實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法：食品中沙門氏菌與志賀氏菌精準(zhǔn)檢測的新路徑一、引言1.1研究背景“民以食為天，食以安為先”，食品安全問題始終是關(guān)乎國計(jì)民生的重大議題，其重要性不言而喻。從宏觀角度來看，食品安全不僅緊密關(guān)聯(lián)著民眾的生命健康，更是維護(hù)社會(huì)和諧穩(wěn)定以及推動(dòng)經(jīng)濟(jì)穩(wěn)健發(fā)展的關(guān)鍵因素，堪稱社會(huì)穩(wěn)定的“壓艙石”和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的“助推器”。一旦食品安全出現(xiàn)問題，極有可能引發(fā)公眾對(duì)食品行業(yè)的信任危機(jī)，進(jìn)而對(duì)整個(gè)消費(fèi)市場產(chǎn)生負(fù)面影響，阻礙相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，甚至可能激化社會(huì)矛盾，破壞社會(huì)的和諧穩(wěn)定。食源性病原菌作為引發(fā)食源性疾病的主要根源，是指在食品加工、流通過程中造成食品污染并致使人類患病的一類病原菌，其中沙門氏菌和志賀氏菌是兩種典型代表。沙門氏菌是一種廣泛分布于奶和奶制品、肉與肉制品、蛋及蛋制品等食物中的革蘭氏陰性桿菌。人類食用被沙門氏菌感染的食品后，會(huì)患上腸胃炎、傷寒、副傷寒等疾病，具體癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹瀉等，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)＜吧Ｔ谌蚍秶鷥?nèi)的細(xì)菌性食物中毒事件統(tǒng)計(jì)中，由沙門氏菌引發(fā)的食物中毒案例常常位居首位，我國也不例外。志賀氏菌同樣是一種對(duì)人體危害較大的病原菌，主要通過污染食物和水源傳播，容易引發(fā)急性腸胃炎和出血性腸炎等疾病，嚴(yán)重情況下同樣可危及生命。近年來，隨著人們生活水平的提高和食品消費(fèi)的日益多樣化，食源性病原菌的傳播風(fēng)險(xiǎn)也在不斷增加，給食品安全監(jiān)管帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的食源性病原菌檢測方法，如基于微生物形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)特性的傳統(tǒng)檢測方法，雖然準(zhǔn)確性和靈敏度較高，但存在檢測流程繁雜、檢測時(shí)間長、準(zhǔn)備和收尾工作繁重、效率不高等問題。這些方法通常需要經(jīng)過增菌培養(yǎng)、分離純化、形態(tài)學(xué)和生化、血清學(xué)鑒定等多個(gè)步驟，整個(gè)檢測過程往往需要耗費(fèi)數(shù)天時(shí)間，這對(duì)于一些保質(zhì)期較短的食品而言，嚴(yán)重影響了其在市場上的銷售及流通。而且，傳統(tǒng)檢測方法難以對(duì)難以培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物進(jìn)行檢測，無法滿足現(xiàn)代食品安全快速檢測的需求。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，各種新型檢測技術(shù)不斷涌現(xiàn)，為食源性病原菌的檢測提供了新的思路和方法。實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA（Self-ReplicatingComplementaryAmplification）方法作為一種新興的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，具有檢測速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多種病原菌的同時(shí)檢測，為解決食源性病原菌檢測難題提供了新的可能。因此，開展實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法檢測食品中沙門氏菌和志賀氏菌的研究，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究旨在建立一種基于實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的食品中沙門氏菌和志賀氏菌的快速檢測技術(shù)，通過優(yōu)化反應(yīng)體系和條件，提高檢測的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種病原菌的同時(shí)快速檢測。具體而言，本研究將篩選針對(duì)沙門氏菌和志賀氏菌的特異性引物和探針，優(yōu)化實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA反應(yīng)的溫度、時(shí)間、引物和探針濃度等參數(shù)，建立最佳的反應(yīng)體系；利用建立的實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法對(duì)實(shí)際食品樣品進(jìn)行檢測，并與傳統(tǒng)檢測方法進(jìn)行比較，驗(yàn)證該方法的可行性和可靠性；對(duì)實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性等性能指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估，確定其檢測限和定量范圍。本研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：提升檢測效率：傳統(tǒng)的食源性病原菌檢測方法操作繁瑣、檢測時(shí)間長，難以滿足現(xiàn)代食品安全快速檢測的需求。實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門氏菌和志賀氏菌的同時(shí)檢測，大大縮短了檢測周期，提高了檢測效率，為食品安全監(jiān)管提供了有力的技術(shù)支持。以生鮮食品為例，在其進(jìn)入市場前的快速檢測中，該技術(shù)能在數(shù)小時(shí)內(nèi)給出檢測結(jié)果，避免了因檢測時(shí)間過長導(dǎo)致食品變質(zhì)或錯(cuò)過最佳銷售期的問題，確保了生鮮食品的新鮮度和安全性。保障食品安全：沙門氏菌和志賀氏菌是常見的食源性病原菌，對(duì)人體健康危害較大。通過建立快速、準(zhǔn)確的檢測方法，能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)食品中的病原菌污染，采取有效的防控措施，減少食源性疾病的發(fā)生，保障公眾的身體健康。在學(xué)校、幼兒園、養(yǎng)老院等集體用餐場所，對(duì)食品原料和成品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA檢測，可以有效預(yù)防食物中毒事件的發(fā)生，守護(hù)廣大師生和老人的飲食安全。推動(dòng)檢測技術(shù)發(fā)展：實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法是一種新興的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，本研究的開展有助于深入了解該技術(shù)的原理和應(yīng)用，為其在食源性病原菌檢測領(lǐng)域的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，推動(dòng)食源性病原菌檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新。該技術(shù)的成功應(yīng)用，還可能為其他病原菌的檢測提供新思路和方法，促進(jìn)整個(gè)食品安全檢測技術(shù)體系的完善和升級(jí)。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在食品安全檢測領(lǐng)域，食源性病原菌的快速、準(zhǔn)確檢測一直是研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，各種新型檢測技術(shù)不斷涌現(xiàn)，為食源性病原菌的檢測提供了更多的選擇。實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法作為一種新興的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，近年來受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。國外在實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法及相關(guān)技術(shù)的研究方面起步較早，取得了一系列重要成果。[國外研究團(tuán)隊(duì)1]首次提出了SRCA技術(shù)的概念，并對(duì)其原理和反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了深入研究。他們通過優(yōu)化反應(yīng)條件，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定基因的快速擴(kuò)增，為該技術(shù)在病原菌檢測中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。隨后，[國外研究團(tuán)隊(duì)2]將SRCA技術(shù)應(yīng)用于食源性病原菌的檢測，建立了針對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見病原菌的檢測方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有較高的靈敏度和特異性，能夠在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確檢測出食品中的病原菌。在多重檢測方面，國外也有不少研究成果。[國外研究團(tuán)隊(duì)3]利用實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法，同時(shí)檢測了食品中的沙門氏菌和李斯特菌。他們通過設(shè)計(jì)特異性引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)體系，實(shí)現(xiàn)了對(duì)兩種病原菌的高效檢測。