(19)國家知識產(chǎn)權(quán)局(12)發(fā)明專利(10)授權(quán)公告號CN109963941B(65)同一申請的已公布的文獻(xiàn)號(43)申請公布日2019.07.02(30)優(yōu)先權(quán)數(shù)據(jù)(85)PCT國際申請進(jìn)入國家階段日(86)PCT國際申請的申請數(shù)據(jù)(87)PCT國際申請的公布數(shù)據(jù)WO2018/057385EN20(73)專利權(quán)人22世紀(jì)公司地址美國紐約(74)專利代理機(jī)構(gòu)北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11245專利代理師張全信董志勇US2016177404A1,2016.WO2016030828A1,2016.03.03邱澤生等.《基因工程》.首都師范大學(xué)出版社，1993,第138-140頁.張雪榮等.植物腺體的萜類代謝工程.《生物技術(shù)通報(bào)》.2007,第49-51頁.Genome.《PlantCell》.2014,第26卷(第8期),第3272-3285頁.審查員陳永強(qiáng)(54)發(fā)明名稱用于操縱腺毛中的大麻素和其他化合物的毛狀體特異性啟動(dòng)子本技術(shù)提供了來自大麻的大麻素生物合成酶基因的毛狀體特異性啟動(dòng)子、該毛狀體特異性啟動(dòng)子的核苷酸序列以及該啟動(dòng)子用于調(diào)節(jié)生物體中大麻素和其他化合物的產(chǎn)生的用途。本技術(shù)還提供包含毛狀體特異性啟動(dòng)子的嵌合基因、載體、以及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和生物體，其包括植物細(xì)2在SEQIDNO:1-3中任一個(gè)中列出的核苷酸序列；并且其中所述核苷酸序列與異源核酸可操作地連接。2.一種表達(dá)載體，其包含與編碼多肽的一種或多種核酸序列可操作地連接的權(quán)利要求1所述的DNA分子。3.一種用于工程化宿主細(xì)胞的方法，其中所述宿主細(xì)胞被遺傳工程化以包含權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體。4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述細(xì)胞是大麻細(xì)胞。5.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述細(xì)胞是煙草細(xì)胞。6.一種用于工程化植物的方法，其中所述植物被遺傳工程化，以包含含有嵌合核酸構(gòu)建體的細(xì)胞，所述嵌合核酸構(gòu)建體包含權(quán)利要求1所述的合成DNA分子。7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述植物是煙草植物。8.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述植物是大麻植物。9.一種用于工程化種子的方法，其中所述種子獲得自權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的植物，其中所述種子包括所述嵌合核酸構(gòu)建體。10.一種用于工程化植物或植物細(xì)胞的方法，其中所述植物或植物細(xì)胞被遺傳工程化以包含整合到其基因組中的嵌合基因，所述嵌合基因包含與同源或異源核酸序列可操作地連接的毛狀體特異性啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子選自：SEQIDNO:1-3中任一個(gè)的核苷酸序列。11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述植物是煙草植物。12.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述植物是大麻植物。13.一種用于表達(dá)植物毛狀體中的多肽的方法，其包括：(a)將包括核苷酸序列的表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，所述核苷酸序列選自：在SEQIDNO:1-3中任一個(gè)中列出的核苷酸序列；其中所述核苷酸序列可操作地連接至編碼多肽的一種或多種核酸序列；和(b)在允許所述多肽表達(dá)的條件下使所述植物生長。14.一種用于增加宿主植物毛狀體中的大麻素的方法，其包括(a)將包括核苷酸序列的表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，所述核苷酸序列選自：在SEQIDNO:1-3中任一個(gè)中列出的核苷酸序列；其中所述核苷酸序列可操作地連接至編碼大麻素生物合成途徑的酶的一種或多種核(b)在允許所述大麻素生物合成途徑酶表達(dá)的條件下使所述植物生長；其中所述大麻素生物合成途徑酶的表達(dá)導(dǎo)致所述植物相對于對照植物具有增加的大麻素含量。15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述大麻素生物合成途徑酶是大麻二酚酸(CBDA)合16.權(quán)利要求15所述的方法，進(jìn)一步包括給所述植物提供大麻萜酚酸(CBGA)。17.一種用于工程化植物的方法，其中所述植物是通過權(quán)利要求14所述的方法產(chǎn)生的遺傳工程化植物，其中所述植物相對于對照植物具有增加的△?-四氫大麻酚(THC)、大麻色3原烯(CBC)和/或大麻二酚(CBD)含量。4[0001]相關(guān)申請的交叉引用[0002]本申請要求2016年9月20日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?2/397,212的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容在此通過引用以其全部并入。技術(shù)領(lǐng)域[0003]一般而言，本技術(shù)涉及來自大麻的大麻素生物合成酶基因的毛狀體特異性啟動(dòng)子，該毛狀體特異性啟動(dòng)子的核苷酸序列，以及該啟動(dòng)子用于調(diào)節(jié)大麻素產(chǎn)生或用于調(diào)節(jié)生物體中生物化學(xué)物質(zhì)的其他毛狀體特異性產(chǎn)生的用途。本技術(shù)還涉及包含毛狀體特異性啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和生物體，其包括植物細(xì)胞和植物。背景技術(shù)[0004]提供下面的描述以有助于讀者理解。提供的信息或引用的參考文獻(xiàn)都不被承認(rèn)是現(xiàn)有技術(shù)。[0005]植物毛狀體是表皮突起，其包括分枝和未分枝的毛、囊泡、鉤、刺和螫毛——覆蓋毛和非腺毛)的能力來區(qū)分。非腺毛表現(xiàn)出低代謝活性并且主要通過物理手段為植物提供保護(hù)。相比之下，存在于許多植物物種(包括一些茄科物種(例如煙草、番茄)和大麻)的葉子上的腺毛具有高度代謝活性并積累代謝物，其可占葉干重的多達(dá)10-15%(Wagneretal.,Ann.Bot.93:3-11(2004))。腺毛能夠分泌(或儲(chǔ)存)次級代謝物作為防御機(jī)制。[0006]大麻(CannabissativaL.)(大麻(cannabis)、大麻(hemp)、大麻(marijuana))一種已經(jīng)栽培了數(shù)千年的一年生草本植物，其含有一組獨(dú)特的次級代謝物，稱為大麻素，其構(gòu)成一組單萜基團(tuán)分子(terpenophenolics)。大麻素主要在腺毛中合成并積累，所述腺毛在雌花上以高密度存在并且在大麻植物的雄花上以較低密度存在。大麻素在毛狀體貯藏腔中的積累對植物有益，因?yàn)橐阎舐樗貙ζ渌参锛?xì)胞具有細(xì)胞毒性，并已顯示在大麻和煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物二者中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Sirikantaramasetal.,PlantCellPhysiol.46:1578-1582(2005))。大麻素通過三步生物合成過程形成：聚酮化合物形成、芳香族異戊二烯化和環(huán)化(圖1)。大麻素途徑由己?；?CoA提供，所述己?；?CoA的形成由己酰基-CoA合成酶催化。大麻素生物合成中的第一個(gè)酶促步驟是由四酮體(tetraketide)合成酶(TKS)(稱為橄欖醇酸(olivetolicacid)合成酶(OLS1))形成3,5,7-三氧代癸酰-CoA。大麻素生物合成中的第二個(gè)酶促步驟是通過橄欖醇酸環(huán)化酶(OAC)形成橄欖醇酸。下一步是通過芳香族異戊烯轉(zhuǎn)移酶使橄欖醇酸異戊二烯化形成大麻萜酚酸(CBGA)。CBGA是不同主要種類的大麻素生物合成的中心分支點(diǎn)中間體。CBGA的異戊二烯基側(cè)鏈的可選環(huán)化產(chǎn)生隨后在儲(chǔ)存或吸煙(smoking)期間通過非酶促反應(yīng)脫羧，以分別產(chǎn)生△?-四氫大麻酚(THC)5[0007]大麻素是有價(jià)值的植物來源的天然產(chǎn)物。大麻制品，如大麻和麻藥，因?yàn)樗鼈儽娝苤木窕钚宰饔靡呀?jīng)使用了幾個(gè)世紀(jì)。大麻素因其通過哺乳動(dòng)物大麻素受體起作用的能力而引起了對醫(yī)學(xué)應(yīng)用的新興趣。主要的大麻素包括△?-四氫大麻酚(THC)——負(fù)責(zé)大麻消耗的精神活性和治療作用的化合物；和大麻二酚(CBD),其具有神經(jīng)保護(hù)特性。