述優(yōu)化的序列缺失全部或部分相應(yīng)的預(yù)測(cè)的信號(hào)序列的核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，將信號(hào)序列用另一信號(hào)序列替換，或缺失并用甲硫氨酸起始密碼子替換。[0045]一些實(shí)施方案涉及分離的或純化的核酸分子，所述核酸分子與SEQIDNO:1、5、8和/或9具有至少或約78%、至少或約80%、至少或約81%、至少或約82%、至少或約83%、至少或約84%、至少或約85%、至少或約86%、至少或約87%、至少或約88%、至少或約89%、至少或約90%、至少或約91%、至少或約92%、至少或約93%、至少或約94%、至少或約95%、至少或約96%、至少或約97%、至少或約98%或者至少或約99%的序列同一性。在某些實(shí)施方案中，所述分離的或純化的核酸分子是SEQIDNO:1、5、8或9的密碼子簡(jiǎn)并序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子具有大麻環(huán)萜酚酸合酶活性。[0046]還考慮上述序列的片段，包括SEQIDNO:1、5、8和9和與其具有至少或約78%或更9或者與其具有至少或約78%或更多，例如約96%序列同一性的序列的至少和/或多達(dá)或約15個(gè)、至少和/或多達(dá)或約20個(gè)、至少和/或多達(dá)或約25個(gè)、至少和/或多達(dá)或約30個(gè)、至少和/或多達(dá)或約40個(gè)、至少和/或多達(dá)或約50個(gè)、至少和/或多達(dá)或約60個(gè)、至少和/或多達(dá)或約70個(gè)、至少和/或多達(dá)或約80個(gè)、至少和/或多達(dá)或約90個(gè)、至少和/或多達(dá)或約100個(gè)、至少和/或多達(dá)200個(gè)、至少或多達(dá)或約300個(gè)、至少或多達(dá)或約400個(gè)、至少或多達(dá)或約500個(gè)、至少或多達(dá)或約600個(gè)、至少或多達(dá)或約700個(gè)、至少或多達(dá)或約800個(gè)、至少或多達(dá)或約900個(gè)、至少或多達(dá)或約1000個(gè)、至少或多達(dá)或約1100個(gè)、至少或多達(dá)或約1200個(gè)、至少或多達(dá)或約1300個(gè)、至少或多達(dá)或約1400個(gè)或者至少或多達(dá)或約1500個(gè)連續(xù)核苷酸。例如，所述核8酸分子可以是從15個(gè)連續(xù)核苷酸直至15000個(gè)連續(xù)核苷酸或兩者之間的任何范圍或數(shù)目的核苷酸。[0047]還包括與上述公開(kāi)的序列雜交的核酸分子。雜交條件可以是嚴(yán)格的，其中當(dāng)與SEQIDNO:1或5中的核酸分子具有至少約96%或約97%的序列同一性時(shí)，雜交才會(huì)發(fā)生。所述嚴(yán)格的條件可以包括用于已知Southern雜交的那些條件，比如，例如，在具有50%甲酰胺、糖硫酸酯和20mg/mL變性的剪切鮭魚(yú)精子DNA的溶液中于42℃下培養(yǎng)過(guò)夜，然后在約65℃下于0.1xSSC中洗滌雜交支持物。其它已知雜交條件是熟知的并描述于Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ThirdE[0048]本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，核酸序列的變化并不一定改變所編碼多肽的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，特定核酸序列中改變所編碼多肽氨基酸序列的核苷酸種類(lèi)的變化可導(dǎo)致基因的有效性減少或增加，并且在一些應(yīng)用中(如反義、共抑制或RNAi),可采用部分序列。如測(cè)試經(jīng)改變序列的有效性的方法一樣，可以改變或縮短核苷酸序列的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在某些實(shí)施方案中，可以容易地測(cè)試有效性，例如，通過(guò)常規(guī)的氣相色譜法。因此，所有所述核酸序列的這種改變都包括作為本發(fā)明公開(kāi)的一部分。[0049]本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，上述核酸分子的長(zhǎng)度取決于預(yù)期用途。例如，若預(yù)期用途是作為引物或探針，如用于PCR擴(kuò)增或用于篩選文庫(kù)，則核酸分子的長(zhǎng)度將小于全長(zhǎng)序列，例如，約15至約50個(gè)核苷酸的片段，可選地SEQIDNO:1、5、5、8或9的至少約19個(gè)核苷酸或其補(bǔ)體，可選地SEQIDNO:1、5、8或9的至少約25個(gè)核苷酸和/或其補(bǔ)體。在這些實(shí)施方案中，引物或探針可以與核酸序列的高度保守區(qū)基本相同或者可以與DNA序列的5'或3'端基本相同。在一些情況下，這些引物或探針在一些位點(diǎn)可使用通用堿基來(lái)滿足“基本相同”但又在序列識(shí)別中提供靈活性。值得注意的是，合適的引物和探針雜交條件是本領(lǐng)域熟知的。[0050]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子可用作引物且例如該核酸分子包含SEQIDNO:3或4的序列。[0051]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子綴合至和/或包含異源部分，例如獨(dú)特尾部、純化標(biāo)簽或可檢測(cè)標(biāo)記。[0052]所述獨(dú)特尾部可以是特異性核酸序列。[0053]核酸可以是例如末端標(biāo)記的(5’或3')或在合成期間可隨機(jī)引入標(biāo)記。[0054]在另一實(shí)施方案中，還提供一種分離的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含：i)含有SEQIDNO:1、5、8或9的至少約15個(gè)核苷酸(如SEQIDN:1、5、8或5=9的片段)的核酸分子，或含有15個(gè)核苷酸并與SEQIDNO:1、5、8或9具有至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的同一性的核酸；和ii)異源部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼包含酶活性的多肽。[0055]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述異源部分是編碼異源多肽的異源核酸且所述多核苷酸分子編碼融合多肽。9[0056]一些實(shí)施方案涉及分離的或純化的多肽，該分離或純化的多肽與SEQIDNO:2或6所示的氨基酸序列具有至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的同一性。[0057]還考慮SEQIDNO:2或6的片段。在一些實(shí)施方案中，所述多肽包含SEQIDNO:2或6的至少和/或多達(dá)約5個(gè)、至少和/或多達(dá)或約10個(gè)、至少和/或多達(dá)或約15個(gè)、至少和/或多達(dá)或約20個(gè)、至少和/或多達(dá)或約25個(gè)、至少和/或多達(dá)或約30個(gè)、至少和/或多達(dá)或約40個(gè)、至少和/或多達(dá)或約50個(gè)、至少和/或多達(dá)或約60個(gè)、至少和/或多達(dá)或約70個(gè)、至少和/或多達(dá)或約80個(gè)、至少和/或多達(dá)或約90個(gè)、至少和/或多達(dá)或約100個(gè)、至少和/或多達(dá)或約150個(gè)、至少和/或多達(dá)或約200個(gè)、至少和/或多達(dá)或約250個(gè)、至少和/或多達(dá)或約300個(gè)、至少和/或多達(dá)或約350個(gè)、至少和/或多達(dá)或約400個(gè)、至少和/或多達(dá)或約450個(gè)、至少和/或多達(dá)或約500個(gè)連續(xù)氨基酸。