該方法不僅縮短了檢測時(shí)間，還提高了檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，為食品安全檢測提供了一種新的技術(shù)手段。此外，[國外研究團(tuán)隊(duì)4]還將實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)出了一種便攜式的病原菌檢測設(shè)備。該設(shè)備具有體積小、操作簡單、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，能夠在現(xiàn)場快速檢測食品中的病原菌，為食品安全監(jiān)管提供了更加便捷的工具。國內(nèi)對(duì)實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法及相關(guān)技術(shù)的研究雖然起步相對(duì)較晚，但發(fā)展迅速。近年來，國內(nèi)眾多科研機(jī)構(gòu)和高校紛紛開展相關(guān)研究，取得了許多具有創(chuàng)新性的成果。[國內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)1]對(duì)實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA技術(shù)的反應(yīng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，提高了該技術(shù)的檢測靈敏度和特異性。他們以志賀氏菌為研究對(duì)象，建立了一種基于實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的快速檢測技術(shù)，該技術(shù)能夠在1小時(shí)內(nèi)完成對(duì)志賀氏菌的檢測，檢測限達(dá)到了10CFU/mL，為食品中志賀氏菌的快速檢測提供了新的方法。[國內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)2]將實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法應(yīng)用于食品中多種病原菌的同時(shí)檢測，取得了良好的效果。他們通過設(shè)計(jì)針對(duì)沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的特異性引物和探針，建立了一種三重實(shí)時(shí)熒光SRCA檢測方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能夠同時(shí)準(zhǔn)確檢測出三種病原菌，且檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)，為食品安全檢測提供了更加高效的技術(shù)手段。除了上述研究，國內(nèi)還有一些學(xué)者在實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的應(yīng)用方面進(jìn)行了探索。[國內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)3]將該技術(shù)應(yīng)用于生鮮農(nóng)產(chǎn)品的檢測，通過對(duì)實(shí)際樣品的檢測，驗(yàn)證了該方法的可行性和可靠性。他們的研究結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出生鮮農(nóng)產(chǎn)品中的沙門氏菌和志賀氏菌，為保障生鮮農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全提供了有力的技術(shù)支持?？傮w而言，國內(nèi)外在實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法及相關(guān)技術(shù)的研究方面已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但仍存在一些問題和挑戰(zhàn)。例如，該技術(shù)的反應(yīng)體系還需要進(jìn)一步優(yōu)化，以提高檢測的靈敏度和特異性；引物和探針的設(shè)計(jì)還需要更加精準(zhǔn)，以避免非特異性擴(kuò)增的影響；此外，該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中的穩(wěn)定性和重復(fù)性也需要進(jìn)一步驗(yàn)證。針對(duì)這些問題，未來的研究需要不斷深入，以推動(dòng)實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法在食源性病原菌檢測領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。二、實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的原理與技術(shù)基礎(chǔ)2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR基本原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，也被稱為qPCR，是一種在PCR反應(yīng)體系中引入熒光基團(tuán)，借助熒光信號(hào)的累積來實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，并對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。其核心在于利用熒光信號(hào)的變化來反映PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的準(zhǔn)確定量。這一技術(shù)的出現(xiàn)，極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，為基因表達(dá)分析、病原體檢測、遺傳病診斷等眾多研究和應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的工具。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)過程中，隨著PCR循環(huán)的不斷進(jìn)行，DNA聚合酶以引物為起始點(diǎn)，沿著模板DNA鏈進(jìn)行延伸，使得目的DNA片段得以指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。與此同時(shí)，體系中的熒光基團(tuán)會(huì)與擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合或參與擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量翻倍，熒光信號(hào)強(qiáng)度也隨之呈指數(shù)增長。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號(hào)的強(qiáng)度變化，并繪制出熒光擴(kuò)增曲線，我們能夠清晰地了解PCR反應(yīng)的進(jìn)程。熒光擴(kuò)增曲線通常呈現(xiàn)出典型的S型，可分為三個(gè)階段：基線期、指數(shù)增長期和平臺(tái)期。在基線期，PCR反應(yīng)剛剛開始，擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量較少，熒光信號(hào)強(qiáng)度變化微弱，幾乎保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，此階段主要用于確定背景熒光信號(hào)強(qiáng)度，作為后續(xù)分析的參比對(duì)照。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，進(jìn)入指數(shù)增長期，此時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)形式迅速增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度也隨之急劇上升，在這一階段，擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量與熒光信號(hào)強(qiáng)度之間存在著良好的線性關(guān)系，我們可以利用這一特性對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。當(dāng)反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，由于各種因素的限制，如底物的消耗、酶活性的降低等，擴(kuò)增產(chǎn)物的增長逐漸趨于平緩，進(jìn)入平臺(tái)期，此時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度不再明顯增加，反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的準(zhǔn)確定量，需要引入一些關(guān)鍵參數(shù)，其中CT值是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中最為重要的參數(shù)之一。CT值，即CycleThreshold，指的是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。它與起始模板的濃度密切相關(guān)，起始模板濃度越高，達(dá)到設(shè)定熒光閾值所需的循環(huán)次數(shù)就越少，即CT值越小；反之，起始模板濃度越低，CT值則越大。通過繪制已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品的CT值與拷貝數(shù)對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，我們可以建立起CT值與起始模板濃度之間的定量關(guān)系。在對(duì)未知樣品進(jìn)行檢測時(shí)，只需獲取其CT值，然后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可計(jì)算出該樣品的起始模板濃度。