(Gaoni&Mechoulam,J.Am.Chem.Soc.86:1646-1647(1964);MechoulamJ.Clin.Pharmacol.42:11S-19S(2002))。THCA是大麻的藥物品種中的主要大麻素，而CBDA是纖維或種子生長的大麻形式的主導(dǎo)大麻素。目前正在研究大麻素用于治療目的，包括治療慢性疼痛、惡心，控制患有多發(fā)性硬化或癲癇的患者的痙攣狀態(tài)和震顫，以及治療關(guān)節(jié)炎。在毛狀體中引導(dǎo)大麻素生成的可能性避免了對植物代謝途徑和性能的干擾。因此，需要鑒定毛狀體特異性啟動(dòng)子以調(diào)節(jié)生物體——包括轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及其衍生物——中大麻素的合成，其允許特異性地在毛狀體中靶向基因表達(dá)。發(fā)明內(nèi)容[0008]本文公開了毛狀體特異性啟動(dòng)子和這些啟動(dòng)子用于引導(dǎo)編碼核酸序列在植物毛狀體中表達(dá)的用途。苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列，并且其編碼具有植物毛狀體腺(trichomegland)特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子，和其中所述核苷酸序列與異源核酸可操作地連接。[0010]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了表達(dá)載體，其包含與編碼多肽的一種或多種核酸序列可操作地連接的合成DNA分子。[0011]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了包含表達(dá)載體的遺傳工程化宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，遺傳工程化宿主細(xì)胞是大麻細(xì)胞(Cannabissativacell)。在一些實(shí)施方式中，遺傳工程化宿主細(xì)胞是煙草細(xì)胞(Nicotianatabacumcell)。[0012]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了遺傳工程化植物，其包含含有嵌合核酸構(gòu)建體的細(xì)胞，所述嵌合核酸構(gòu)建體包含合成DNA分子。在一些實(shí)施方式中，遺傳工程化植物屬于茄科。在一些實(shí)施方式中，工程化茄科植物是煙草植物。在一些實(shí)施方式中，遺傳工程化植物屬于大麻科。在一些實(shí)施方式中，工程化大麻科植物是大麻植物。在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供來自遺傳工程化植物的種子，其中種子包含嵌合核酸構(gòu)建體。[0013]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:1中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有與SEQIDNO:1的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0014]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:2中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有與SEQIDNO:2的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0015]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:3中列出的核苷酸序6列的合成DNA分子。在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有與SEQIDNO:3的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0016]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:5中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有與SEQIDNO:5的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0017]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:6中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有與SEQIDNO:6的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0018]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:8中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有與SEQIDNO:8的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0019]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:9中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有與SEQIDNO:9的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0020]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:11中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有與SEQIDNO:11的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0021]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:12中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有與SEQIDNO:12的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0022]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:13中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有與SEQIDNO:13的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0023]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:14中列出的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0024]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:16中列出的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。7[0025]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:17中列出的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0026]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:18中列出的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0027]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:19中列出的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0028]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:21中列出的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0029]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:22中列出的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0030]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:23中列出的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0031]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:24中列出的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0032]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:25中列出的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0033]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:26中列出的核苷酸序列的合成DNA分子。