[0058]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述片段與SEQIDNO:2或6所示的氨基酸序列具有至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的同一性。[0059]在一個(gè)實(shí)施方案中，與大麻產(chǎn)生的CBCAS相比，分離的多肽是差異糖基化的、非糖基化的(例如缺乏N和/或0-連接的糖基化)和/或去糖基化的。例如，可以采用化學(xué)或酶方法，如用EndoHf或去糖基化酶混合物(mix)處理，使所述分離的多肽去糖基化。由于在酵母菌或其它表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，分離的多肽是例如差異糖基化的。[0060]其它實(shí)施方案涉及分離的或純化的復(fù)合多肽，所述分離或純化的復(fù)合多肽包含：i)含有SEQIDNO:2或6的至少5個(gè)氨基酸殘基且可選地與SEQIDNO:2或6所示的氨基酸序列具有至少、大于或約96%,至少、大于或約97%,至少、大于或約98%,或者至少、大于或約99%的同一性的多肽；和ii)異源部分。[0061]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述異源部分是異源多肽且該復(fù)合多肽是融合多肽。例如該異源多肽可以是如α交配因子信號(hào)序列的信號(hào)序列。[0062]在一個(gè)實(shí)施方案中，融合多肽可選地包含將含有SEQIDNO:2或6的全部或部分的多肽與異源多肽連接的肽連接子。[0063]在一個(gè)實(shí)施方案中，異源部分是可檢測(cè)標(biāo)記或標(biāo)簽。[0064]優(yōu)選地，可檢測(cè)標(biāo)記能夠(直接或間接)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。例如，標(biāo)記可以是不光(熒光團(tuán))或化學(xué)發(fā)光(生色團(tuán))化合物，如異硫氰酸熒光素、羅丹明或熒光素；酶，如堿性和硫氧還蛋白-標(biāo)簽。[0067]另一方面包含一種抗體，所述抗體特異性結(jié)合例如如SEQIDNO:2或6所示的或其片段，無(wú)論是從自然界取出(從血清中分離)還是合成(通過(guò)重組手段生產(chǎn))的抗體或其不含，優(yōu)選地至少約75%不含，和更優(yōu)選地至少約90%不含與其天然相關(guān)或在合成后相關(guān)的其它組分。[0069]本發(fā)明的另一方面包括一種組合物，所述組合物包含本文所述的核酸、構(gòu)建體、多其中該組合物包含抗體或其片段、合適的載體可以是如BSA的蛋白。[0070]在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包含本文所述的分離的核酸、分離的構(gòu)建體、分離的多肽、分離的抗體或其片段和/或分離的細(xì)胞，可選地與合適的載體、稀釋劑或添加劑組合。[0071]在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物是例如本文所述重組細(xì)胞或重組生物體的純化的提取物，例如包含增加水平的一種或多種大麻素和/或CBCAS的重組植物提取物。在一個(gè)實(shí)施面包括大麻素或包含根據(jù)本文所述的方法或系統(tǒng)生產(chǎn)的如CBCA或CBC的大麻素的組合物。[0072]在一個(gè)實(shí)施方案中，該純化的提取物包含重組生物體培養(yǎng)物的培養(yǎng)物上清液，例[0073]另一方面還提供一種發(fā)酵系統(tǒng)，所述發(fā)酵系統(tǒng)包含重組生物體或細(xì)胞，例如重組酵母細(xì)胞。該系統(tǒng)可包含CBGA和/或其他底物以及一種或多種酶或表達(dá)大麻素合成途徑中的一種或多種酶的細(xì)胞。[0074]一些實(shí)施方案涉及一種包含分離的或純化的核酸分子的構(gòu)建體或體外表達(dá)系統(tǒng)，所述分離的或純化的核酸分子與SEQIDNO:1、5、8或9具有至少、大于或約78%或更多，可選地至少、大于或約96%的序列同一性，可選地包含異源部分。因此，此處提供一種用于制備包含這樣的序列或其片段的構(gòu)建體或體外表達(dá)系統(tǒng)的方法，用于將以有義或反義取向的序列或部分序列或其補(bǔ)體引入細(xì)胞。[0076]如本文所用，“構(gòu)建體”是指人工產(chǎn)生的包含遞送載體和目標(biāo)多核苷酸的核酸，例如，包含本文所述的多核苷酸的載體?？蓪⒛繕?biāo)多核苷酸克隆至目標(biāo)載體以產(chǎn)生構(gòu)建體。[0077]在一個(gè)實(shí)施方案中，載體是表達(dá)載體?？赡艿谋磉_(dá)載體包括但不限于粘粒、質(zhì)?；蛐揎椀牟《?例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒),只要該載體與所使用的宿主細(xì)胞是相容的。表達(dá)載體是“適合宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的”,這是指該表達(dá)載體包含應(yīng)用的核酸分子和基于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞選擇的調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列與該核酸分子可操作地連接?？刹僮鞯剡B接意指核酸以允許該核酸表達(dá)的方式連接到調(diào)節(jié)序列。[0078]在一些實(shí)施方案中，分離的和/或純化的核酸分子、多核苷酸或包含這些分離的和/或純化的核酸分子的載體、構(gòu)建體或體外表達(dá)系統(tǒng)，可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因或重組生物體或重組細(xì)胞(如可選地重組生物體的細(xì)胞),所述轉(zhuǎn)基因或重組生物體或重組細(xì)胞產(chǎn)生具有大麻環(huán)萜酚酸合酶活性的多肽和/或具有大麻環(huán)萜酚酸合酶活性的調(diào)節(jié)水平的多肽。[0079]因此，一個(gè)實(shí)施方案涉及包含具有SEQIDNO:1和5的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸和可選地與SEQIDNO:1或5具有至少約96%的序列同一性的核酸分子的重組生物體、該生物體的宿主細(xì)胞或生殖組織(如種子)和/或包含所述分離的和/或純化的核酸分子的構(gòu)建體。[0080]在一個(gè)實(shí)施方案中，該重組生物體、細(xì)胞和/或生殖組織表達(dá)一種多肽，所述多肽具有該多肽序列的至少和/或多達(dá)約150、約175、約200、約225或約250個(gè)氨基酸，和可選地與SEQIDNO:2或6具有至少約96%的序列同一性。[0081]當(dāng)將編碼多肽的目標(biāo)核酸引入框內(nèi)的載體時(shí)，重組表達(dá)載體還可以含有編碼產(chǎn)生11融合多肽的異源多肽(如融合部分)的核酸序列。該異源多肽可提供重組蛋白的增加的表達(dá)；重組蛋白的增加的溶解性；和/或通過(guò)在親和純化中作為配體而在靶標(biāo)重組蛋白的純化中提供幫助。例如，可將蛋白水解切割位點(diǎn)加入靶標(biāo)重組蛋白之間以允許在純化融合多肽后從融合部分分離重組蛋白。典型的融合表達(dá)載體包括分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或蛋白A融合至重組蛋白的pGEX(AmradCorp.,Melbourne,Australia)、pMal(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)。