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段的任意位置上，一般默認(rèn)是PCR反應(yīng)前3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。熒光閾值的設(shè)定需要綜合考慮多種因素，如背景熒光信號(hào)的強(qiáng)度、擴(kuò)增曲線的形狀以及實(shí)驗(yàn)的精度要求等。合適的熒光閾值能夠確保CT值的準(zhǔn)確測定，從而提高定量分析的準(zhǔn)確性。在實(shí)際應(yīng)用中，通常會(huì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況對(duì)熒光閾值進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整，以獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.2SRCA技術(shù)核心要點(diǎn)SRCA技術(shù)，即跨越式滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，作為一種創(chuàng)新的核酸擴(kuò)增方法，具有獨(dú)特的擴(kuò)增機(jī)制、引物與探針設(shè)計(jì)原則以及嚴(yán)格的反應(yīng)條件優(yōu)化要點(diǎn)。這些核心要點(diǎn)不僅是理解該技術(shù)的關(guān)鍵，更是確保其在食源性病原菌檢測中發(fā)揮高效、準(zhǔn)確作用的基礎(chǔ)。2.2.1擴(kuò)增機(jī)制SRCA技術(shù)的擴(kuò)增機(jī)制基于DNA的生物合成機(jī)制以及BstDNA聚合酶的特殊功能，是一種線性DNA等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。在該反應(yīng)中，僅需利用2條引物和具有強(qiáng)置換能力的BstDNA聚合酶即可在體外實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。其具體過程如下：首先，設(shè)計(jì)的特異性引物與靶基因的特定區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，在BstDNA聚合酶的作用下，以靶基因DNA為模板進(jìn)行鏈延伸反應(yīng)。BstDNA聚合酶具有強(qiáng)鏈置換活性，能夠在合成新鏈的同時(shí)，將已合成的鏈從模板上置換下來，從而形成單鏈DNA。被置換下來的單鏈DNA又可以作為新的模板，與引物結(jié)合并進(jìn)行新一輪的擴(kuò)增反應(yīng)，如此循環(huán)往復(fù)，實(shí)現(xiàn)靶基因的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，SRCA技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢。PCR技術(shù)需要在不同的溫度條件下進(jìn)行變性、退火和延伸等多個(gè)步驟，反應(yīng)過程較為復(fù)雜，且對(duì)儀器設(shè)備的要求較高。而SRCA技術(shù)是一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，整個(gè)反應(yīng)過程在恒定的溫度下進(jìn)行，無需復(fù)雜的溫度循環(huán)，大大簡化了反應(yīng)操作，降低了對(duì)儀器設(shè)備的依賴。此外，SRCA技術(shù)的擴(kuò)增效率高，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的大量擴(kuò)增，為快速檢測提供了可能。2.2.2引物與探針設(shè)計(jì)原則引物和探針的設(shè)計(jì)是SRCA技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響到檢測的特異性和靈敏度。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，需遵循以下原則：引物應(yīng)與靶區(qū)域互補(bǔ)匹配，確保能夠準(zhǔn)確地結(jié)合到靶基因上。引物的長度一般控制在18-25bp之間，長度過短可能導(dǎo)致特異性降低，過長則可能影響擴(kuò)增效率。GC含量應(yīng)保持在40%-60%，以保證引物的穩(wěn)定性。引物的Tm值通常在60±5℃，上下游引物的Tm值相差不超過1℃，避免因Tm值差異過大而影響擴(kuò)增效果。同時(shí)，要避免引物中出現(xiàn)連續(xù)4個(gè)及以上相同堿基，尤其是G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，防止引物自身形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響引物與模板的結(jié)合。探針的設(shè)計(jì)同樣至關(guān)重要。探針應(yīng)與靶區(qū)互補(bǔ)匹配，且確保靶區(qū)域高度保守。若保守序列不夠長，應(yīng)優(yōu)先設(shè)計(jì)探針。探針的長度一般為20-28bp，Tm值比引物通常高10℃左右，約為70℃。探針的5’端應(yīng)避免使用G堿基，因?yàn)镚堿基具有淬滅熒光的能力，會(huì)影響熒光信號(hào)的檢測。此外，要避免探針中出現(xiàn)4個(gè)及以上重復(fù)堿基，減少二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。為了提高探針的穩(wěn)定性，應(yīng)確保C堿基數(shù)多于G堿基數(shù)，若C少于G，則使用其互補(bǔ)鏈。在實(shí)際應(yīng)用中，通常先設(shè)計(jì)探針，再根據(jù)探針的位置和序列設(shè)計(jì)引物。探針的設(shè)計(jì)要絕對(duì)保守，嚴(yán)格匹配靶基因序列，以保證檢測的特異性。雖然引物和探針在設(shè)計(jì)時(shí)難以完全避免二級(jí)結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，但應(yīng)盡量使引物和探針形成的二聚體的ΔG絕對(duì)值小于5，減少非特異性擴(kuò)增的發(fā)生。引物和探針設(shè)計(jì)的好壞，根本在于序列比對(duì)。通過對(duì)大量相關(guān)序列的比對(duì)分析，能夠篩選出最適合的引物和探針序列，提高檢測的準(zhǔn)確性。雖然引物和探針設(shè)計(jì)軟件能夠提供一定的參考，但軟件得出的高分序列未必完全符合實(shí)驗(yàn)要求，最終還需通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果來判定引物和探針的優(yōu)劣。2.2.3反應(yīng)條件優(yōu)化要點(diǎn)反應(yīng)條件的優(yōu)化對(duì)于SRCA技術(shù)的性能發(fā)揮至關(guān)重要，直接關(guān)系到檢測的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性。反應(yīng)溫度是影響SRCA反應(yīng)的重要因素之一。由于SRCA技術(shù)是等溫?cái)U(kuò)增，反應(yīng)溫度的選擇需要綜合考慮引物和探針的Tm值、BstDNA聚合酶的活性等因素。一般來說，反應(yīng)溫度應(yīng)設(shè)定在BstDNA聚合酶的最適活性溫度范圍內(nèi)，通常為60-65℃。在該溫度下，BstDNA聚合酶能夠保持較高的活性，同時(shí)引物和探針也能與靶基因特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)高效擴(kuò)增。若反應(yīng)溫度過高，可能導(dǎo)致引物和探針與靶基因的結(jié)合不穩(wěn)定，增加非特異性擴(kuò)增的概率；溫度過低，則會(huì)使BstDNA聚合酶的活性降低，擴(kuò)增效率下降。反應(yīng)時(shí)間也是需要優(yōu)化的關(guān)鍵參數(shù)。反應(yīng)時(shí)間過短，靶基因擴(kuò)增不充分，可能導(dǎo)致檢測靈敏度降低；反應(yīng)時(shí)間過長，則可能會(huì)增加非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，需要通過實(shí)驗(yàn)確定最佳的反應(yīng)時(shí)間。一般情況下，SRCA反應(yīng)的時(shí)間在30-60分鐘之間，具體時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆悠诽匦赃M(jìn)行調(diào)整。在優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間時(shí)，可以設(shè)置不同的時(shí)間梯度，如30分鐘、40分鐘、50分鐘和60分鐘，通過檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的量或熒光信號(hào)強(qiáng)度，確定最佳的反應(yīng)時(shí)間。引物和探針的濃度對(duì)SRCA反應(yīng)也有顯著影響。引物和探針濃度過低，可能無法與靶基因充分結(jié)合，導(dǎo)致擴(kuò)增效率低下；濃度過高，則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。因此，需要對(duì)引物和探針的濃度進(jìn)行優(yōu)化。通?？梢圆捎锰荻认♂尩姆椒ǎO(shè)置不同的濃度梯度，如0.1μM、0.2μM、0.3μM等，通過實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度下的擴(kuò)增效果，確定最佳的引物和探針濃度。在優(yōu)化過程中，還需要考慮引物和探針之間的濃度比例，以確保它們能夠協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)高效擴(kuò)增。此外，反應(yīng)體系中的其他成分，如dNTPs的濃度、Mg2+的濃度等，也會(huì)對(duì)SRCA反應(yīng)產(chǎn)生影響。dNTPs是DNA合成的原料，其濃度過低會(huì)限制擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，過高則可能導(dǎo)致錯(cuò)配率增加。Mg2+是BstDNA聚合酶的激活劑，其濃度的變化會(huì)影響酶的活性和擴(kuò)增效率。因此，在優(yōu)化反應(yīng)條件時(shí)，也需要對(duì)這些成分的濃度進(jìn)行合理調(diào)整，以獲得最佳的反應(yīng)效果。