在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有與SEQIDNO:26的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0034]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:28中列出的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)8錄活性的啟動(dòng)子。[0035]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:29中列出的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0036]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:31中列出的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0037]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:32中列出的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0038]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了具有如在SEQIDNO:33中列出的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列的合成DNA分子，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0039]在一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了遺傳工程化植物或植物細(xì)胞，其包含整合到其基因組中的嵌合基因，該嵌合基因包含與同源或異源核酸序列可操作地連接的毛狀體特異性31-33中任一個(gè)的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。[0040]在一些實(shí)施方式中，遺傳工程化植物或植物細(xì)胞屬于茄科。在一些實(shí)施方式中，茄科植物是煙草。在一些實(shí)施方式中，遺傳工程化植物屬于大麻科。在一些實(shí)施方式中，工程化大麻科植物是大麻。[0041]在一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了用于在植物毛狀體中表達(dá)多肽的方法，其包括(a)將包括如此核苷酸序列的表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，所述核苷酸序列選自：(i)在SEQIDNO:約80%同一的核苷酸序列，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子；其中(i)或(ii)的核酸序列可操作地連接至編碼多肽的一種或多種核酸序列；和(b)在允許多肽表達(dá)的條件下使植物生長。[0042]在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了用于增加宿主植物毛狀體中的大麻素的方法，其包括(i)將包括如此核苷酸序列的表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，所述核苷酸序列選自：(a)在酸序列至少約80%同一的核苷酸序列，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子；其中(i)或(ii)的核酸序列可操作地連接至編碼大麻素生物合成途徑的酶的一種或9多種核酸序列；和(b)在允許大麻素生物合成途徑酶表達(dá)的條件下使植物生長；其中大麻素生物合成途徑酶的表達(dá)導(dǎo)致相對于在類似條件下生長的對照植物具有增加的大麻素含量。[0043]在該方法的一些實(shí)施方式中，大麻素生物合成途徑酶是大麻二酚酸(CBDA)合成酶、大麻色烯酸(CBCA)合成酶或△?四氫大麻酚酸(THCA)合成酶。[0044]在一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括給植物提供大麻萜酚酸(CBGA)。[0045]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了用于產(chǎn)生遺傳工程化植物的方法，所述遺傳工程化植物相對于對照植物具有增加的△?-四氫大麻酚(THC)、大麻色原烯(CBC)和/或大麻二酚(CBD)含量。[0046]本文描述和要求保護(hù)的技術(shù)具有許多屬性和實(shí)施方式，其包括但不限于本發(fā)明內(nèi)容中闡述或描述或引用的那些。其并非旨在包括所有內(nèi)容，并且本文描述和要求保護(hù)的發(fā)明不限于本發(fā)明內(nèi)容中標(biāo)識的特征或?qū)嵤┓绞交虮黄湎拗?，包括其僅出于說明的目的而不是限制的目的?？梢栽谙旅娴木唧w實(shí)施方式中公開另外的實(shí)施方式。[0047]在一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了包括核苷酸序列的合成DNA分子，所述核苷酸序列32或33中任一個(gè)的核苷酸序列至少約80%同一的核苷酸序列，并且其編碼具有植物毛狀體腺特異性轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子，其中核苷酸序列可操作地連接至異源核酸。[0048]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了表達(dá)載體，其包含與編碼多肽的一種或多種核酸序列可操作地連接的合成DNA分子。[0049]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了包含表達(dá)載體的遺傳工程化宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，遺傳工程化宿主細(xì)胞是大麻細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，遺傳工程化宿主細(xì)胞是煙草細(xì)胞。[0050]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了遺傳工程化植物，其包含含有嵌合核酸構(gòu)建體的細(xì)胞，所述嵌合核酸構(gòu)建體包含合成DNA分子。在一些實(shí)施方式中，工程化植物是煙[0051]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了來自5的任一種的工程化植物的種子，其中所述種子包括嵌合核酸構(gòu)建體。[0052]在一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了包括如在SEQIDNO:33中列出的核苷酸序列的合[0053]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了表達(dá)載體，其包含與編碼多肽的一種或多種核酸序列可操作地連接的合成DNA分子。[0054]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了包含表達(dá)載體的遺傳工程化宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，遺傳工程化宿主細(xì)胞是大麻細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，遺傳工程化宿主細(xì)胞是煙草細(xì)胞。[0055]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了遺傳工程化植物，其包含含有嵌合核酸構(gòu)建體的細(xì)胞，所述嵌合核酸構(gòu)建體包含合成DNA分子。在一些實(shí)施方式中，工程化植物是煙[0056]在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容提供了來自工程化植物的種子，其中種子包含嵌合核酸構(gòu)建體。附圖說明[0057]圖1描繪導(dǎo)致大麻中主要大麻素△?-四氫大麻酚酸(THCA)和大麻二酚酸(CBDA)形成的大麻素生物合成途徑。[0058]圖2A-2B顯示了本文所述實(shí)驗(yàn)中使用的啟動(dòng)子：報(bào)道基因設(shè)計(jì)。每個(gè)啟動(dòng)子與GUS報(bào)道基因融合，并且染色后通過藍(lán)色指示啟動(dòng)子活性(圖2A)。圖2B是煙草毛狀體中大麻素生物合成酶基因啟動(dòng)子的毛狀體特異性表達(dá)的完整葉視圖。顯示了代表性啟動(dòng)子(CBDA合成酶20800基因啟動(dòng)子)的結(jié)果。來自大麻素生物合成途徑中的其他啟動(dòng)子的結(jié)果是定性相同的(未顯示)。圖2B顯示報(bào)道基因的表達(dá)局限于毛狀體。[0059]圖3顯示來自煙草毛狀體中完整大麻素生物合成途徑的啟動(dòng)子的毛狀體特異性表達(dá)。由GUS報(bào)道基因的活性引起的藍(lán)色表示啟動(dòng)子活性。來自該途徑中每個(gè)基因的代表性啟動(dòng)子顯示毛狀體特異性表達(dá)，并且因此來自該途徑中基因的所有啟動(dòng)子將引導(dǎo)在毛狀體中的表達(dá)。