[0082]優(yōu)選地，所述重組生物體是重組植物、重組多細(xì)胞微生物或重組昆蟲(chóng)。優(yōu)選的植物是大麻屬，如大麻、印度大麻(CannabisindicaLam)和莠草大麻(CannabisruderalisJanisch),特別是大麻。優(yōu)選的微生物是細(xì)菌(如大腸桿菌(Escherichiacoli))或酵母菌細(xì)胞微生物看作是生物體或包括宿主細(xì)胞的細(xì)胞。優(yōu)選的昆蟲(chóng)是草地夜蛾(Spodoptera[0083]通過(guò)已知的植物轉(zhuǎn)化方法例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、經(jīng)由粒子轟擊的轉(zhuǎn)化、花粉管或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，可產(chǎn)生包含CBCAS核苷酸序列的大麻植物。在這些方法學(xué)手段下，將目的基因引入靶標(biāo)生物體的基因組中。例如，F(xiàn)eeney和Punja,2003中描述了組織培養(yǎng)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麻(hemp)轉(zhuǎn)化。[0084]可將重組表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。可以通過(guò)例如電穿孔或氯化鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，用核酸轉(zhuǎn)化原核和/或真核細(xì)胞。例如，可通過(guò)常規(guī)技術(shù)(如磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體、病毒介導(dǎo)的方法酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞?？稍赟ambrook等(MolecularCloning:ALaboratoryManEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)和其它實(shí)驗(yàn)教材中發(fā)現(xiàn)用于轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染細(xì)胞的合適的方法。[0085]合適的宿主細(xì)胞包括多種真核細(xì)胞和原核細(xì)胞。例如，本發(fā)明的核酸和蛋白可在植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)選的植物細(xì)胞是大麻屬，如大麻、印度大麻(CannabisindicaLam)和莠草大麻(CannabisruderalisJanisch),特別是大麻。優(yōu)選的微生物是細(xì)菌(如大腸桿菌(Escherichiacoli))或酵母菌(如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris))。優(yōu)選的昆蟲(chóng)是草地夜蛾(Spodoptera[0086]因此，一個(gè)實(shí)施方案包括一種重組細(xì)胞，和在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該重組細(xì)胞是重組植物細(xì)胞。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該重組細(xì)胞是重組酵母細(xì)胞。[0087]可在Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEAcademicPress,SanDiego,CA(1991)中發(fā)現(xiàn)其它合適的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明的蛋白可基于假單胞桿菌的表達(dá)系統(tǒng)，如熒光假單胞菌(美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)：US2005/0186666)。[0088]因此，本文還提供一種包含本發(fā)明的核酸分子或多核苷酸的重組細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸分子導(dǎo)致大麻環(huán)萜酚酸合酶的水平增加。[0089]本文所述重組生物體、細(xì)胞和生殖組織可以具有改變的大麻素化合物水平。參照?qǐng)D1,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，核酸分子的表達(dá)或過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致大麻環(huán)萜酚酸合酶的表達(dá)或過(guò)表達(dá)，這可以導(dǎo)致大麻素化合物(如大麻環(huán)萜酚酸和大麻環(huán)萜酚)的產(chǎn)量增加。生物體、細(xì)胞或組織中的大麻環(huán)萜酚酸合酶的沉默將導(dǎo)致大麻環(huán)萜酚酸合酶的低表達(dá)，這可以導(dǎo)致酚或這些化合物的具有甲基或丙基側(cè)鏈的變體的積累。生殖組織可包括包含該分離的核酸[0090]核酸分子的表達(dá)或過(guò)表達(dá)可以結(jié)合編碼大麻素生物合成途徑中一種或多種其它酶的一種或多種其它核酸的表達(dá)或過(guò)表達(dá)來(lái)完成。其它核酸的一些實(shí)例包括編碼下述酶的核酸：己酰輔酶A合成酶、丁烯酮(tetraket[0091]與在相似或相同條件下生長(zhǎng)的具有正常水平的酶的相同品種的對(duì)照相比，本發(fā)明的大麻環(huán)萜酚酸合酶的表達(dá)或過(guò)表達(dá)將使大麻素化合物的水平增加，例如約1%-約20%、約2%-約20%、約5%-約20%、約10%-約20%、約15%-約20%、約1%-約15%、約1%-約10%、約2%-約15%、約2%-約10%、約5%-約15%、或約10%-約15%(w/w)。[0092]因此，另一方面包括一種改變生物體、細(xì)胞或組織中大麻素化合物的水平的方法，所述方法包括采用本發(fā)明的核酸分子或其片段以使生物體、細(xì)胞或組織中的CBCAS沉默和/或低表達(dá)。[0093]在一個(gè)實(shí)施方案中，可在生產(chǎn)CBGA的細(xì)胞或生物體中，或在生產(chǎn)CBCA和/或CBC的細(xì)胞和生物體中改變和/或生產(chǎn)CBCA和CBC,通過(guò)制備表達(dá)CBCAS的重組細(xì)胞可使所述CBCA和/或CBC的產(chǎn)量增加。[0094]另一方面包括生產(chǎn)CBCA的體外方法，所述方法包括：在合適條件下，使CBGA與CBCAS在溶液中或固定狀態(tài)下接觸合適的時(shí)間以生產(chǎn)CBCA和/或CBC;和分離和/或純化CBCA[0095]所述接觸可以例如通過(guò)在一定條件下將CBGA與重組CBCAS在溶液中和/或固定狀態(tài)下混合合適的時(shí)間從而將CBGA的至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%轉(zhuǎn)化為CBCA。[0097]可選地，體外分析在溫度35℃至50℃下或在兩者之間的(如約35℃至約50℃之間的任何0.1℃的增量)約任何溫度下，可選地在約35℃、約40℃、約45℃或約50℃下實(shí)施。[0098]可將CBCAS固定在例如珠子或柱樹(shù)脂上并用于例如體外系統(tǒng)中。[0099]CBCA的脫羧產(chǎn)物大麻環(huán)萜酚(CBC)對(duì)大麻的精神活性沒(méi)有顯著貢獻(xiàn)，但在高濃度和生物學(xué)效應(yīng)，包括鎮(zhèn)痛(Davis和Hatoum,1983)和抗傷害(antinocieptin)(Maione等，Turner,1982)、抗菌(Elsohly和Turner,1982)和抗腫瘤(Ligresti等，2006)活性。