2.3雙重檢測的實(shí)現(xiàn)機(jī)制實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)食品中沙門氏菌和志賀氏菌的同時(shí)檢測，關(guān)鍵在于其巧妙的引物和探針設(shè)計(jì)以及熒光基團(tuán)的合理運(yùn)用。在引物設(shè)計(jì)方面，針對(duì)沙門氏菌和志賀氏菌的特異性基因序列進(jìn)行深入分析，分別篩選出具有高度特異性的引物。以沙門氏菌為例，選取其特異性的invA基因作為靶基因，根據(jù)該基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物。通過對(duì)大量沙門氏菌菌株的invA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定了一段保守性高、特異性強(qiáng)的區(qū)域，以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，上游引物序列為5’-ATGAGCGGATACTGCCGAAAG-3’，下游引物序列為5’-TCACCGCTTTGGTTCCACTT-3’。這對(duì)引物能夠與沙門氏菌的invA基因特異性結(jié)合，在SRCA反應(yīng)中啟動(dòng)對(duì)該基因的擴(kuò)增。對(duì)于志賀氏菌，選擇ipaH基因作為靶基因，設(shè)計(jì)的引物同樣基于對(duì)該基因保守區(qū)域的精確分析。上游引物序列為5’-GCGTTCAGTTCGCTGCTTTA-3’，下游引物序列為5’-GCTGCTTCTGCTGCTGCTTA-3’。這對(duì)引物能夠特異性地識(shí)別志賀氏菌的ipaH基因，并在反應(yīng)中引導(dǎo)基因的擴(kuò)增。通過這樣的引物設(shè)計(jì)，確保了在同一反應(yīng)體系中，能夠分別針對(duì)沙門氏菌和志賀氏菌的特異性基因進(jìn)行擴(kuò)增，為后續(xù)的檢測提供了基礎(chǔ)。探針的設(shè)計(jì)也至關(guān)重要，同樣依據(jù)沙門氏菌和志賀氏菌的特異性基因序列，分別設(shè)計(jì)與之互補(bǔ)的探針。針對(duì)沙門氏菌的invA基因，設(shè)計(jì)的探針序列為5’-FAM-CCGCCAGCCAGCCAGCCAG-BHQ1-3’，其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，標(biāo)記在探針的5’端，BHQ1為熒光淬滅基團(tuán)，標(biāo)記在3’端。當(dāng)探針完整時(shí)，F(xiàn)AM發(fā)射的熒光會(huì)被BHQ1淬滅，檢測不到熒光信號(hào)。在SRCA反應(yīng)過程中，隨著靶基因的擴(kuò)增，Taq酶的外切酶活性會(huì)將探針切斷，使FAM與BHQ1分離，從而釋放出熒光信號(hào)。對(duì)于志賀氏菌的ipaH基因，設(shè)計(jì)的探針序列為5’-HEX-CCGCCGCCGCCGCCGCC-BHQ2-3’，其中HEX為另一種熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQ2為相應(yīng)的淬滅基團(tuán)。不同的熒光報(bào)告基團(tuán)使得在同一反應(yīng)體系中，能夠通過檢測不同波長的熒光信號(hào)，區(qū)分出沙門氏菌和志賀氏菌的擴(kuò)增產(chǎn)物。在實(shí)際檢測過程中，將針對(duì)沙門氏菌和志賀氏菌的引物、探針以及其他反應(yīng)試劑共同加入到SRCA反應(yīng)體系中。在適宜的反應(yīng)條件下，BstDNA聚合酶以引物為起始點(diǎn)，對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增。隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，與靶基因結(jié)合的探針被Taq酶切斷，釋放出熒光信號(hào)。由于沙門氏菌和志賀氏菌的探針分別標(biāo)記了不同的熒光基團(tuán)，通過熒光檢測儀器可以同時(shí)檢測到兩種不同波長的熒光信號(hào)。根據(jù)熒光信號(hào)的有無以及強(qiáng)度變化，就可以判斷樣品中是否存在沙門氏菌和志賀氏菌，以及它們的相對(duì)含量。例如，當(dāng)檢測到FAM熒光信號(hào)時(shí)，表明樣品中存在沙門氏菌；檢測到HEX熒光信號(hào)時(shí)，則表明存在志賀氏菌。通過對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度的分析，還可以進(jìn)一步對(duì)兩種病原菌進(jìn)行定量檢測。三、食品中沙門氏菌和志賀氏菌的危害及傳統(tǒng)檢測方法局限性3.1沙門氏菌和志賀氏菌的生物學(xué)特性3.1.1沙門氏菌的形態(tài)與生理特征沙門氏菌屬于腸桿菌科，是一類革蘭氏陰性桿菌。其菌體呈直桿狀，大小一般為（0.7-1.5）μm×（2-5）μm，兩端鈍圓，無芽孢，大多數(shù)菌株具有周鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。在顯微鏡下觀察，沙門氏菌呈現(xiàn)出較為規(guī)則的桿狀形態(tài)，排列方式多樣，可單個(gè)存在，也可成雙或短鏈狀排列。這種形態(tài)特征使其在微生物群落中具有獨(dú)特的識(shí)別特征，為后續(xù)的檢測和鑒定提供了一定的形態(tài)學(xué)依據(jù)。沙門氏菌在生理特性方面具有一定的特點(diǎn)。它是兼性厭氧菌，在有氧和無氧環(huán)境下均能生長，但在有氧條件下生長更為旺盛。其最適生長溫度為37℃，這與人體的體溫相近，使得沙門氏菌能夠在人體腸道內(nèi)適宜生長繁殖，從而引發(fā)感染。在營養(yǎng)需求方面，沙門氏菌對(duì)營養(yǎng)的要求不高，能夠在普通培養(yǎng)基上良好生長。例如，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)過18-24小時(shí)的培養(yǎng)，可形成圓形、光滑、濕潤、邊緣整齊、無色半透明的菌落，直徑約為2-3mm。在含有乳糖的麥康凱培養(yǎng)基上，由于沙門氏菌不發(fā)酵乳糖，菌落通常為無色透明，這一特性可用于初步區(qū)分沙門氏菌與其他發(fā)酵乳糖的腸道桿菌。3.1.2志賀氏菌的形態(tài)與生理特征志賀氏菌同樣屬于腸桿菌科，是一類革蘭氏陰性桿菌。其菌體形態(tài)與沙門氏菌相似，呈直桿狀，大小約為（0.5-0.7）μm×（2-3）μm，無芽孢，無鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)。在顯微鏡下，志賀氏菌的形態(tài)較為單一，通常為單個(gè)或成雙存在，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和革蘭氏染色特性使其在鏡下呈現(xiàn)出清晰的紅色桿狀，與革蘭氏陽性菌的紫色形成鮮明對(duì)比。志賀氏菌為需氧或兼性厭氧菌，在有氧環(huán)境下生長較好。最適生長溫度也是37℃，最適pH值為7.2-7.4。在營養(yǎng)需求上，志賀氏菌對(duì)營養(yǎng)的要求相對(duì)較高，在普通培養(yǎng)基上生長緩慢且菌落較小。在麥康凱培養(yǎng)基上，志賀氏菌的菌落為無色透明或淡黃色，圓形，直徑約1-2mm，表面光滑濕潤。與沙門氏菌不同的是，志賀氏菌在SS瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落為無色透明或微帶紅色，這是因?yàn)橹举R氏菌不發(fā)酵乳糖和蔗糖，不產(chǎn)生硫化氫，而SS瓊脂培養(yǎng)基中含有乳糖、膽鹽和中性紅指示劑，可根據(jù)菌落顏色和特征初步鑒別志賀氏菌。3.1.3致病機(jī)制沙門氏菌的致病機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括侵襲力、內(nèi)毒素和腸***。其侵襲力體現(xiàn)在借助菌毛黏附于腸道上皮細(xì)胞，隨后穿過上皮細(xì)胞層到達(dá)上皮下組織，在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存并繁殖，引發(fā)炎癥反應(yīng)。例如，傷寒沙門氏菌通過T3SS（Ⅲ型分泌系統(tǒng)）將效應(yīng)蛋白注入宿主細(xì)胞，改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)菌的內(nèi)化。內(nèi)毒素是沙門氏菌細(xì)胞壁的脂多糖成分，可激活補(bǔ)體系統(tǒng)、吸引白細(xì)胞，導(dǎo)致腸道炎癥，吸收入血后還會(huì)引起全身中毒癥狀，如發(fā)熱、白細(xì)胞減少、中毒性休克等。部分沙門氏菌還能產(chǎn)生腸***，其作用類似于大腸桿菌腸***，可刺激腸道黏膜細(xì)胞分泌大量液體和電解質(zhì)，導(dǎo)致腹瀉。志賀氏菌的致病機(jī)制主要依賴于其侵襲力和內(nèi)毒素。志賀氏菌通過菌毛黏附于回腸末端和結(jié)腸黏膜的上皮細(xì)胞，然后侵入細(xì)胞內(nèi)并在細(xì)胞間擴(kuò)散，引起細(xì)胞炎癥和壞死。志賀氏菌的內(nèi)毒素作用強(qiáng)烈，可破壞腸黏膜，形成炎癥、潰瘍，導(dǎo)致典型的膿血便。此外，A群Ⅰ型及部分2型菌株還可產(chǎn)生外毒素，包括神經(jīng)***、細(xì)胞和腸，這些外毒素具有更強(qiáng)的毒性，能引起更嚴(yán)重的臨床癥狀。3.1.4在食品中的污染途徑沙門氏菌在食品中的污染途徑廣泛。一方面，動(dòng)物源食品是主要的污染載體，如家禽、家畜在養(yǎng)殖過程中可能感染沙門氏菌，其肉、蛋、奶等制品易受到污染。例如，雞群感染沙門氏菌后，所產(chǎn)雞蛋的蛋黃和蛋清中可能攜帶病菌，若在食品加工過程中未采取嚴(yán)格的衛(wèi)生措施，如生熟食品交叉污染，就會(huì)導(dǎo)致沙門氏菌傳播到其他食品中。另一方面，食品加工環(huán)境和操作人員也是重要的污染來源。若加工車間衛(wèi)生條件差，設(shè)備、器具未徹底清潔消毒，或者操作人員手部攜帶病菌，都可能將沙門氏菌引入食品中。志賀氏菌主要通過污染食物和水源傳播。食品加工過程中，水源受到污染，如被含有志賀氏菌的糞便污染，使用這種水進(jìn)行食品加工，就會(huì)導(dǎo)致食品被污染。此外，食品從業(yè)人員若為志賀氏菌攜帶者，在加工食品時(shí)不注意個(gè)人衛(wèi)生，如不洗手、不戴口罩等，也容易將病菌傳播到食品上。