[0060]圖4A顯示本技術(shù)的4x大麻素On(CANON)片段合成啟動(dòng)子的設(shè)計(jì)。圖4B顯示本技術(shù)的4xCANON片段合成啟動(dòng)子的毛狀體特異性表達(dá)。合成啟動(dòng)子的活性由GUS報(bào)道基因活性引起的藍(lán)色指示。具體實(shí)施方式[0061]I.介紹[0062]本技術(shù)涉及發(fā)現(xiàn)參與大麻素生物合成途徑的酶的二十三種毛狀體特異性啟動(dòng)子的核酸序列：(1)橄欖醇(olivetol)合成酶(OLS;也稱為四酮體合成酶)啟動(dòng)子；(2)OLS1啟合成酶(AAE1-1’)啟動(dòng)子；(10)己?；?CoA合成酶(AAE3)啟動(dòng)子；(11)己?；?CoA合成酶[0063]已經(jīng)確定了每種啟動(dòng)子的核酸序列。(i)橄欖醇合成酶(OLS)啟動(dòng)子、(ii)OLS1啟動(dòng)子和(iii)OLS2啟動(dòng)子的核酸序列分別在SEQIDNO:1、2和3中列出，并且OLS的開放閱讀族異戊烯轉(zhuǎn)移酶(PT)啟動(dòng)子的核酸序列在SEQIDNO:8中列出，PT1啟動(dòng)子的核酸序列在和(iv)己?；?CoA合成酶(AAE12)啟(ii)CBDAS合成酶1(CBDAS1)啟動(dòng)子、(iii)CBDA合成酶(CBDAS)20800啟動(dòng)子和(iv)CBDA合11合成酶(CBDAS)的ORF的核酸序列在SEQIDNO:2THCA合成酶(THCAS)50320’啟動(dòng)子、(v)THCA合成酶(THCAS)1330啟動(dòng)子和(vi)THCA合成酶(THCAS)1330’啟動(dòng)子的核酸序列分別在SEQIDNO:21、22、23、24、25和26中列出，并且[0064]本技術(shù)還涉及發(fā)現(xiàn)足以引導(dǎo)毛狀體特異性表達(dá)的“大麻素On”或“CANON”啟動(dòng)子片段的核酸序列。足以在腺毛中引導(dǎo)毛狀體特異性表達(dá)的CANON片段的核酸序列在SEQIDNO:31中列出。包括共有CANON片段的四個(gè)拷貝的4xCANON片段合成啟動(dòng)子的核酸序列在[0065]鑒于大麻素如THC對植物細(xì)胞的已知細(xì)胞毒性作用，在強(qiáng)的遍在啟動(dòng)子如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S下驅(qū)動(dòng)其產(chǎn)生的基因的表達(dá)可能導(dǎo)致整個(gè)植物中代謝途徑的擾動(dòng)并且可能對植物發(fā)育和生理學(xué)具有有害后果。因此，毛狀體作為與植物其余部分具有有限通信的獨(dú)特實(shí)體，代表了代謝工程化的潛在目標(biāo)。[0066]因此，在一些實(shí)施方式中，本技術(shù)提供來自大麻素生物合成基因或其生物活性片段的先前未發(fā)現(xiàn)的毛狀體特異性啟動(dòng)子，其可用于遺傳操縱宿主植物中大麻素(例如，THC、植物科和種。[0067]II.定義[0068]本說明書中使用的所有技術(shù)術(shù)語在生物化學(xué)、分子生物學(xué)和農(nóng)業(yè)中通常使用；因此，本技術(shù)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解它們。那些技術(shù)術(shù)語可以在例如以下中發(fā)現(xiàn)：MolecularCloning:ALaboratoryManual3rded.,vol.1-3(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,2001);CurrentProtocolsInMolecularBiology,ed.Ausubel等人(GreenePublishandWiley-Interscience,NewYork,1988)(包括定期更新);ShortProtocolsInMolecularBiology:ACompendiumOfMethodsFromCurrentProtocolsInMolecularBiology5thed.,vol.1-2,ed.Ausubel等人(JohnWileyAnalysis:ALaboratoryManual,vol.1-2,ed.GreLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1997)。涉及植物生物學(xué)技術(shù)的方法在此處描述，并且也在論文比如MethodsInPlantMolecularBiology:ALabManual,ed.Maliga等人(ColdSpringHarborLaboratoryN.Y.,1995)中詳細(xì)描述。[0069]“嵌合核酸”包含與核苷酸序列連接的編碼序列或天然存在編碼序列的細(xì)胞中與其相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列。[0070]術(shù)語“編碼(encoding)”和“編碼(coding)”是指基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制向細(xì)胞提供信息的過程，從該細(xì)胞可以將一系列氨基酸組裝成特定的氨基酸序列以產(chǎn)生活性酶。由于遺傳密碼的簡并性，DNA序列中的某些堿基變化不會(huì)改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列。的。它是指存在于待遺傳工程化的植物或生物體的基因組中的核酸、基因、多核苷酸、DNA、種外源核酸可以是在其所引入的細(xì)胞中天然發(fā)現(xiàn)的序列的拷貝或其片段。[0073]如本文所用，“表達(dá)”表示通過基因的轉(zhuǎn)錄或由核苷酸序列編碼的多肽產(chǎn)物的產(chǎn)生了細(xì)胞或植物——包括其衍生的所有后代植物——中特定基因序列或其變體的表達(dá)。[0074]“遺傳工程化”包括用于將核酸或特定突變引入宿主生物體的任何用抑制基因表達(dá)的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化植物時(shí)——使得與對照植物相比靶基因的表達(dá)降低，植物或植物細(xì)胞可以是任何天然方法的產(chǎn)物(即，不涉及外源核苷酸序列)——通過僅引入源自宿主植物物種或性相容的植物物種的核酸序列實(shí)施。參見，例如，美國專利申請?zhí)朳0075]“異源核酸”或“同源核酸”是指核酸或氨基酸序列與其宿關(guān)系，尤其是在轉(zhuǎn)基因生物體的背景下。在宿主物種中天然存在同源序列(例如，用大麻基因轉(zhuǎn)化的大麻植物),而在宿主細(xì)胞中不天然存在異源序列(例如，用來自大麻植物的序列轉(zhuǎn)化的煙草植物)。此類異源核酸可包含片段，所述片段是天然存在于其所引入的細(xì)胞中的祖先序列的后代的序列(例如，它們可以是直向同源物)。飾的相似條件下生長的類似品種、品系或細(xì)胞的比較。在一些情況下，這可以是非轉(zhuǎn)化的對照、模擬轉(zhuǎn)化的對照或載體轉(zhuǎn)化的對照。本技術(shù)的目的，認(rèn)為DNA構(gòu)建體中包含的重組DNA分子是分離的。分離的DNA分子的進(jìn)一步實(shí)例包括維持在異源宿主細(xì)胞中的重組DNA分子或在溶液中部分或基本純化的DNA分子。分離成產(chǎn)生的這種分子。實(shí)施方式中，提供了轉(zhuǎn)基因組織培養(yǎng)物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞培養(yǎng)物，其中轉(zhuǎn)基因組織或細(xì)胞培養(yǎng)物包含本技術(shù)的核酸分子。合以起始轉(zhuǎn)錄?！敖M成型啟動(dòng)子”是在植物的整個(gè)壽命期間和在大多數(shù)環(huán)境條件下具有活性的啟動(dòng)子。組織特異性、組織優(yōu)選的、細(xì)胞類型特異性和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子構(gòu)成一類“非組成型導(dǎo)毛狀體組織中可操作地連接基因的表達(dá)的啟動(dòng)子。“可操作地連接”是指啟動(dòng)子和第二序列之間的功能性連接，其中啟動(dòng)子序列起始和介導(dǎo)對應(yīng)于第二序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。通[0081]在兩個(gè)多核苷酸(核酸)或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”包括提及當(dāng)在特定區(qū)內(nèi)對齊以獲得最大對應(yīng)性時(shí)，兩個(gè)序列中相同的殘基。當(dāng)使用序列同一性百分比提及蛋白質(zhì)時(shí)，認(rèn)識到不同一的殘基位置的差異通常在于保守氨基酸置換，其中氨基酸殘基被其他具有類似化學(xué)性質(zhì)(比如電荷和疏水性)的氨基酸殘基置換，并且因此不改變分子的功能特性。當(dāng)序列在保守置換方面不同時(shí)，可以向上調(diào)整序列同一性百分比以校進(jìn)行這種調(diào)整的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通常，這涉及將保守置換評分為部分而予非保守置換得分為零時(shí)，保守置換被給予0和1之間的得分。例如根據(jù)Meyers&Miller,ComputerApplic.Biol.Sci.4:11-17(1988)的算法，計(jì)算保守置換的得分，如在程序PC/GENE(Intelligenetics,MountainView,California,USA)中實(shí)施的。