方法包括：[0101]i)將載體引入生產(chǎn)CBGA的細(xì)胞或生物體中以生產(chǎn)重組細(xì)胞或重組生物體，所述載體包含含有SEQIDNO:1、5、8或9或其保留CBCAS活性的片段的核酸，可選地所述片段與SEQIDNO:1、5、8或9具有至少或約78%或更多、可選地96%的序列同一性；[0102]ii)在允許所述核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)重組細(xì)胞和/或使重組生物體生長(zhǎng)；和可選地[0104]重組細(xì)胞可以瞬時(shí)表達(dá)、誘導(dǎo)表達(dá)和/或穩(wěn)定表達(dá)。[0105]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括加熱和/或儲(chǔ)存CBCA以生產(chǎn)CBC。儲(chǔ)存和/或加熱CBCA增加脫羧為CBC。例如，已顯示在>94℃的溫度下發(fā)生THCA和CBDA的熱脫羧(Veress等，1990)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，將CBCA加熱至至少約94℃,可選地加熱至少或約20分鐘、至少或約30分鐘、至少或約40分鐘、至少或約50分鐘或者至少或約60分鐘或更長(zhǎng)。在另一實(shí)或約30分鐘、至少或約40分鐘、至少或約50分鐘，或者至少或約60分鐘或更長(zhǎng)。在另一實(shí)施方案中，將CBCA加熱至至少約120℃,可選地加熱至少或約10分鐘、至少或約15分鐘、至少或另一實(shí)施方案中，所述溫度是約94℃至約150℃之間的任何0.1℃的增量，和所述加熱時(shí)間是約3分鐘至約90分鐘之間的任何1分鐘的增量。[0106]在一個(gè)實(shí)施方案中，分離和/或純化中性和酸性大麻素。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離和/或純化中性大麻素。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離和/或純化酸性大麻素。[0108]i)將載體引入生產(chǎn)CBGA的細(xì)胞或生物體中以生產(chǎn)重組細(xì)胞或重組生物體，所述載SEQIDNO:1、5、8或9具有至少約96%的同一性；[0109]ii)在允許所述核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)重組細(xì)胞和/或使重組生物體生長(zhǎng)；[0112]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物細(xì)胞是大[0113]在大麻植物中，通過(guò)使用編碼大麻素生物合成途徑的酶的基因(如本發(fā)明的CBCA合酶基因)的育種和選擇以及遺傳工程，可以實(shí)現(xiàn)大麻素產(chǎn)量增加或大麻素的減少或去除。此外，可將得到大麻素的生物合成途徑轉(zhuǎn)移至細(xì)菌、酵母菌、真菌或其它異源生物體中，或通過(guò)體外生物催化來(lái)生產(chǎn)大麻素而無(wú)需大麻植物。[0114]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物體是植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是大麻植[0115]核酸的分離和克隆是熟知的。類(lèi)似地，分離的基因可以插入到載體中并通過(guò)常規(guī)技術(shù)轉(zhuǎn)化至細(xì)胞中。核酸分子可轉(zhuǎn)化至細(xì)胞和/或生物體中。如本領(lǐng)域已知，可以通過(guò)多種方法將基因、載體和構(gòu)建體引入到細(xì)胞和/或生物體中，并且轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)技術(shù)的組合已經(jīng)成功地整合成為用于產(chǎn)生重組細(xì)胞和/或生物體的有效策略?？捎糜诒疚闹械倪@些方法已經(jīng)在其它地方描述過(guò)(Potrykus,1991;Vasil,1994;Walden和Wingender,1995;Songstad等，1995),并為本領(lǐng)域人員所熟知。合適的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并描述于一般技可以確定地知道，除了通過(guò)真空浸染(Bechtold等，1993)或傷口接種(Katavic等，1994)的農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化，同樣可以使用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(如下胚軸(DeBlock等，1989)或子葉葉柄(Moloney等，1989)傷口浸染)、粒子轟擊/基因槍法(Sanford等，1987;Nehra.等，1994;Becker等，1994)或聚乙二醇輔助的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法[0116]在一個(gè)實(shí)施方案中，重組細(xì)胞或生物體是轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因生物體。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組細(xì)胞或生物體包含含有所述分離的多核苷酸的附加體。[0117]重組表達(dá)載體除包含本文公開(kāi)的核酸分子或多核苷酸外，還包含用于插入的核酸分子的轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)序列。[0118]合適的調(diào)節(jié)序列可以源自多種來(lái)源，包括細(xì)菌、真菌、病毒、哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)基因AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中描述的調(diào)節(jié)序列)。合適的調(diào)節(jié)序列的選擇依賴于如下所述選擇的宿主細(xì)胞，并且可以容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完成。這種調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包括：轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和增強(qiáng)子或RNA聚合酶結(jié)合序列、核糖體結(jié)合序列，包括翻譯起始信限制性位點(diǎn)、增強(qiáng)子和賦予轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)能力的序列引入表達(dá)載體中。[0119]對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)同樣顯而易見(jiàn)的是，如其它地方描述的(Meyer,1995;Datla等，1997),可以利用啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)任何預(yù)期上調(diào)或下調(diào)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，其中使用組成型啟動(dòng)子(如基于CaMV35S的那些啟動(dòng)子),或通過(guò)使用下述啟動(dòng)子：所述啟動(dòng)子可以使基因表達(dá)靶向至特定細(xì)胞、組織(如用于轉(zhuǎn)基因在發(fā)育種子子葉中表達(dá)的napin啟動(dòng)子)、器官[0120]本文所使用的啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型的、組成型的、或組織特異性的或具有這些特性的不同組合。