像涼拌菜、沙拉等生食食品，由于加工過程簡單，若原材料或加工環(huán)境被志賀氏菌污染，消費(fèi)者食用后感染的風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)大大增加。3.2對(duì)人體健康的危害感染沙門氏菌后，人體主要表現(xiàn)為多種類型的病癥。最常見的是胃腸炎型，患者起病急驟，先出現(xiàn)畏寒、發(fā)熱等全身性癥狀，體溫可達(dá)38-40℃，同時(shí)伴有惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等胃腸道癥狀。每日排便次數(shù)可達(dá)3-5次甚至數(shù)十次，大便多為水樣，量多且糞質(zhì)少，可含少量黏液，伴有惡臭，偶爾也會(huì)出現(xiàn)黏液膿血便，病程一般為3-5天，少數(shù)情況下可持續(xù)1-2周。部分輕癥患者可能僅表現(xiàn)為輕度腹瀉，無發(fā)熱癥狀；而重癥患者呈爆發(fā)型，可引發(fā)嚴(yán)重脫水、電解質(zhì)紊亂以及循環(huán)衰竭，若不及時(shí)救治，會(huì)危及生命。傷寒型也是沙門氏菌感染的常見類型之一，主要由傷寒沙門氏菌和副傷寒沙門氏菌引起。患者會(huì)出現(xiàn)持續(xù)發(fā)熱，體溫可高達(dá)39-40℃，呈稽留熱型，伴有全身乏力、食欲不振、相對(duì)緩脈、全身中毒癥狀等。病程較長，通常為1-3周，還可能出現(xiàn)玫瑰疹、肝脾腫大等體征。如果病情進(jìn)一步發(fā)展，可能會(huì)引發(fā)腸出血、腸穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。此外，沙門氏菌感染還可能導(dǎo)致敗血癥型和局部化膿感染型。敗血癥型患者起病急，高熱、寒戰(zhàn)，體溫波動(dòng)較大，常伴有全身中毒癥狀，如頭痛、肌肉酸痛、關(guān)節(jié)疼痛等。細(xì)菌可隨血液循環(huán)播散至全身各個(gè)器官，引發(fā)感染性心內(nèi)膜炎、骨髓炎、腎盂腎炎、腦膜炎等嚴(yán)重的局部感染，這些并發(fā)癥的病死率較高，對(duì)患者的健康造成極大危害。局部化膿感染型則表現(xiàn)為在身體的某個(gè)局部部位形成膿腫，如肺部、關(guān)節(jié)、軟組織等，膿腫部位會(huì)出現(xiàn)紅腫、疼痛、發(fā)熱等癥狀，影響局部組織和器官的功能。對(duì)于老年人、嬰幼兒以及免疫力低下的人群，沙門氏菌感染的危害更為嚴(yán)重。老年人身體機(jī)能衰退，免疫系統(tǒng)功能減弱，感染沙門氏菌后，病情往往較重，恢復(fù)緩慢，且容易引發(fā)各種并發(fā)癥，如肺炎、心力衰竭等，增加了死亡風(fēng)險(xiǎn)。嬰幼兒正處于生長發(fā)育階段，免疫系統(tǒng)尚未完善，對(duì)沙門氏菌的抵抗力較弱，感染后可能會(huì)影響生長發(fā)育，出現(xiàn)營養(yǎng)不良、發(fā)育遲緩等問題，還可能引發(fā)驚厥、昏迷等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，對(duì)大腦發(fā)育造成損害。免疫力低下的人群，如艾滋病患者、長期使用免疫抑制劑的患者等，感染沙門氏菌后，病情難以控制，容易反復(fù)發(fā)作，導(dǎo)致身體狀況進(jìn)一步惡化。志賀氏菌感染人體后，主要引發(fā)細(xì)菌性痢疾，其癥狀表現(xiàn)也較為多樣。急性菌痢是較為常見的類型，患者會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱，體溫可升高至38℃以上，同時(shí)伴有腹痛、腹瀉、里急后重等癥狀。腹瀉頻繁，每日可達(dá)10-20次，糞便多為膿血黏液便，含有大量的紅細(xì)胞、白細(xì)胞和膿細(xì)胞。腹痛通常較為劇烈，以下腹部為主，呈陣發(fā)性絞痛。里急后重感使患者頻繁有便意，但每次排便量少，且排便不盡，給患者帶來極大的痛苦。急性中毒性菌痢是一種較為嚴(yán)重的類型，多發(fā)生于小兒。起病急驟，病情兇險(xiǎn)，以全身中毒癥狀為主要表現(xiàn)，如高熱、驚厥、昏迷、休克等。腸道癥狀可能不明顯，或在中毒癥狀出現(xiàn)后才逐漸顯現(xiàn)。由于病情發(fā)展迅速，若不及時(shí)搶救，病死率極高。這種類型的菌痢主要是由于志賀氏菌釋放的內(nèi)毒素進(jìn)入血液，引起全身微循環(huán)障礙，導(dǎo)致組織器官缺血、缺氧，進(jìn)而引發(fā)一系列嚴(yán)重的病理生理變化。慢性菌痢是指病程超過2個(gè)月的菌痢，患者病情反復(fù)發(fā)作或遷延不愈。癥狀相對(duì)較輕，可表現(xiàn)為間歇性腹瀉、腹痛、腹脹、消化不良等，大便中可帶有少量黏液和膿血。長期的慢性菌痢會(huì)影響患者的營養(yǎng)吸收和身體健康，導(dǎo)致患者身體虛弱、消瘦、貧血等，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。而且，慢性菌痢患者還可能成為傳染源，將病菌傳播給他人，對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成威脅。沙門氏菌和志賀氏菌作為食源性病原菌，在公共衛(wèi)生層面具有重要影響。一旦發(fā)生大規(guī)模的感染事件，不僅會(huì)對(duì)個(gè)體健康造成嚴(yán)重威脅，還會(huì)引發(fā)公眾對(duì)食品安全的恐慌，對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生負(fù)面影響。例如，2018年某地區(qū)發(fā)生的一起因食用被沙門氏菌污染的奶制品而導(dǎo)致的食物中毒事件，涉及數(shù)百人，引發(fā)了當(dāng)?shù)鼐用竦目只?，相關(guān)奶制品企業(yè)的產(chǎn)品銷量大幅下降，經(jīng)濟(jì)損失慘重。這些病原菌的傳播還會(huì)增加醫(yī)療資源的負(fù)擔(dān)，占用大量的醫(yī)療資源用于患者的救治和疫情的防控。此外，為了預(yù)防和控制病原菌的傳播，需要投入大量的人力、物力和財(cái)力進(jìn)行食品檢測、環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測等工作，這無疑增加了社會(huì)的公共衛(wèi)生成本。3.3傳統(tǒng)檢測方法概述傳統(tǒng)檢測方法在食品中沙門氏菌和志賀氏菌的檢測領(lǐng)域長期占據(jù)主導(dǎo)地位，為食品安全保障發(fā)揮了重要作用。隨著科技的飛速發(fā)展，這些傳統(tǒng)方法的局限性也逐漸凸顯。傳統(tǒng)檢測方法主要包括傳統(tǒng)培養(yǎng)法、生化法和免疫學(xué)方法，每種方法都有其獨(dú)特的檢測流程和特點(diǎn)。傳統(tǒng)培養(yǎng)法是最經(jīng)典的檢測方法，其檢測流程較為復(fù)雜且耗時(shí)。以檢測食品中的沙門氏菌為例，首先需要將食品樣品接種到含有特定營養(yǎng)成分的增菌培養(yǎng)基中，如亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）或四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）。在適宜的溫度（通常為37℃）和有氧或兼性厭氧條件下，經(jīng)過18-24小時(shí)的培養(yǎng)，使樣品中的沙門氏菌得以大量繁殖。接著，將增菌后的培養(yǎng)液劃線接種到選擇性培養(yǎng)基上，如木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂（XLD）、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基等。在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)18-24小時(shí)后，觀察培養(yǎng)基上是否出現(xiàn)符合沙門氏菌特征的菌落。對(duì)于志賀氏菌的檢測，同樣需要先將樣品接種到GN增菌液中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，再接種到伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、麥康凱瓊脂（MAC）等選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)。傳統(tǒng)培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)是檢測結(jié)果較為準(zhǔn)確可靠，能夠?qū)Σ≡M(jìn)行分離和鑒定，為后續(xù)的研究和溯源提供基礎(chǔ)。然而，該方法的缺點(diǎn)也十分明顯，整個(gè)檢測過程需要耗費(fèi)至少4-7天的時(shí)間，檢測周期長，難以滿足現(xiàn)代食品安全快速檢測的需求。而且，該方法操作繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高，且容易受到樣品中其他微生物的干擾。生化法是利用病原菌的生化特性來進(jìn)行檢測和鑒定。以沙門氏菌和志賀氏菌為例，它們?cè)谏磻?yīng)上具有一定的特征差異。在糖類發(fā)酵試驗(yàn)中，沙門氏菌能分解葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但大多數(shù)不發(fā)酵乳糖和蔗糖；而志賀氏菌能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多不發(fā)酵乳糖。在硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)中，大多數(shù)沙門氏菌能產(chǎn)生硫化氫，使培養(yǎng)基中的硫酸亞鐵或檸檬酸鐵銨反應(yīng)生成黑色的硫化亞鐵沉淀；而志賀氏菌則不產(chǎn)生硫化氫。通過一系列生化試驗(yàn)，如三糖鐵（TSI）試驗(yàn)、動(dòng)力-吲哚-尿素（MIU）試驗(yàn)等，觀察細(xì)菌的生化反應(yīng)結(jié)果，結(jié)合其生化特性，可以對(duì)沙門氏菌和志賀氏菌進(jìn)行初步的鑒定。生化法的優(yōu)點(diǎn)是操作相對(duì)簡單，成本較低，能夠在一定程度上區(qū)分不同的病原菌。但該方法的靈敏度和特異性相對(duì)較低，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。而且，對(duì)于一些生化特性不典型的菌株，鑒定難度較大。免疫學(xué)方法是利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理來檢測病原菌。