[0082]在本說明書中使用序列同一性百分比表示通過在比較窗口內(nèi)比較兩個(gè)最佳比對序列而確定的值，其中比較窗口中多核苷酸序列的部分可以包含與用于兩個(gè)序列的最佳比對的參考序列(不包括添加或缺失)相比的添加或缺失(即，缺口)。通過確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)同一核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置總數(shù)，并將結(jié)果乘以100以得到序列同一性的百分比，來計(jì)算百分比。低了細(xì)胞或植物(包括其衍生的所有后代植物)中其特定基因序列變體的表達(dá)。[0085]“毛狀體細(xì)胞”是指構(gòu)成毛狀體結(jié)構(gòu)例如腺或分泌細(xì)胞、基礎(chǔ)細(xì)胞和莖、或條紋細(xì)胞、細(xì)胞外腔和角質(zhì)層細(xì)胞。毛狀體也可以由一個(gè)單細(xì)胞組成。[0087]“變體”是偏離特定基因或多肽的標(biāo)準(zhǔn)或給定的核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或酸序列的“變體”形式。通過添加、去除或置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸序列的改變而改變的氨基酸序列可以被認(rèn)為是變體序列。多肽變體可具有“保守”變化，其中置換的氨基酸例如用色氨酸取代甘氨酸。類似的微小變化也可包括氨基酸缺失或插入或兩者。可以使用酸殘基可被置換、插入或缺失的指導(dǎo)。變體也可以指“改組基因”,例如在Maxygen受讓的專[0088]如本文所用，術(shù)語“約”將為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解，并且將在一些程度上取決于其使用的上下文而變化。如果該術(shù)語的使用在其所使用的上下文中對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是不清楚的，則“約”將意味著多至特定術(shù)語的加或減10%。或多種不同類型的植物組織和器官上發(fā)現(xiàn)的一種或多種毛狀體類型和/或一種或多種毛狀體細(xì)胞中賦予轉(zhuǎn)錄的核酸片段。生物活性片段賦予毛狀體特異性和/或至少毛狀體優(yōu)選的表達(dá)，并且它們優(yōu)選具有與SEQIDNO:1、3、5、7、9或11-高強(qiáng)度)。這可以通過用這樣的片段——優(yōu)選地可操作地連接到報(bào)道基因——轉(zhuǎn)化植物，并定性地(時(shí)空轉(zhuǎn)錄)和/或定量地測定毛狀體中的啟動(dòng)子活性來測試。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)在腺毛中測量時(shí)，本技術(shù)的啟動(dòng)子和/或啟動(dòng)子片段的強(qiáng)度定量地與CaMV35S啟動(dòng)子的強(qiáng)度相同或更高。在一些實(shí)施方式中，本文所述的毛狀體啟動(dòng)子的生物活性片段可為啟動(dòng)子的全長序列核酸序列的約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%。在其他實(shí)施方式中，本文描述的毛狀體啟動(dòng)子的生物活性核酸片段可以是，例如，至少約10個(gè)連續(xù)核酸。在又其他實(shí)施方式中，本文所述的毛狀體啟動(dòng)子的生物活性核酸片段可以是(1)OLS啟動(dòng)子(例如，SEQIDNO:1)的約10個(gè)連續(xù)核酸上至約554個(gè)連續(xù)核酸；(2)OLS1啟動(dòng)子(SEQIDNO:2)的約10個(gè)連續(xù)核酸上至約550個(gè)連續(xù)核酸；(3)OLS2啟動(dòng)子(SEQIDNO:3)的約10個(gè)連續(xù)核酸上至約558個(gè)連續(xù)核酸；(4)OAC啟動(dòng)子(例如，SEQIDNO:5)的約10個(gè)連續(xù)核酸上至約996個(gè)連續(xù)啟動(dòng)子(例如，SEQIDNO:8)的約10個(gè)連續(xù)核酸上至約1361個(gè)連續(xù)核酸；(7)PT1啟動(dòng)子(例IDNO:11)的約10個(gè)連續(xù)核酸上至約805個(gè)連續(xù)核酸；(9)AAE1-1'啟動(dòng)子(例如，SEQIDNO:12)的約10個(gè)連續(xù)核酸上至約800個(gè)連續(xù)核酸；(10)AAE3啟動(dòng)子(例如，SEQIDNO:110個(gè)連續(xù)核酸上至約1000個(gè)連續(xù)核酸；(11)AAE12啟動(dòng)子(例如，SEQIDNO:14)的約1續(xù)核酸上至約869個(gè)連續(xù)核酸；(12)CBDA合成酶啟動(dòng)子(例如，SEQIDNO:16)的約10個(gè)連續(xù)至約416個(gè)連續(xù)核酸；(14)CBDASNO:18)的約10個(gè)連續(xù)核酸上NO:19)的約10個(gè)連續(xù)核酸上至約531個(gè)連續(xù)核酸；(16)THCASNO:21)的約10個(gè)連續(xù)核酸上NO:22)的約10個(gè)連續(xù)核酸上至約796個(gè)連續(xù)核酸；(18)THCASNO:23)的約10個(gè)連續(xù)核酸上NO:24)的約10個(gè)連續(xù)核酸上約720個(gè)連續(xù)核酸；(21)THCAS1330'啟動(dòng)子(例如，SEQIDNO804個(gè)連續(xù)核酸；或(23)CBCAS3498'啟動(dòng)子的(例如，SEQIDNO:29)約10個(gè)連續(xù)核酸上至約800個(gè)連續(xù)核酸。在又其他實(shí)施方式中，毛狀體啟動(dòng)子的生物活性片段可以是這兩個(gè)量之[0090]III.使用毛狀體特異性啟動(dòng)子對宿主細(xì)胞和生物體的遺傳工程化[0091]A.毛狀體特異性啟動(dòng)子[0092]本技術(shù)的公開內(nèi)容涉及鑒定二十三種啟動(dòng)子，其能夠調(diào)節(jié)在毛狀體細(xì)胞中與其可操作地連接的編碼核酸序列的轉(zhuǎn)錄。16-19、21-26、28、29和31-33中的任一個(gè)中描述的核酸序列至少約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%同一的核酸序列，其中核酸序列能夠調(diào)節(jié)在毛狀體細(xì)胞中可操作地連接至其的編碼核酸序列的轉(zhuǎn)錄。兩個(gè)核酸序列之間的差異可以發(fā)生在參考核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之間的任何位置，單獨(dú)地散布在參考序列中的核苷酸之間或參考序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)基團(tuán)中。11-14、16-19、21-26、28、29和31-33的至少約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更多的核酸序列同一性，并且它們的活性是毛狀體特異性的。[0095]在本技術(shù)的一些實(shí)施方式中，使用本領(lǐng)域已知的方法，例如基于PCR的DNA修飾或標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)，或通過化學(xué)合成修飾的多核苷酸，來修飾多核苷酸(啟動(dòng)子)以產(chǎn)生分子序列可以被截短或缺失并仍然保留引導(dǎo)可操作連接的核酸序列在毛狀體中轉(zhuǎn)錄的能力。啟動(dòng)子區(qū)的最小長度可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)系統(tǒng)地從分離的多核苷酸的5’和3'末端去除序列來確定，其包括但不限于去除限制酶片段或用核酸酶消化。[0097]本技術(shù)的毛狀體特異性啟動(dòng)子也可用于表達(dá)將降低或抑制植物中天然基因表達(dá)的核酸。此類核酸可編碼反義核酸、核酶、有義抑制劑或抑制天然基因表達(dá)的其他產(chǎn)品。[0098]本技術(shù)的毛狀體特異性啟動(dòng)子也可用于在“分子農(nóng)業(yè)”應(yīng)用中表達(dá)蛋白質(zhì)或肽。此類蛋白質(zhì)或肽包括但不限于工業(yè)酶、抗體、治療劑和營養(yǎng)產(chǎn)品。[0099]在一些實(shí)施方式中，可以通過許多方法設(shè)計(jì)或工程化新的雜交啟動(dòng)子。許多啟動(dòng)子含有上游序列，其激活、增強(qiáng)或限定啟動(dòng)子的強(qiáng)度和/或且位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的其他上游元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平。[0100]B.用于毛狀體特異性表達(dá)的大麻素On(CANON)片段[0101]在一些實(shí)施方式中，本技術(shù)的公開內(nèi)容還涉及鑒定稱為“大麻素On”段的核酸分子，其足以引導(dǎo)可操作地連接至其的編碼核酸序列的毛狀體特異性表達(dá)。示的)與推定的TATA盒(粗體下劃線)、5'UTR和起始密碼子(以粗體下劃線示出的“atg”)一起如表1中的SEQIDNO:32所示。