有用的啟動(dòng)子包括但不限于組成型啟動(dòng)子，如香石竹蝕環(huán)病毒(CERV)、花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子、或更特別的是包含兩個(gè)串聯(lián)的CaMV35S啟動(dòng)子(被稱為“雙35S”啟動(dòng)子)的雙重增強(qiáng)的花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是在單子葉要使用組織特異性或發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子代替組成型啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子允許在某些組織中過(guò)表達(dá)而不影響在其它組織中的表達(dá)。[0121]啟動(dòng)子和終止調(diào)節(jié)區(qū)在宿主細(xì)胞中有功能且對(duì)細(xì)胞和基因而言可以是異源的(即，非天然存在的)或同源的(源自植物宿主物種的)。上文描述了可用的合適的啟動(dòng)子。[0122]終止調(diào)節(jié)區(qū)可以源自獲得啟動(dòng)子的基因的3'區(qū)，或源自另一基因?？捎玫暮线m終止區(qū)是本領(lǐng)域熟知的，包括根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)胭脂堿合酶終止子(Tons)、根癌農(nóng)桿菌甘露堿合酶終止子(Tmas)和CaMV35S終止子(T35S)。用于本文的特別優(yōu)選的終止區(qū)包括豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小亞基終止區(qū)(TrbcS)或Tnos終止區(qū)。這些基因構(gòu)建體可以適用于通過(guò)經(jīng)由農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化至宿主植物中并篩選改變的大麻素水平來(lái)針對(duì)活性進(jìn)行篩選。[0123]本發(fā)明的重組表達(dá)構(gòu)建體還可包含可選標(biāo)記物基因，其有助于選擇用本申請(qǐng)的重組分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞?？蛇x標(biāo)記物基因的實(shí)例是編碼蛋白的基因，所述蛋白如賦或免疫球蛋白或其部分(如免疫球蛋白可選地IgG的Fc部分)?？蛇x標(biāo)記物基因的轉(zhuǎn)錄通過(guò)可選標(biāo)記物蛋白(如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或熒火蟲(chóng)熒光素酶)的濃度的改變監(jiān)測(cè)。如果可選標(biāo)記物基因編碼賦予抗生素抗性(如新霉素抗性)的蛋白，則可以用G418選擇轉(zhuǎn)化體細(xì)胞。已經(jīng)引入可選標(biāo)記物基因的細(xì)胞將存活，而其它細(xì)胞死亡。這使得可以觀察并分析本申請(qǐng)的重組表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)，并且特別是測(cè)定突變對(duì)表達(dá)和表型的影響。應(yīng)當(dāng)理解，可將可選標(biāo)記物引入與目標(biāo)核酸的分離的載體上。[0124]核酸分子或其片段可用于阻斷天然產(chǎn)生大麻素化合物的生物體中的大麻素生物合成。使用本文公開(kāi)的核酸分子的沉默可通過(guò)本領(lǐng)域公知的多種方法完成，例如，RNA干擾術(shù)和靶點(diǎn)誘變技術(shù)。[0125]RNAi技術(shù)涉及用RNA干擾(RNAi)質(zhì)粒構(gòu)建體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化(Helliwell和Waterhouse,2005)。此類(lèi)質(zhì)粒包含待沉默的目的基因以反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的片段。反向重復(fù)片段通過(guò)通常為內(nèi)含子的間隔子隔開(kāi)。RNAi構(gòu)建體通過(guò)合適的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子，所述RNAi構(gòu)建體被整合到植物基因組中，隨后轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄使RNA分子自身折回形成雙鏈發(fā)夾RNA。該雙鏈RNA結(jié)構(gòu)可被植物識(shí)別并切割成被稱為小干擾RNA物繼續(xù)指導(dǎo)目的基因的mRNA的降解。[0126]人工微小RNA(amiRNA)技術(shù)利用微小RNA(miRNA)途徑，所述途徑在植物和其它真默基因的約21個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段被引入到pre-miRNA基因中形成pre-amiRNA構(gòu)建體。pre-miRNA構(gòu)建體利用本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)移到生物體基因組中。pre-amiRNA轉(zhuǎn)錄后，加工得到amiRNA,所述amiRNA靶向與該21個(gè)核苷酸的amiRNA序列共有核苷酸同一性的基因。[0127]在RNAi沉默技術(shù)中，有兩個(gè)因素能影響片段長(zhǎng)度的選擇。片段越短越不易達(dá)到有效沉默，但過(guò)長(zhǎng)的發(fā)夾會(huì)增加細(xì)菌宿主菌株中重組的機(jī)會(huì)。沉默的有效性也表現(xiàn)出了基因依賴性并能反映目標(biāo)mRNA的可訪問(wèn)性或目標(biāo)mRNA和基因被激活的細(xì)胞中的hpRNA的相對(duì)豐度。約100至約800bp、優(yōu)選約300至約600bp的片段長(zhǎng)度通常適于使得到的沉默效率最大化。另一個(gè)考慮是待靶向的基因部分?？梢允褂?'UTR、編碼區(qū)和3'UTR片段，得到同樣好的結(jié)果。由于沉默機(jī)制依賴于序列同源性，相關(guān)mRNA序列存在交叉沉默的可能性。這種交叉沉默是不可取的，因此應(yīng)當(dāng)選擇與其它序列有低序列相似性的區(qū)域，如5'或3'UTR。避免同源交叉沉默出現(xiàn)的規(guī)則是使用這樣的序列：所述序列在構(gòu)建體與非目標(biāo)基因序列之間不含超過(guò)約20個(gè)堿基的序列同一性的塊(block)。許多這些同樣的原則適用于設(shè)計(jì)amiRNA目標(biāo)區(qū)域的選擇。[0128]病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)是一種變型的RNAi技術(shù)，它利用了植物的內(nèi)源抗病毒防御性。用包含宿主DNA片段的重組VIGS病毒感染植物導(dǎo)致目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用基于煙草脆裂病毒(TRV)的VIGS系統(tǒng)。[0129]反義技術(shù)涉及向植物中引入反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸與由目的基因產(chǎn)生一序列被稱為“有義”序列。mRNA的有義區(qū)段的活性被反義mRNA區(qū)段阻斷，由此有效地滅活基因表達(dá)。導(dǎo)致植物中基因沉默的反義的應(yīng)用更詳細(xì)地描述于Stam等，2000。