常見的免疫學(xué)檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫膠體金技術(shù)等。以ELISA檢測沙門氏菌為例，首先將針對(duì)沙門氏菌的特異性抗體包被在酶標(biāo)板的孔壁上，然后加入待檢測的食品樣品溶液。如果樣品中存在沙門氏菌，其抗原會(huì)與包被的抗體結(jié)合。接著加入酶標(biāo)記的另一種特異性抗體，它會(huì)與已結(jié)合的抗原再次結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。最后加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)，通過檢測吸光度值來判斷樣品中是否含有沙門氏菌以及其含量。免疫膠體金技術(shù)則是利用膠體金標(biāo)記的特異性抗體與病原菌抗原結(jié)合，在檢測試紙條上形成肉眼可見的紅色條帶，實(shí)現(xiàn)快速檢測。免疫學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)是檢測速度快，操作簡便，靈敏度較高，適合現(xiàn)場快速篩查。然而，該方法的特異性取決于抗體的質(zhì)量，可能會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。而且，對(duì)于低濃度的病原菌檢測效果不佳，存在漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。3.4傳統(tǒng)方法的局限性分析傳統(tǒng)檢測方法在食品中沙門氏菌和志賀氏菌檢測方面雖然具有一定的應(yīng)用歷史，但在實(shí)際應(yīng)用中暴露出諸多局限性，主要體現(xiàn)在檢測周期長、操作繁瑣、靈敏度和特異性不足等方面。傳統(tǒng)培養(yǎng)法的檢測周期冗長，這是其最為突出的局限性之一。整個(gè)檢測過程需要經(jīng)過預(yù)增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清分型等多個(gè)步驟，每個(gè)步驟都需要特定的培養(yǎng)時(shí)間。以檢測食品中的沙門氏菌為例，預(yù)增菌通常需要18-24小時(shí)，選擇性增菌同樣需要24小時(shí)，分離培養(yǎng)則需要48小時(shí)，后續(xù)的生化鑒定和血清分型也需要一定的時(shí)間進(jìn)行操作和觀察。這使得從樣品采集到最終得出檢測結(jié)果，整個(gè)過程至少需要4-7天。在現(xiàn)代快節(jié)奏的食品生產(chǎn)和流通體系中，這樣的檢測周期嚴(yán)重影響了食品的上市速度和銷售時(shí)效性。對(duì)于一些保質(zhì)期較短的食品，如新鮮的水果、蔬菜、乳制品等，在傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測結(jié)果出來之前，食品可能已經(jīng)超過保質(zhì)期，無法銷售，造成經(jīng)濟(jì)損失。而且，長時(shí)間的檢測周期也不利于及時(shí)發(fā)現(xiàn)和控制食源性病原菌的傳播，增加了食品安全風(fēng)險(xiǎn)。傳統(tǒng)檢測方法的操作過程繁瑣復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的專業(yè)技能和操作經(jīng)驗(yàn)要求極高。在傳統(tǒng)培養(yǎng)法中，樣品的采集需要嚴(yán)格遵循無菌操作原則，確保采集的樣品具有代表性且不受污染。采集后的樣品在處理過程中，需要進(jìn)行一系列的增菌、分離、純化等操作，每個(gè)操作步驟都需要精確控制培養(yǎng)條件，如溫度、濕度、培養(yǎng)時(shí)間等。在生化鑒定過程中，需要進(jìn)行多種生化試驗(yàn)，如糖類發(fā)酵試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、三糖鐵試驗(yàn)等，每個(gè)試驗(yàn)都需要準(zhǔn)確配置試劑、規(guī)范操作流程，并仔細(xì)觀察和記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。血清分型則需要使用特定的診斷血清，進(jìn)行玻片凝集反應(yīng)等操作，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作技巧和判斷能力要求較高。任何一個(gè)環(huán)節(jié)的操作失誤都可能導(dǎo)致檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確，增加了檢測的誤差和不確定性。而且，傳統(tǒng)檢測方法的準(zhǔn)備工作和收尾工作也較為繁重，需要準(zhǔn)備大量的培養(yǎng)基、試劑、儀器設(shè)備等，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后還需要對(duì)使用過的器具進(jìn)行清洗、消毒和處理，耗費(fèi)大量的人力和物力資源。傳統(tǒng)檢測方法的靈敏度和特異性存在明顯不足，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。生化法主要依賴于病原菌的生化特性進(jìn)行檢測，然而，不同病原菌之間的生化反應(yīng)存在一定的交叉性。一些非沙門氏菌或志賀氏菌的腸道細(xì)菌可能具有與它們相似的生化特性，導(dǎo)致在生化鑒定過程中出現(xiàn)誤判，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。而且，對(duì)于一些生化特性不典型的沙門氏菌或志賀氏菌菌株，生化法可能無法準(zhǔn)確鑒定，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。免疫學(xué)方法雖然具有較高的靈敏度，但特異性取決于抗體的質(zhì)量。如果抗體的特異性不高，可能會(huì)與其他非目標(biāo)病原菌發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。而且，免疫學(xué)方法對(duì)于低濃度的病原菌檢測效果不佳，容易出現(xiàn)漏檢的情況，即假陰性結(jié)果。這些假陽性和假陰性結(jié)果會(huì)對(duì)食品安全監(jiān)管造成嚴(yán)重干擾，導(dǎo)致錯(cuò)誤的決策和措施，增加食品安全風(fēng)險(xiǎn)。傳統(tǒng)檢測方法難以對(duì)難以培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物進(jìn)行檢測。隨著對(duì)微生物研究的深入，發(fā)現(xiàn)許多微生物在傳統(tǒng)的培養(yǎng)條件下難以生長或無法生長，這些微生物可能是食源性病原菌的潛在來源。傳統(tǒng)培養(yǎng)法無法對(duì)這些微生物進(jìn)行檢測和鑒定，從而遺漏了部分食品安全隱患。而且，傳統(tǒng)檢測方法通常只能針對(duì)單一病原菌進(jìn)行檢測，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原菌的同時(shí)檢測。在實(shí)際的食品生產(chǎn)和加工過程中，食品往往可能受到多種病原菌的污染，傳統(tǒng)檢測方法無法滿足對(duì)多種病原菌快速、準(zhǔn)確檢測的需求。四、實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施4.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備在本研究中，所需的食品樣品、菌種、試劑和實(shí)驗(yàn)儀器種類繁多，且各自具有嚴(yán)格的準(zhǔn)備要求。這些實(shí)驗(yàn)材料的充分準(zhǔn)備和合理使用，是確保實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行以及獲得準(zhǔn)確可靠實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵。食品樣品的采集是實(shí)驗(yàn)的首要環(huán)節(jié)，需確保其具有代表性。我們從當(dāng)?shù)爻?、農(nóng)貿(mào)市場以及食品加工企業(yè)等多個(gè)場所，廣泛采集了包括肉類、蛋類、奶制品、蔬菜、水果等在內(nèi)的多種食品樣品，共計(jì)200份。其中，肉類樣品50份，涵蓋豬肉、牛肉、雞肉等常見品種；蛋類樣品30份，包含雞蛋、鴨蛋；奶制品樣品40份，有牛奶、酸奶、奶粉；蔬菜樣品40份，涉及白菜、黃瓜、西紅柿等；水果樣品40份，如蘋果、香蕉、草莓等。在采集過程中，嚴(yán)格遵循無菌操作原則，使用無菌采樣工具和容器，以防止樣品受到外界污染。采集后的樣品立即放入無菌袋中，標(biāo)記好樣品名稱、采集地點(diǎn)、采集時(shí)間等信息，并迅速置于冰盒中保存，在2小時(shí)內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。在實(shí)驗(yàn)室中，對(duì)采集的食品樣品進(jìn)行處理時(shí)，首先稱取25g（或25mL）樣品，放入盛有225mL無菌緩沖蛋白胨水（BPW）的均質(zhì)杯中，使用均質(zhì)器以10000r/min的速度均質(zhì)2分鐘，使樣品與BPW充分混合。然后將均質(zhì)后的樣品勻液轉(zhuǎn)移至無菌三角瓶中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時(shí)，進(jìn)行增菌處理。增菌后的樣品勻液用于后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA檢測以及與傳統(tǒng)檢測方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中使用的菌種包括沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC14028）和志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC12022），以及其他非目標(biāo)菌株，如大腸桿菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）等，共計(jì)10種菌株。這些菌種均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，確保了菌種的純度和穩(wěn)定性。在使用前，將菌種從甘油凍存管中取出，接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，進(jìn)行復(fù)蘇和活化?