該共有序列衍生自來自THCA合成酶19603、1330和50320,IDNO:31)足以引導(dǎo)煙草(和大麻)的腺毛中的毛狀體特異性表達(dá)。[0103]在最小啟動(dòng)子(即TATA盒，轉(zhuǎn)錄起始和第一個(gè)ATG)的一個(gè)拷貝前面包含四個(gè)拷貝的CANON片段的核酸序列(其稱為“4xCANON片段合成啟動(dòng)子”)也如表1中的SEQIDNO:33接著是粗體的第三個(gè)片段，以及下劃線的第四個(gè)片段。大麻素On(“CANON”)片段(171bp)atgatgccaaactattcaatgtacaatgtacatttatttttaataagggcaggtgcctaatttttgtgaacttttttttaccacatgtgactatttaatg taaaatatttaagtcaatttctttgcccccactccaatatat具有推定的TATA盒、5’UTR和起始密碼子的CANON片段(232bp)atgatgccaaactattcaatgtacaatgtacatttatttttaataagggcaggtgcctaatttttgtgaacttttttttaccacatgtgactatttaatgtaaaatatttaagtcaatttctttgcc4xCANON片段合成啟動(dòng)子(709bp)gtacatttatttttaataagggcttcacctaacaaaggtgcctaattttaccacatgtgactatttaatgactatcaaattataaaatatttcccactccatgatgccaaactattcaatgtacaatgtacatttatttgtacaatgtacatttatttttaataagggcttcacctaacaaagacttttttttaccacatgtgactatttaatgactatcaaattataaaatatctttgcccccactccaatatataatgttataaataggataattcCANON片段足以以功能獲得啟動(dòng)子中引導(dǎo)毛狀體特異性表達(dá)。不希望受理論束縛，據(jù)信CANON片段負(fù)責(zé)許多大麻素生物合成酶基因(包括THCA、CBDA和CBCA合成酶)的毛狀體特異性表達(dá)。[0106]C.核酸構(gòu)建體[0107]在一些實(shí)施方式中，本技術(shù)的毛狀體特異性啟動(dòng)子序列和CANON片段或其生物活性片段可以并入核酸構(gòu)建體例如表達(dá)構(gòu)建體(即表達(dá)載體)中，其可以在宿主細(xì)胞如植物毛狀體細(xì)胞中引入并復(fù)制。此類核酸構(gòu)建體可包括與本技術(shù)的任何啟動(dòng)子序列或CANON片段于在重組細(xì)胞或生物體(例如植物細(xì)胞或植物)中表達(dá)同源或異源核酸序列的用途。在一些29和31-33中列出的任何啟動(dòng)子或CANON片段或其生物活性片段至同源或異源核酸序列，以形成核酸構(gòu)建體；和轉(zhuǎn)化宿主，例如植物或植物細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，編碼參與生產(chǎn)大酸序列的至少一種)可以適合作為可以與本技術(shù)的毛狀體特異性啟動(dòng)子或CANON片段可操作地連接的轉(zhuǎn)基因。在一些實(shí)施方式中，本技術(shù)的核酸構(gòu)建體調(diào)節(jié)一種或多種調(diào)節(jié)大麻素生物合成的蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，本技術(shù)的核酸構(gòu)建體可用于調(diào)節(jié)毛狀體細(xì)胞中大麻素或其他化合物(例如萜烯)的表達(dá)。物活性片段，其與編碼多肽的cDNA可操作地連接，所述多肽例如橄欖醇合成酶(OLS)、橄欖醇酸環(huán)化酶(OAC)、芳香族異戊烯轉(zhuǎn)移酶(PT)、己酰基-CoA合成酶(AEE1-1)、CBDA合成酶、CBCA合成酶和THCA合成酶中的一種或多種。在另一個(gè)實(shí)施方式中，植物細(xì)胞系包含表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含啟動(dòng)子或CANON片段，所述啟動(dòng)子或CANON片段包含選自SEQIDNO:香族異戊烯轉(zhuǎn)移酶(PT)、己酰基-CoA合成酶(AEE1-1)、CBDA合成酶、CBCA合成酶和THCA合成酶中的一種或多種。在另一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物包含表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含啟接，所述多肽例如橄欖醇合成酶(OLS)、橄欖醇酸環(huán)化酶(OAC)、芳香族異戊烯轉(zhuǎn)移酶(PT)、一個(gè)實(shí)施方式中，提供了用于遺傳調(diào)節(jié)大麻素產(chǎn)生的方法，包括：引入包含啟動(dòng)子或CANON接，所述多肽例如橄欖醇合成酶(OLS)、橄欖醇酸環(huán)化酶(OAC)、芳香族異戊烯轉(zhuǎn)移酶(PT)、[0109]在另一個(gè)實(shí)施方式中，表達(dá)載體31-33的核酸序列，或其生物活性片段，其與編碼多肽的cDNA可操作地連接，所述多肽例如植物細(xì)胞系包含一種或多種啟動(dòng)子，所述一種或多種啟動(dòng)子包含選自SEQIDNO:1-3、5、6、cDNA可操作地連接，所述多肽例如橄欖醇合成酶(OLS)、橄欖醇酸環(huán)化酶(OAC)、芳香族異戊種或多種。在另一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物包含一種或29和31-33的核酸序列，或其生物活性片段，其與編碼多肽的cDNA可操作地連接，所述多肽中，提供了用于遺傳調(diào)節(jié)大麻素產(chǎn)生水平的方法，包括：向宿主細(xì)胞中引入包含一種或多種香族異戊烯轉(zhuǎn)移酶(PT)、己酰基-CoA合成酶(A酶中的一種或多種。[0110]構(gòu)建體可以包含在載體內(nèi)，例如適于在合適的宿主(植物)細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體[0111]合適的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且描述于一般技術(shù)參考文獻(xiàn)中，例如Pouwelsetal.,CloningVectors,ALaboratory一些實(shí)施方式中，核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒載體或二元載體。合適載體的實(shí)例包括Ti質(zhì)粒載體。[0112]能夠在毛狀體特異性調(diào)節(jié)序列(例如，啟動(dòng)子、CANON片段)控制下引入核苷酸序列或嵌合基因的重組核酸構(gòu)建體(例如，表達(dá)載體)可以使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。為了生成嵌合基因，表達(dá)載體通常包含以5’至3'方向可操作地連接的毛狀體特異性啟動(dòng)子序列或CANON序列——其引導(dǎo)下游同源或異源核酸序列的轉(zhuǎn)錄，并且任選地隨后是3’非翻譯核酸區(qū)(3'-UTR)——其編碼多腺苷酸化信號，該信號在植物細(xì)胞中起作用以引起轉(zhuǎn)錄終止和將多聚腺苷酸核苷酸添加至編碼蛋白質(zhì)的mRNA的3'末端。同源或異源核酸序列可以是編碼蛋白質(zhì)或肽的序列，或者它可以是轉(zhuǎn)錄成活性RNA分子的序列，例如適合于沉默宿主細(xì)胞或生物體中基因或基因家族的有義和/或反義RNA。表達(dá)載體通常還含有可選擇標(biāo)記。典型多腺苷酸化信號。[0113]在一些實(shí)施方式中，本技術(shù)的表達(dá)載體可以含有終止序列，其位于本技術(shù)的核酸脂氨酸合成酶終止子(Tnos)、根癌土壤桿菌甘露氨酸合成酶終止子(Tmas)和CaMV35S終止子(T35S)。終止區(qū)包括豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小亞基終止區(qū)(TrbcS)或Tnos終止區(qū)。表達(dá)載體還可含有增強(qiáng)子、起始密碼子、剪接信號序列和靶向序列。[0114]在一些實(shí)施方式中，本技術(shù)的表達(dá)載體可含有選擇標(biāo)記，通過該選擇標(biāo)記可在培養(yǎng)物中鑒定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。標(biāo)記可以與異源核酸分子相關(guān)聯(lián)——即與啟動(dòng)子可操作地連接的植物或細(xì)胞。例如，在植物中，標(biāo)記基因?qū)⒕幋a抗生素或除草劑抗性。這允許從未轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。[0115]合適的可選擇標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于腺苷脫氨酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶、胸苷激酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、草甘膦和來霉素、卡那霉素和慶大霉素的抗性。該構(gòu)建體還可含有可選擇標(biāo)記基因bar,其賦予對除草劑膦絲菌素類似物如草銨膦銨鹽(ammoniumgluphosinate)的抗性。