[0130]有義共抑制技術(shù)涉及向植物中引入高表達(dá)的有義轉(zhuǎn)基因，其結(jié)果是降低轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源基因的表達(dá)(Depicker等，1997)。效果取決于轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因之間的序列同一性。[0131]靶向誘變技術(shù)，例如TILLING(靶向誘導(dǎo)基因組局部損傷技術(shù))和使用快中子轟擊涉及用誘變劑處理種質(zhì)或單個(gè)細(xì)胞從而產(chǎn)生點(diǎn)突變，然后用靈敏的單核苷酸突變檢測(cè)方法來(lái)發(fā)現(xiàn)目的基因中的點(diǎn)突變。檢測(cè)所需的突變(例如，導(dǎo)致目的基因產(chǎn)物失活的突變)可以通過(guò)例如測(cè)序方法來(lái)完成。例如，可制備源自目的基因的寡核苷酸引物，PCR可用于從誘變種群中的生物體中擴(kuò)增目的基因區(qū)域。可使擴(kuò)增的突變基因與野生型基因退火，以發(fā)現(xiàn)突變基因與野生型基因之間的錯(cuò)配。檢測(cè)到的差異可以追溯到含有該突變基因的生物體，由此揭示哪個(gè)誘變生物體具有所需的表達(dá)(例如，目的基因的沉默)。然后這些生物體可以被選擇性繁殖以產(chǎn)生具有所需表達(dá)的群體。TILLING可以提供包含錯(cuò)義和敲除突變的等位基因系列，這表現(xiàn)為目的基因的表達(dá)降低。TILLING被看作是一種不涉及轉(zhuǎn)基因引入、因此可更易被消費(fèi)者接受的基因敲除可能方法?？熘凶愚Z擊誘導(dǎo)生物體基因組的突變，即“缺失”,[0133]為了便于考察本發(fā)明的各實(shí)施方案，提供以下具體術(shù)語(yǔ)的解釋：[0134]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“約”將被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，并將根據(jù)其使用的上下文而在一定程度上變化。如果存在在其使用的給定上下文中本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不清楚的術(shù)體可以來(lái)自重組來(lái)源和/或在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生。[0136]抗體結(jié)合片段：如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗體結(jié)合片段”旨在包括Fab、Fab’、F(ab’)?、規(guī)技術(shù)將抗體片段化。例如，可通過(guò)用胃蛋白酶處理抗體來(lái)產(chǎn)生F(ab')?片段?？商幚淼玫降腇(ab')?片段以減少二硫橋從而產(chǎn)生Fab’片段。木瓜蛋白酶消化可導(dǎo)致Fab片段的形成。雙特異性抗體片段和其它片段。[0137]抗體可以是單特異性的、雙特異性的、三特異性的或更大的多特異性的。多特異性抗體可以免疫特異性結(jié)合大麻環(huán)萜酚酸合酶的不同表位和/或固定支持材料。[0139]可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備抗體。可采用分離的天然或重組多肽制備抗體。參見(jiàn)，例如，Kohler等，(1975)Nature256:495-497;Kozbor等，(1985)J.Immunol.Methods,81:31-4Cole等，(1984)MolCellBiol.,62Protocols,HumanaPress,Totowa,N.J.,用于制備噬菌粒或B淋巴細(xì)胞免疫球蛋白文庫(kù)以CN107075523B說(shuō)明書(shū)14/28頁(yè)識(shí)別抗體。[0140]密碼子簡(jiǎn)并性：將被理解的是，本發(fā)明涵蓋本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解的密碼子簡(jiǎn)并用法，如表1所示。實(shí)施例8中提供了密碼子優(yōu)化的序列。表1-密碼子簡(jiǎn)并性密碼子起始終止[0143]保守性置換：此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，保守性置換可以發(fā)生在多肽的氨基酸序列中，而不破壞該多肽的結(jié)構(gòu)或功能。技術(shù)人員通過(guò)將氨基酸置換為另一個(gè)具有相似疏水性、極性和R-鏈長(zhǎng)度的氨基酸來(lái)完成保守性氨基酸置換。此外，通過(guò)比較來(lái)自不同物種的同源蛋白的比對(duì)序列，可以通過(guò)定位物種之間已突變的氨基酸殘基且編碼的蛋白質(zhì)的基本功能沒(méi)有改變來(lái)鑒定保守性氨基酸置換。表2提供了保守性置換的示例性列表。氨基酸類(lèi)型可置換的氨基酸Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、脂肪族芳香族[0146]互補(bǔ)的核苷酸序列：序列的“互補(bǔ)的核苷酸序列”理解為表示其核苷酸與本發(fā)明的序列的核苷酸是互補(bǔ)的并且其取向是相反的(反向平行序列)的任何核酸分子。[0147]序列同源性程度或百分比：術(shù)語(yǔ)“序列同源性程度或百分比”是指最佳比對(duì)后兩個(gè)序列之間的序列同一性程度或百分比。序列同一性百分比(或同一性程度)通過(guò)在比較窗口上比較兩條最佳比對(duì)序列來(lái)測(cè)定，其中比較窗口中的肽或多核苷酸序列的部分與用于兩條序列最佳比對(duì)的參考序列(不包含添加或缺失)相比可能含添加或缺失(如，間隔)。百分比如下計(jì)算：測(cè)定在兩條序列中出現(xiàn)相同氨基酸殘基或核酸堿基的位點(diǎn)的數(shù)量從而得到配對(duì)位點(diǎn)的數(shù)量，將配對(duì)位點(diǎn)的數(shù)量除以比較窗口中位點(diǎn)的總數(shù)量，然后將結(jié)果乘以100,得到序列同一性百分比。[0148]融合分子：術(shù)語(yǔ)“融合分子”是指將源自具有大麻環(huán)萜酚酸合酶活性的多肽(SEQIDNO:2或6)的一個(gè)或多個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域的肽序列與融合配偶體連接，并且該連接可以是通過(guò)共價(jià)或非-共價(jià)連接(linkage)的直接或間接連接。該融合配偶體可與源自大麻環(huán)萜酚酸合酶的肽序列(SEQIDNO:2或6)的N-末端或C-末端連接。[0149]同源的分離和/或純化的序列：“同源的分離和/或純化的序列”理解為是指分離和/或純化的序列，所述序列與核苷酸序列的堿基或多肽序列的氨基酸具有至少約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約99.5%、約99.6%、或約99.7%的同一性百分比。該百分比為純統(tǒng)計(jì)學(xué)的，并且可能在兩條核苷酸序列之間隨機(jī)或在其全長(zhǎng)上分布差異。序列的同一性可以通過(guò)，例如，設(shè)計(jì)為執(zhí)行單個(gè)和多重序列比對(duì)的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行測(cè)定。將被理解的是，本發(fā)明涵蓋本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解的密碼子簡(jiǎn)并用法。[0150]此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，保守性置換可以發(fā)生在多肽的氨基酸序列中，而不破壞該多肽的結(jié)構(gòu)或功能。技術(shù)人員通過(guò)將氨基酸置換為另一個(gè)具有相似疏水性、極性和R-鏈長(zhǎng)度的氨基酸來(lái)完成保守性置換。