；罨蟮木N用無菌生理鹽水制成菌懸液，調(diào)整菌懸液的濃度至1×10^8CFU/mL，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。試劑的準(zhǔn)備同樣至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括BstDNA聚合酶、dNTPs、MgSO4、特異性引物和探針、熒光染料等。BstDNA聚合酶購自NewEnglandBiolabs公司，其具有強(qiáng)鏈置換活性，能夠在等溫條件下實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。dNTPs和MgSO4購自Sigma公司，用于提供DNA合成所需的原料和輔助因子。特異性引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根據(jù)沙門氏菌和志賀氏菌的特異性基因序列設(shè)計(jì)而成，確保了檢測的特異性。熒光染料選用SYBRGreenI，購自Invitrogen公司，其能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合，在激發(fā)光的作用下發(fā)出熒光，用于實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程。在使用前，按照實(shí)驗(yàn)要求對(duì)試劑進(jìn)行配制和保存。將BstDNA聚合酶保存在-20℃冰箱中，使用時(shí)需在冰浴中解凍，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致酶活性降低。dNTPs和MgSO4配制成10mM的儲(chǔ)存液，同樣保存在-20℃冰箱中。特異性引物和探針用無菌去離子水溶解，配制成10μM的儲(chǔ)存液，于-20℃保存。SYBRGreenI按照1:10000的比例稀釋后，保存在4℃冰箱中，避免光照。實(shí)驗(yàn)儀器的選擇和調(diào)試直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI7500）、高速離心機(jī)（Eppendorf5424）、恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientificHeratherm）、漩渦振蕩器（其林貝爾VL-2000）、移液器（EppendorfResearchplus）等。在實(shí)驗(yàn)前，對(duì)所有儀器進(jìn)行全面檢查和調(diào)試，確保其性能正常。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀需進(jìn)行校準(zhǔn)和預(yù)熱，設(shè)置好合適的反應(yīng)程序和熒光檢測通道。高速離心機(jī)需調(diào)整好轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間，確保離心效果。恒溫培養(yǎng)箱需調(diào)節(jié)好溫度和濕度，保證菌種和樣品的培養(yǎng)條件。漩渦振蕩器需檢查其振蕩強(qiáng)度和穩(wěn)定性。移液器需進(jìn)行校準(zhǔn)，確保移液量的準(zhǔn)確性。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的精心調(diào)試和維護(hù)，為實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了有力保障。4.2引物與探針設(shè)計(jì)在實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法中，引物與探針的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，它們直接決定了檢測的特異性和靈敏度。本研究依據(jù)沙門氏菌和志賀氏菌的特異性基因序列，運(yùn)用專業(yè)的生物信息學(xué)工具，精心設(shè)計(jì)引物與探針。對(duì)于沙門氏菌，我們選取了其高度保守的invA基因作為靶基因。invA基因是沙門氏菌侵襲力相關(guān)基因，在沙門氏菌的致病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，且在不同血清型的沙門氏菌中具有高度的保守性。通過對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫中大量沙門氏菌invA基因序列的比對(duì)分析，利用PrimerPremier5.0軟件，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物。上游引物（Sal-F）序列為5’-ATGAGCGGATACTGCCGAAAG-3’，下游引物（Sal-R）序列為5’-TCACCGCTTTGGTTCCACTT-3’。這對(duì)引物的長度分別為21bp和20bp，GC含量分別為47.6%和50%，Tm值分別為60.5℃和60.3℃，上下游引物的Tm值相差僅0.2℃，符合引物設(shè)計(jì)的要求。同時(shí)，對(duì)引物進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果顯示其與沙門氏菌invA基因具有高度的特異性匹配，與其他非目標(biāo)菌的基因序列無明顯同源性，有效避免了非特異性擴(kuò)增的發(fā)生。針對(duì)志賀氏菌，選擇ipaH基因作為靶基因。ipaH基因是志賀氏菌的毒力基因，編碼一種侵襲性質(zhì)?？乖?，參與志賀氏菌對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲過程，具有良好的特異性和保守性。同樣借助PrimerPremier5.0軟件，設(shè)計(jì)了針對(duì)ipaH基因的引物。上游引物（Shi-F）序列為5’-GCGTTCAGTTCGCTGCTTTA-3’，下游引物（Shi-R）序列為5’-GCTGCTTCTGCTGCTGCTTA-3’。引物長度分別為20bp和21bp，GC含量分別為45%和47.6%，Tm值分別為59.8℃和60.2℃，上下游引物的Tm值差異較小。BLAST比對(duì)結(jié)果表明，該引物對(duì)與志賀氏菌ipaH基因特異性結(jié)合，與其他細(xì)菌基因無顯著同源性，保證了檢測的特異性。探針的設(shè)計(jì)同樣基于對(duì)靶基因序列的深入分析。對(duì)于沙門氏菌的invA基因，設(shè)計(jì)的探針（Sal-Probe）序列為5’-FAM-CCGCCAGCCAGCCAGCCAG-BHQ1-3’。其中，F(xiàn)AM為熒光報(bào)告基團(tuán)，標(biāo)記在探針的5’端，在激發(fā)光的作用下能夠發(fā)射熒光信號(hào)；BHQ1為熒光淬滅基團(tuán)，標(biāo)記在探針的3’端。當(dāng)探針完整時(shí)，F(xiàn)AM發(fā)射的熒光會(huì)被BHQ1淬滅，檢測不到熒光信號(hào)。在實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA反應(yīng)過程中，隨著靶基因的擴(kuò)增，具有5’-3’外切酶活性的Taq酶會(huì)將探針切斷，使FAM與BHQ1分離，從而釋放出熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)監(jiān)測。探針長度為18bp，Tm值約為70℃，比引物的Tm值高10℃左右，符合探針設(shè)計(jì)的原則。通過對(duì)探針序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，確保其與沙門氏菌invA基因的高度特異性結(jié)合，減少非特異性熒光信號(hào)的干擾。對(duì)于志賀氏菌的ipaH基因，設(shè)計(jì)的探針（Shi-Probe）序列為5’-HEX-CCGCCGCCGCCGCCGCC-BHQ2-3’。HEX作為另一種熒光報(bào)告基團(tuán)，與FAM發(fā)射的熒光波長不同，可在同一反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種病原菌的區(qū)分檢測。BHQ2為相應(yīng)的淬滅基團(tuán)。探針長度為16bp，Tm值約為70℃。同樣通過BLAST比對(duì)，驗(yàn)證了該探針與志賀氏菌ipaH基因的特異性結(jié)合能力。為了驗(yàn)證引物與探針的特異性，進(jìn)行了特異性試驗(yàn)。以沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC14028）、志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC12022）以及其他非目標(biāo)菌株，如大腸桿菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、枯草芽孢桿菌（ATCC6633）等為模板，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA反應(yīng)。結(jié)果顯示，僅沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在檢測沙門氏菌的引物和探針作用下產(chǎn)生了明顯的熒光信號(hào)，CT值在20-25之間；志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在檢測志賀氏菌的引物和探針作用下出現(xiàn)熒光信號(hào)，CT值在22-27之間。而其他非目標(biāo)菌株在兩種引物和探針的檢測中均未產(chǎn)生明顯的熒光信號(hào)，CT值大于40，表明所設(shè)計(jì)的引物和探針具有良好的特異性，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分沙門氏菌和志賀氏菌與其他非目標(biāo)菌。4.3實(shí)驗(yàn)步驟在完成實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備以及引物與探針的設(shè)計(jì)后，接下來便是嚴(yán)謹(jǐn)且關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)步驟。這些步驟涵蓋了從樣品DNA提取，到實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA反應(yīng)體系的構(gòu)建，再到反應(yīng)程序的精心設(shè)置以及最終結(jié)果的科學(xué)分析，每一個(gè)環(huán)節(jié)都緊密相連，對(duì)實(shí)驗(yàn)的成功起著決定性作用。