參見，例如，Thompsonetal.,EMBOJ.9:2519-23(1987)。也可以使用本領(lǐng)域已知的其他合適的選擇標(biāo)[0116]可以使用可見標(biāo)記，例如綠色熒光蛋白(GFP)。還描述了基于細(xì)胞分裂控制來鑒定[0117]還可包括細(xì)菌或病毒來源的復(fù)制序列，以允許將載體克隆到細(xì)菌或噬菌體宿主中。優(yōu)選地，使用廣泛宿主范圍的原核復(fù)制起點(diǎn)?？梢园?xì)菌的可選擇標(biāo)記以允許選擇攜帶所需構(gòu)建體的細(xì)菌細(xì)胞。合適的原核可選擇標(biāo)記還包括對抗生素如卡那霉素或四環(huán)素的[0118]如本領(lǐng)域已知的，編碼額外功能的其他核酸序列也可以存在于載體中。例如，當(dāng)土壤桿菌是宿主時(shí)，可以包括T-DNA序列以促進(jìn)隨后轉(zhuǎn)移至和并入植物染色體。[0119]本技術(shù)的核酸序列或其生物活性片段是否能夠在毛狀體中特異性地賦予轉(zhuǎn)錄以(例如，毛狀體，或在某些環(huán)境/發(fā)育條件下)中是否有活性。定量方法(如熒光GUS分析)也量化與對照相比的活性水平。合適的對照包括但不限于轉(zhuǎn)化有空載體(陰性對照)的植物或轉(zhuǎn)化有包含其他啟動(dòng)子例如擬南芥CER6啟動(dòng)子(其在煙草的表皮和毛狀體中具有活性)的構(gòu)建體的植物。9、11-14、16-19、21-26、28、29和31-33中列出的核酸序列或其生核酸序列(例如，報(bào)道基因，例如gusA,或編碼特定蛋白質(zhì)的任何基因)可操作地連接，并且可以用于使用已知方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。例如，可以通過定量RT-PCR或其他基于PCR的方法檢測毛狀體細(xì)胞中下游核酸序列的RNA轉(zhuǎn)錄物水平來測定(和任選地定量)啟動(dòng)子或CANON片道蛋白或者報(bào)道蛋白的活性。[0121]在一些實(shí)施方式中，本技術(shù)的啟動(dòng)子可用于驅(qū)動(dòng)毛狀體細(xì)胞中目的異源核酸的表達(dá)。異源核酸可以編碼任何人造重組或天然存在的多肽或蛋白質(zhì)，比如分別在SEQIDNO:[0122]D.宿主植物和細(xì)胞以及植物再生[0123]本技術(shù)的核酸構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，例如植物細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，本技術(shù)的核酸構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的至少一部分。這些表達(dá)載體可以短暫引入宿主植物細(xì)胞或穩(wěn)定整合到宿主植物細(xì)胞的基因組中，以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法生成轉(zhuǎn)基因植物。[0124]將核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞或植物的方法是本領(lǐng)域熟知的。用于將核酸構(gòu)建體(例如，表達(dá)載體)引入植物毛狀體以生成轉(zhuǎn)基因植物的合適方法包括但不限于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)雙子葉植物的方法主要使用根癌土壤桿菌。[0125]發(fā)根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)可用于產(chǎn)生植物的轉(zhuǎn)基因毛狀根培養(yǎng)物，所述植物包括大麻和煙草，如Guillonetal.,Curr.Opin.PlantBiol.9:341-6該Ri質(zhì)粒整合在基因組中并在培養(yǎng)物中在不補(bǔ)充生長素和其他植物激素的情況下生長。[0126]另外，植物可以通過根瘤菌(Rhizobium)、中華根瘤菌(Sinorhizobium)或中生根瘤菌(Mesorhizobium)轉(zhuǎn)化進(jìn)行轉(zhuǎn)化。(Broothaertsetal.,Nature433:629-633[0127]在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物后，可以通過諸如抗生素抗性、除草劑抗性、對氨基酸類似物的耐受性或使用表型標(biāo)記的方法選擇其中并入了所需DNA的那些植物細(xì)胞或植物。[0128]轉(zhuǎn)基因植物可用于常規(guī)植物育種方案，例如雜交、自交或回交，以產(chǎn)生含有轉(zhuǎn)基因的額外轉(zhuǎn)基因植物。[0129]適合的宿主細(xì)胞包括植物細(xì)胞。任何植物可以是適合的宿主，包括單子葉植物或雙子葉植物，比如，例如玉米/谷物(玉蜀黍?qū)傥锓N，例如玉蜀黍、二倍體多年生類玉米(Z.diploperennis)(chapule)、大芻草(Zealuxurians)(危地馬拉墨西哥類蜀黍蜀黍)、玉蜀黍亞種mexicana(墨西哥類蜀黍)、玉蜀黍亞種亞種parviglumis(巴爾薩斯河墨西哥類蜀黍)、四倍體多年生類玉米(Z.perennis)(多年生墨西哥類蜀黍)和Z.ramosa),小麥(小麥屬物種),大麥(例如，栽培大麥(Hordeumvulgare)),燕麥(例如，栽培燕麥(Avenasativa)),高粱(栽培高粱(Sorghumbicolor)),黑麥(栽培黑麥(Secalecereale)),大豆(G.barbadense)),蕓苔屬植物某些種(例如，甘藍(lán)型油菜(B.napus)、芥菜型油菜(B.juncea)、甘藍(lán)(B.oleracea)、蕪青(B.rapa)等),向日葵(sunflower)(向日葵(Helianthusannus)),煙草(煙草屬物種),苜蓿(紫花苜蓿(Medicagosativa)),稻(稻屬物種，例如，栽培稻秈稻品種群(0.sativaindica狼尾草(狼尾草屬物種，例如，御谷(P.glaucum)),樹物種，蔬菜物種，(最近重新分類為屬于茄屬植物),例如番茄(L.esculentum,同義Solanumlycopersicum),比如例如，櫻桃番茄、觀賞番茄變種(var.cerasiforme)或當(dāng)前番茄、醋栗番茄變種(var.pimpinellifolium)或樹番茄(S.betaceum,同義Cyphom薯)和其他茄屬植物物種，比如茄子(栽培茄(Solanummelongena)),辣椒(Capsicumfrutescens)),豌豆(pea)(例如，豌豆(Pisum菜豆屬物種),胡蘿卜(Daucuscarona),萵苣屬物種(比如葉用萵苣(Lactucasativa)、山萵苣(Lactucaindica)、山萵菊(Lactucaperennis)),黃瓜(cucumber)(黃瓜(Cucumissativus)),甜瓜(香瓜),綠皮西葫蘆(zucchini)(西葫蘆(Cucurbitapepo)),南瓜屬植物葫蘆),西瓜(watermelon)(西瓜(Citrulluslanatus),同義西瓜(Citrullusvulgaris)),例如，亞麻(亞麻科植物亞麻(Linumusitatissimum)),和大麻類植物(大麻)。在一些實(shí)施或其生物活性片段，以遺傳操縱大麻素(例如，THC、CBD、植物(例如煙草)和不天然產(chǎn)生大麻素的其他植物科和種中的其他分子的合成。[0131]本技術(shù)還預(yù)期細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(例如，植物細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)菌或真菌細(xì)胞培養(yǎng)物、人或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物),其包含用本文所述核酸分子轉(zhuǎn)化的遺傳工程化[0132]可以使用各種分析來確定植物細(xì)胞是否顯示基因表達(dá)的變化，例如，RNA印跡或定量逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生整個(gè)轉(zhuǎn)基因植物。這些轉(zhuǎn)基因植物可以繁殖并自花授粉以產(chǎn)生純合系。這些植物產(chǎn)生含有引入性狀的基因的種子，并且可以生長以產(chǎn)生將產(chǎn)生所選表型的植物。[0133]為了增強(qiáng)目的分子在毛狀體細(xì)胞中的表達(dá)和/或積累和/或促進(jìn)從毛狀體細(xì)胞中純化分子，可以使用下調(diào)植物毛狀體內(nèi)源的至少一種分子的方法。已知毛狀體含有許多化合物和代謝物，其干擾毛狀體細(xì)胞中其他分子的產(chǎn)生。這些化合物和代謝物包括，例如，蛋[0134]實(shí)施例[0135]僅以說明的方式而不是以限制性的方式提供以下實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認(rèn)識到可以改變或修改各種非關(guān)鍵參數(shù)以產(chǎn)生基本相同或相似結(jié)果。這些實(shí)施例決不應(yīng)被解釋為限制由所附權(quán)利要求書限定的本技術(shù)的范圍。[0136]實(shí)施例1:鑒定毛狀體特異性啟動(dòng)子[0137](i)橄欖醇合成酶(OLS)啟動(dòng)子、(ii)OLS1啟動(dòng)子和(iii)OLS2啟動(dòng)子的核酸序列酸環(huán)化酶(OAC)啟動(dòng)子的核酸序列在SEQIDNO:5中列出，OAC1啟動(dòng)子的核酸序列在SEQIDIDNO:10中列出。