此外，通過(guò)比較來(lái)自不同物種的同源蛋白的比對(duì)序列，可以通過(guò)定位物種之間已突變的氨基酸殘基且編碼的蛋白質(zhì)的基本功能沒(méi)有改變來(lái)鑒定保守性置換。但是沒(méi)有導(dǎo)致增加、減少、調(diào)節(jié)或改變的修飾的相似品種生長(zhǎng)的比較。在一些情況下，其可以為未經(jīng)轉(zhuǎn)化的對(duì)照、經(jīng)假轉(zhuǎn)化的對(duì)照、或經(jīng)載體轉(zhuǎn)化的對(duì)照。所用，術(shù)語(yǔ)“分離的核酸分子”是指當(dāng)通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí)基本上不含細(xì)胞材料或培養(yǎng)基或者當(dāng)通過(guò)化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品的核酸。分離的核酸也基本上不含這樣的序列，該序列天然位于該核酸所來(lái)源的核酸的兩側(cè)(即位于該核酸的5’和3'端的序列)。[0153]體外表達(dá)系統(tǒng)：如本文所用，術(shù)語(yǔ)“體外表達(dá)系統(tǒng)”理解為是指用于重組蛋白表達(dá)的試劑和組分(如在試劑盒中)和/或包含所述試劑和組分的溶液，其中所述體外表達(dá)系統(tǒng)不含細(xì)胞，且可選地包括全細(xì)胞的勝任翻譯的提取物和/或可選地位于溶液中的其它翻譯機(jī)制(machinery)試劑或組分，所述試劑和組分可選地包含RNA聚合酶、一種或多種調(diào)節(jié)蛋白因子、一種或多種轉(zhuǎn)錄因子、核糖體和tRNA,可選地補(bǔ)充有輔因子和核苷酸以及目標(biāo)特異性基因模板。還包括基于化學(xué)品的表達(dá)系統(tǒng)，可選地采用非天然存在的氨基酸。[0154]在一個(gè)實(shí)施方案中，體外表達(dá)系統(tǒng)包含任選地具有5’T7啟動(dòng)子的載體，所述啟動(dòng)子下游引入分離的多核苷酸。[0155]多核苷酸或核酸分子：“多核苷酸或核酸分子”將理解為是指單體和二聚體(所謂串聯(lián))形式的雙鏈或單鏈及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以及互補(bǔ)的核酸序列。多核苷酸和核酸分子包括由天然存在的堿基、糖和糖間(骨架)連接組成的核苷或核苷酸單體的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括含有非-天然存在的單體或其部分的修飾或置換序列。本發(fā)明的核酸序列可以是脫氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA),并且可以包括天然存在的堿基，包括腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。該序列還可包含修飾的堿基。此類(lèi)修飾的堿基的實(shí)例包含氮雜[0156]蛋白或多肽：“蛋白或多肽”理解為是指由核酸分子編碼的氨基酸殘基的序列。在本申請(qǐng)的上下文中，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以包括各種結(jié)構(gòu)形式的一級(jí)蛋白。例如，本發(fā)明的多肽可以是酸性或堿性鹽形式的或中性形式的。此外，可以通過(guò)氧化或還原修飾單個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明的蛋白和多肽還可包括本文描述的與本發(fā)明的蛋白或多肽具有基本相同功能(如具有大麻環(huán)萜酚酸合酶活性)的蛋白和多肽的截短、類(lèi)似物和同源物。[0157]序列同一性：當(dāng)兩條序列中的氨基酸或核苷酸殘基的序列如下文所述進(jìn)行最大匹配度比對(duì)時(shí)兩者相同，則兩條氨基酸或核苷酸序列被稱為“同一的”。兩個(gè)(或更多個(gè))肽或多核苷酸之間的序列比較通常通過(guò)以下方式實(shí)施：在區(qū)段或“比較窗口”上比較兩個(gè)最佳比對(duì)序列的序列以鑒定和比較具有序列相似性的局部區(qū)域。用于比較的序列的最佳比對(duì)可通過(guò)Smith和WatermanAd.App.Math2:482(1981)的局部同源性算法、Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比對(duì)算法、Pearson和Lipman,Proc.Nat1.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444(1988)的相似性檢索法、這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)現(xiàn)(WisconsinGenetics[0158]上述給出的序列同一性的定義是本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的定義。定義本身無(wú)需任何算法的幫助，所述算法只有在得到序列最佳比對(duì)時(shí)有幫助，而不是在序列同一性的計(jì)算中有幫助。[0159]從上述給出的定義，可以得出兩個(gè)比較序列之間的序列同一性僅有一個(gè)準(zhǔn)確定義且唯一的值，該值與最佳或最適比對(duì)序列得到的值相對(duì)應(yīng)。500個(gè)連續(xù)殘基的核酸或氨基酸序列，例如包含SEQIDNO:1的多達(dá)約3個(gè)、約5個(gè)、約10個(gè)、[0161]嚴(yán)格雜交：在嚴(yán)格條件下與核苷酸序列雜交理解為表示在選擇的溫度和離子強(qiáng)度的條件下雜交，所述條件使得它們?cè)试S在兩個(gè)互補(bǔ)的核酸分子片段之間維持雜交。從其他生物體(例如，植物)獲得的本文所述CBCAS的同系物可通過(guò)篩選包括所述同系物的合適文庫(kù)獲得，其中所述篩選采用本文公開(kāi)的特定CBCAS基因的核苷酸序列或其部分或探針進(jìn)行，可能技術(shù)將核酸(如構(gòu)建體)引入細(xì)胞。[0163]當(dāng)單鏈核酸分子基于鳥(niǎo)嘌呤(G)與胞嘧啶(C)堿基配對(duì)和腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)堿基配對(duì)的能力，能與其它的核酸分子的全部或部分堿基配對(duì)(雜交)以形成雙螺旋(雙鏈核酸分子)時(shí)，該單鏈核酸分子與另[0164]在對(duì)本發(fā)明范圍的理解中，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“包含”及其衍生詞旨在為開(kāi)放式術(shù)是指所修飾術(shù)語(yǔ)的使得最終結(jié)果不會(huì)顯著改變的合理偏差量。如果這種偏差并不會(huì)否定程度術(shù)語(yǔ)所修飾的詞的含義，這些程度術(shù)語(yǔ)應(yīng)視為包括所修飾術(shù)語(yǔ)至少±10%的偏差。[0165]在對(duì)本發(fā)明范圍的理解中，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“由…組成”及其衍生詞旨在為封閉[0166]本文中通過(guò)端點(diǎn)表述的數(shù)值范圍包括在該范圍內(nèi)包含的所有數(shù)字和分?jǐn)?shù)(例如，另有明確規(guī)定。[0167]此外，在特定部分中描述的定義和實(shí)施方案旨在適用于它們適合的本文中描述的其它實(shí)施方案，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的。例如，在下面的段落中，將更詳細(xì)地限定本發(fā)明的不同方面。這樣限定的每個(gè)方面可以與任何其它一個(gè)或多個(gè)方面組合，除非有明確的相反指示。特別地，指示為優(yōu)選或有利的任何特征可以與指示為優(yōu)選或有利的任何其他一個(gè)或多個(gè)特征組合。