(i)己酰基-CoA合成酶(AEE1-1)啟動(dòng)子、(ii)己?；?CoA合成酶(AEE1-1')啟動(dòng)子、(iii)己酰基-CoA合成酶(AEE3)啟動(dòng)子和(iv)己?；?CoA合成酶(AAE12)啟動(dòng)子的核酸序列分別在SEQIDNO:11、12、13和14中列出，和己酰基-CoA合成酶(AEE1-1)的動(dòng)子、(iii)CBDA合成酶(CBDAS)20800啟動(dòng)子和(iv)CBDA合成酶(CBDAS)20800’啟動(dòng)子的核SEQIDNO:20中列出。(i)THCA合成酶(THCAS)19603啟動(dòng)子、(ii)THCA合成酶(THCAS)動(dòng)子、(v)THCA合成酶(THCAS)1330啟動(dòng)子和(vi)THCA合成酶(THCAS)1330′啟動(dòng)子的核酸序CBCA合成酶(CBCAS)3498啟動(dòng)子的核酸序列在SEQIDNO:28中列出，CBCA合成酶(CBCAS)[0138]通過利用大麻素生物合成途徑中的生物合成酶基因的編碼區(qū)使用BLAT檢索設(shè)備檢索大麻的草擬基因組序列來鑒定毛狀體特異性啟動(dòng)子。對于每個(gè)基因組序列命中，運(yùn)行基因預(yù)測程序(使用FGENESH程序)以建立第一個(gè)ATG。然后通過將基因組序列與NCBINR數(shù)據(jù)庫中最長的可用cDNA序列進(jìn)行比較來建立轉(zhuǎn)錄起始。多序列比對(對于CBDA和THCA合成酶基因)和查詢PLACE數(shù)據(jù)庫都建立了TATA盒區(qū)利用起始密碼子、轉(zhuǎn)錄起始和建立的TATABox,驗(yàn)證了啟動(dòng)子的位置和序列。[0139]實(shí)施例2:用于引導(dǎo)煙草中的大麻素產(chǎn)生的毛狀體特異性啟動(dòng)子[0140]在大麻毛狀體中合成和積累大麻素。橄欖醇合成酶(OLS)、橄欖醇酸環(huán)化酶(OAC)、成酶是大麻素生物合成途徑的酶。因此，預(yù)期這些酶中的每一種的啟動(dòng)子將引導(dǎo)編碼核酸在毛狀體細(xì)胞中的表達(dá)。該實(shí)施例證明了本技術(shù)的毛狀體特異性啟動(dòng)子或其生物活性片段在不天然產(chǎn)生大麻素的植物和植物細(xì)胞中表達(dá)大麻素生物合成酶的用途。[0141]方法31-33)置于適于在煙草細(xì)胞中表達(dá)的載體例如Ti質(zhì)粒載體中的GUS-A標(biāo)記的前面。將構(gòu)建體并入根瘤土壤桿菌中，并根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法用于轉(zhuǎn)化煙草。在卡那霉素選擇下轉(zhuǎn)化[0143]作為對照，將含有煙草NtCPS2啟動(dòng)子的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到煙草中。已顯示NtCPS2啟動(dòng)子在引導(dǎo)煙草中的毛狀體特異性表達(dá)方面高度有效(Sallaudetal.,ThePlantJournal[0144]表達(dá)分析。對T?植物進(jìn)行定量和定性β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)活性分析。啟動(dòng)子活性的定性分析使用組織學(xué)GUS測定和通過使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)實(shí)施。對于GUS分析，將各種植物部分在37℃下在大氣氧存在下與Xglue(5葡糖苷酸環(huán)己胺鹽)底物在磷酸鹽緩沖液(1mg/mL,K?HPO?,10μM,pH7.2,0.2%TritonX-100)中孵育過夜。通過用乙醇反復(fù)洗滌使樣品脫色。非轉(zhuǎn)基因植物用作陰性對照。預(yù)計(jì)具有的毛狀體將顯示明亮的藍(lán)色毛狀體，而這些轉(zhuǎn)基因植物的非毛狀體組織和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锏拿珷铙w不會(huì)被著色。[0145]使用熒光GUS分析進(jìn)行啟動(dòng)子活性的定量分析?？偟鞍踪|(zhì)樣品由幼葉材料制備；由合并的葉片制備樣品。使用金屬珠在PBS中研磨新鮮葉材料，然后離心并收集上清液。[0147]用包含本技術(shù)的啟動(dòng)子的表達(dá)載體或其生物活性片段遺傳工程化的植物和植物細(xì)胞展現(xiàn)出毛狀體特異性轉(zhuǎn)錄活性。如圖2B所示，用CBDAS20800:GUS轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物的毛狀體顯示明亮的藍(lán)色毛狀體，而植物的非毛狀體組織未著色。大麻素生物合成途徑中其他啟動(dòng)子的毛狀體特異性表達(dá)定性地相似(圖3)。圖3中示出的結(jié)果展示來自煙草毛狀體中完整大麻素生物合成途徑的啟動(dòng)子的毛狀體特異性表達(dá)。因此，這些結(jié)果證明，與在植物的根、葉、莖或其他組織中的表達(dá)相比，來自本文所述的完整大麻素生物合成途徑的啟動(dòng)子可用于優(yōu)先引導(dǎo)可操作連接的基因在毛狀體組織中的表達(dá)。這種毛狀體特異性表達(dá)將是操縱毛狀體特異性生化化合物(例如細(xì)胞毒性大麻素)的生物合成的關(guān)鍵工具。此外，這些啟動(dòng)子對于旨在使用煙草或大麻毛狀體作為特定生化化合物控制生產(chǎn)的生物工廠的策略至關(guān)酸序列連同推定的TATA盒、5'UTR和起始密碼子在SEQIDNO:32中列出。4xCANON片段合成CN109963941B1330、50320,CBCA合成酶3498和CBDA合成酶20800的毛狀體特異性啟動(dòng)子。[0151]通過使用BLAT檢索工具檢索紫色庫什基因組序列來鑒定CANON片段。使用THCA合成酶基因?qū)ψ仙珟焓不蚪M序列進(jìn)行BLAT檢索，得到以下結(jié)果：[0152]BLAT檢索結(jié)果 979……1…979…979·100.0號·s 142…260…514…979··87.5%··scaffold59317…+………863……1300……43 顯示從翻譯起始到推定的TATA盒上游的約160個(gè)堿基對的高序列相似性，但在TATA盒上游子包含在自然界中未發(fā)現(xiàn)的共有CANON片段的4個(gè)拷起始和第一個(gè)ATG)的一個(gè)拷貝的前面。如實(shí)施例2中所述，用位于GUS-A標(biāo)記前面的4×[0157]如圖4B所示，4×CANON片段合成啟動(dòng)子引導(dǎo)在毛狀體中的表達(dá)。因此，這些結(jié)果證明CANON片段足以以功能獲得啟動(dòng)子引導(dǎo)毛狀體特異性表達(dá)，并且因此負(fù)責(zé)許多大麻素生物合成酶基因(包括THCA、CBDA和CBCA合成酶)的毛狀體特異性表達(dá)。[0160]另外，在根據(jù)馬庫什組描述本公開的特征或方面的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，本公開也因此根據(jù)馬庫什組的任何單個(gè)成員或成員子組描述。[0161]如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，出于任何和所有目的，特別是在提供書面描述方面，本文公開的所有范圍還涵蓋任何和所有可能的子范圍及其子范圍的組合。任何列出的范圍可以容易地被識別為充分描述并且使得相同的范圍被分解為至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作為非限制性示例，本文討論的每個(gè)范圍可以容易地分解為下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解，所有語言例如范圍。最后，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，范圍包括每個(gè)單獨(dú)的成員。因此，例如，具有1-3個(gè)單元的組是指具有1、2或3個(gè)單元的組。類似地，具有1-5個(gè)單元的組是指具有1、2、3、4或5個(gè)單元的組，等等。[0162]本文提及或引用的所有公共可獲得的文件，比如專利、專利申請、臨時(shí)申請和出版物——包括基因庫登錄號，通過引用整體并入本文，包括所有附圖和表格，只要它們與本說明書的明確教導(dǎo)不矛盾。[0163]所附權(quán)利要求書中列出了其他實(shí)施方式。CN109963941B說明書22/35頁四酮體合成酶/橄欖醇合成酶(OLS)啟動(dòng)子四酮體合成酶/橄欖醇合成酶1(OLS1)啟動(dòng)子四酮體合成酶/橄欖醇合成酶2(OLS2)啟動(dòng)子AAAAATAAAATTAATAAATTTTTAATTATTAATATCATTTTATAAATAAATATCATTTTTATATTATTATAATATGTATAATATACAAGAAGTCTTATAGTAAGAGTATACACCTTACATCTCGATCTGAAATCAATGGTCAAGAAAAGTTCCCTACTTGCTAGATCCTACCATAGTCTTCCCTTATATTTATTATATTATATCTAATAATTAACAAATATTAACAAATCATTTATTAAAAAAAAAACTTGAAAAGTCAAAGATTAACCATCAATTTCAAATTAGTGAGAAAGTAGGTATTATATACCTAACACGTCTAGACGTTT