以上公開(kāi)內(nèi)容概括地描述了本申請(qǐng)。更完整的理解可以通過(guò)參考下列具體實(shí)例獲得。這些實(shí)例僅僅描述為用于說(shuō)明的目的，而不是意在限制本申請(qǐng)的范圍。形式變化和等同物替代被認(rèn)為是可能建議或提出權(quán)宜之計(jì)的情況。盡管本文中已使用了特定術(shù)語(yǔ)，但是這些術(shù)語(yǔ)意在以描述性的意義存在，而不是為了限制目的。[0168]本文參考的所有公眾可得到的文獻(xiàn)，包括但不限于美國(guó)專利，以參考形式明確引入本文。[0169]以下非限制性實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明：[0171]實(shí)施例1:大麻基因組中CBCA合酶的鑒定相似性的基因。這導(dǎo)致了與THCA合酶具有96%核苷酸相似性的基因的鑒定。根據(jù)隨后的生化表征，作者將該基因命名為大麻大麻環(huán)萜酚酸合酶(CBCAS)。[0173]SEQIDNO:1提供了大麻大麻環(huán)萜酚酸合酶(CBCAS)的cDNA序列-1635bp。下劃線的序列涉及SEQIDNO:5中缺失的序列。SEQIDNO:1可包含全序列或缺失下劃線序列中的3個(gè)重復(fù)和/或第一個(gè)ATG以維持編碼框。CN107075523B說(shuō)明書(shū)19/28頁(yè)[0174]ATGAATTGCTCAACATTCTCCTTTTGGTTTGTTTGCAAACAAATTTCAATAGCTAATCCTCAAAATTCATATACACTCAACCTGATACAACCCCAAAACCACTCGTTATTGTCACTCCTTCAAATGTCTCCCATATCCAGGGAGCTACCCTTGGAGAAGTTTATTATTGGATCAATGAGATGAGACTACAGTACATGGTTACTTCTCTTCCATTTTTCTTGGTGGAGTGGATAGTCTAGTTGACTTGATACTGGGTTCGAAGTGTTTATAATTTCACA[0175]SEQIDNO:2提供了大麻大麻環(huán)萜酚酸合酶(CBCAS)的開(kāi)放閱讀框的相應(yīng)氨基酸[0176]MNCSTFSFWFVCKIIFFFLSFNIQISIANPQENFLKCFSEYIPNNPANPKFIYTQHNLRFTSDTTPKPLVIVTPSNVSHIQASILCSKKVGLQIRTRSGGHDAEGLSYISQVPFAIVDLRNMHTVKVDIEDLFWAIRGGGGENFGIIAACKIKLVVVPSKATIFSVKKNMEIHGLVKLFNKWQNIAYKYDKDLMLTNHGKNKTTVHGYFSSIFLGGVDSLVDLMNKSFPELGIKKTDCKELSWIDTTIFYSGVVNYNTANFKKEILLDRSAKTAFSIKLDYVKKLIPETAMVKILEKLYEEEVGVGMYVLYPYGGIMDEISESAIPFPHRAGIMYELWYNEKHINWVRSVYNFTTPYVSQNPRLAYLNYRDLDLGKTNPESPNNYTQARIWGEKYFGKNFNRLVKVKTKADPTCATGGTACCCCATGATGACGCGGTGGAAGA-3'(SEQIDNO:4)從大麻基因組DNA片段中擴(kuò)增性酶切割并去磷酸化的IPICzaC(Invitrogen)。將完整CBCA合酶編碼序列，包括天然N-末端分泌信號(hào)，用于畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建中。[0179]該酶表達(dá)為N-末端融合產(chǎn)物，其中載體編碼α-因子信號(hào)肽以確保從畢赤酵母細(xì)胞中的蛋白分泌。通過(guò)電穿孔將IPICzaC:CBCAS轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母菌株X33(Invitrogen)中。選擇腐草霉素抗性菌落并在最少甲醇平板上劃線，從中挑取單個(gè)菌落，并用于接種50mL×10-5%生物素、1%甘油),生長(zhǎng)兩天。使用近20mL該培養(yǎng)物接種400mL修飾的BMMY培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、50mMHEPESpH7、1.34%酵母氮源基礎(chǔ)、4×10?5%生物素、1%甲醇、0.0001%核黃素)至近似初始0D600為1。使該培養(yǎng)物在20℃下以90RPM振蕩生長(zhǎng)4天。每24小時(shí)加入甲醇至終濃度為1%。4天后，通過(guò)離心(13kg20分鐘)將細(xì)胞從培養(yǎng)基中pH7的10mM磷酸鈉平衡的羥基磷灰石筒(BioRadBio-ScaleMiniCHTType1,40μm介?kta,AmershamBioscience[0180]實(shí)施例3:CBCAS分析[0181]通過(guò)將10μmolCBGA在500μ1澄清培養(yǎng)基中溫育14小時(shí)來(lái)進(jìn)行采用培養(yǎng)基的反應(yīng)。用一滴4NHC1酸化并用400μL乙腈萃取兩次。離心后，合并有機(jī)相并蒸發(fā)至干。將產(chǎn)物重懸于20μL的50%甲醇中，其中10μL用LCMS分析。使用采用二元溶劑系統(tǒng)(溶劑A:10%乙腈、0.05%甲酸；溶劑B:99.95%乙腈、0.05%甲酸)的WatersAllianceHPLC和AscnetisC185%A,在5%A保持2.5分鐘，在2分鐘內(nèi)返回初始條件并在初始條件下平衡7分鐘。使用在200-350nm下的光電二極管陣列檢測(cè)獲得紫外光譜。[0182]如圖2所示，重組CBCAS催化由CBGA形成CBCA。如圖3所示，在用內(nèi)切糖苷酶(Endo時(shí)的活性，在40℃時(shí)觀察到最大活性。[0184]本發(fā)明的基因編碼來(lái)自大麻的CBCAS酶。這些基因可以通過(guò)重組植物的育種、靶向誘變或基因工程產(chǎn)生大麻素產(chǎn)量提高的大麻植物。此外，使大麻中的該基因失活或沉默可用于阻斷大麻素生物合成，由此降低大麻植物(例如工業(yè)大麻)中大麻素如CBCA(CBC的前體)的產(chǎn)量。該基因可與編碼大麻素途徑中其它酶的基因聯(lián)合用于其它植物或微生物中的大麻素生物合成的工程化。[0185]實(shí)施例4[0186]缺少預(yù)測(cè)的信號(hào)序列并包含起始密碼子/起始甲硫氨酸的重組序列CN107075523B說(shuō)明書(shū)21/28頁(yè)[0189]SEQIDNO:6-破折號(hào)表示缺失的序列[0190]MNPQENFLKCFSEYIPNNPANPKFIYTQHDQLYMSVLQNLRFTSDTTPKPLVIVTPSNVSHIQASILCSKKVGLQIRTRSGGHDAEGLSYISQVPFAIVDL[0192]預(yù)測(cè)的N末端信號(hào)肽：[0193]MNCSTFSFWFVCKIIFFFLSFNIQISIA[0194]實(shí)施例5[0196]大腸桿菌優(yōu)化的序列CN107075523B說(shuō)明書(shū)22/28頁(yè)TTTAACATTCAGATTAGTATTGCAAACCCGCAGGAGAACTTTCTCAAATGTTTTTATATCCCGAACAACCCGGCATGAGCGTATTGAACAGCACCATCCTCTGGTCATCGTTACGCCCTCGAATGTTTCACATATCCAAAAAGGTCGGCCTGCAGATTCGCACACGGTCGGGCGGCCAGGTCTGTCTTACATCTCACAAGTCCCAGTATATTACTGGATTAACGAAACCGTAGGTGTGGGCGGTCATTTTTCCGGAGGCGGTTATGGTGCGTTAAGGATCGCAAATCAATGGGTGAAGACCTCTTAAGCGACCATCTTTAGCGTGAAAAAAAAACAAATGGCAGAACATCGCTTACAAAGTAGTATCTTCCTGGGTGGAGTCGATTCCCT