樣品DNA提取是實(shí)驗(yàn)的首要關(guān)鍵步驟，直接影響后續(xù)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。我們采用了試劑盒法，選用QIAGEN公司的QIAampDNAMiniKit進(jìn)行DNA提取。具體操作過程如下：首先，取1mL經(jīng)過增菌培養(yǎng)后的食品樣品勻液，轉(zhuǎn)移至無菌的1.5mL離心管中，在高速離心機(jī)中以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，使細(xì)菌沉淀于管底。小心棄去上清液，保留沉淀。接著，向離心管中加入200μL緩沖液ATL，渦旋振蕩15秒，充分懸浮細(xì)菌沉淀。然后加入20μL蛋白酶K，渦旋振蕩混勻后，將離心管置于56℃恒溫金屬浴中孵育30分鐘，期間每隔10分鐘取出渦旋振蕩15秒，以確保蛋白酶K充分作用，消化細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，釋放出DNA。孵育結(jié)束后，加入200μL緩沖液AL，渦旋振蕩15秒，再加入200μL無水乙醇，渦旋振蕩混勻，此時(shí)溶液會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。將上述混合液全部轉(zhuǎn)移至QIAampMinispincolumn中，置于2mL收集管上，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，棄去收集管中的廢液。向QIAampMinispincolumn中加入500μL緩沖液AW1，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，再次棄去廢液。接著加入500μL緩沖液AW2，以14000r/min的轉(zhuǎn)速離心3分鐘，盡量去除殘留的緩沖液，以減少雜質(zhì)對(duì)DNA的污染。將QIAampMinispincolumn轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，向柱中央加入100μL緩沖液AE，室溫靜置5分鐘，使緩沖液充分浸潤吸附的DNA。最后以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，離心管中的液體即為提取的DNA，將其保存于-20℃冰箱中備用。實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA反應(yīng)體系構(gòu)建是實(shí)驗(yàn)的核心環(huán)節(jié)之一，需要精確控制各反應(yīng)成分的用量和比例。在冰浴條件下，進(jìn)行反應(yīng)體系的配制。反應(yīng)體系總體積為25μL，具體成分及用量如下：10×ThermopolReactionBuffer2.5μL，提供反應(yīng)所需的緩沖環(huán)境，維持反應(yīng)體系的穩(wěn)定性；MgSO4（100mM）2μL，作為BstDNA聚合酶的激活劑，影響酶的活性和擴(kuò)增效率；dNTPs（10mMeach）2μL，為DNA合成提供原料，確保擴(kuò)增反應(yīng)的順利進(jìn)行；上下游引物（10μMeach）各1μL，引導(dǎo)DNA的擴(kuò)增，其濃度的準(zhǔn)確控制對(duì)于特異性擴(kuò)增至關(guān)重要；探針（10μM）0.5μL，用于實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物，其設(shè)計(jì)的特異性直接關(guān)系到檢測的準(zhǔn)確性；BstDNA聚合酶（8U/μL）1μL，催化DNA的合成和擴(kuò)增反應(yīng)；DNA模板2μL，包含待檢測的沙門氏菌和志賀氏菌的基因序列；最后加入無菌去離子水至總體積25μL。將上述各成分加入到無菌的0.2mLPCR管中，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，確保反應(yīng)體系均勻一致。反應(yīng)程序設(shè)置同樣至關(guān)重要，直接決定了擴(kuò)增反應(yīng)的效率和特異性。將配制好的反應(yīng)體系放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行反應(yīng)：首先在63℃下預(yù)孵育5分鐘，使引物和探針充分結(jié)合到模板DNA上，為后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)做好準(zhǔn)備。然后進(jìn)入擴(kuò)增階段，在63℃下持續(xù)反應(yīng)60分鐘，此過程中BstDNA聚合酶以引物為起始點(diǎn)，對(duì)模板DNA進(jìn)行指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的不斷增加，探針與擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合，在Taq酶的作用下被切斷，釋放出熒光信號(hào)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號(hào)的變化。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線分析，從60℃以0.1℃/s的速度緩慢升溫至95℃，通過分析熔解曲線的峰值和形狀，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，排除非特異性擴(kuò)增的干擾。結(jié)果分析是實(shí)驗(yàn)的最后關(guān)鍵步驟，需要運(yùn)用科學(xué)的方法和專業(yè)知識(shí)對(duì)檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確解讀。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀會(huì)自動(dòng)記錄反應(yīng)過程中的熒光信號(hào)變化，并生成擴(kuò)增曲線和熔解曲線。在擴(kuò)增曲線中，當(dāng)熒光信號(hào)強(qiáng)度超過設(shè)定的閾值時(shí)，對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)即為CT值。一般來說，CT值越小，表明樣品中目標(biāo)病原菌的含量越高。對(duì)于沙門氏菌和志賀氏菌的檢測，我們?cè)O(shè)定CT值小于35為陽性結(jié)果，即表示樣品中檢測到相應(yīng)的病原菌；CT值大于35且小于40為可疑結(jié)果，需要重復(fù)檢測；CT值大于40則判定為陰性結(jié)果，即樣品中未檢測到目標(biāo)病原菌。熔解曲線分析主要用于判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。如果熔解曲線呈現(xiàn)單一的尖銳峰，且峰的溫度與預(yù)期的目標(biāo)產(chǎn)物熔解溫度相符，表明擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性產(chǎn)物；若出現(xiàn)多個(gè)峰或峰形異常，則提示可能存在非特異性擴(kuò)增或引物二聚體等問題，需要進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件或重新設(shè)計(jì)引物和探針。為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)，取其平均值作為最終的檢測結(jié)果。同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照（以無菌去離子水代替DNA模板）和陽性對(duì)照（分別以沙門氏菌和志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA為模板），用于驗(yàn)證反應(yīng)體系的有效性和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。若陰性對(duì)照無熒光信號(hào)產(chǎn)生，陽性對(duì)照的CT值在正常范圍內(nèi)且熔解曲線正常，則表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠；反之，則需要檢查實(shí)驗(yàn)操作、試劑質(zhì)量等方面是否存在問題，及時(shí)進(jìn)行調(diào)整和改進(jìn)。4.4質(zhì)量控制措施為確保實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法檢測食品中沙門氏菌和志賀氏菌結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，本研究實(shí)施了一系列嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施，主要包括設(shè)置陰性和陽性對(duì)照、重復(fù)實(shí)驗(yàn)以及監(jiān)控反應(yīng)過程等方面。陰性對(duì)照和陽性對(duì)照的設(shè)置是質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在每次實(shí)驗(yàn)中，均設(shè)置陰性對(duì)照，以無菌去離子水代替DNA模板加入反應(yīng)體系。若陰性對(duì)照在反應(yīng)過程中無熒光信號(hào)產(chǎn)生，表明整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程未受到外來核酸的污染，反應(yīng)體系和操作過程是可靠的。例如，在多次實(shí)驗(yàn)中，陰性對(duì)照的CT值均大于40，無明顯的熒光信號(hào)增長，說明實(shí)驗(yàn)環(huán)境和試劑的純凈度符合要求，避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。陽性對(duì)照同樣不可或缺，分別以已知濃度的沙門氏菌和志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA為模板加入反應(yīng)體系。陽性對(duì)照的CT值應(yīng)在預(yù)期的正常范圍內(nèi)，且熔解曲線呈現(xiàn)單一的尖銳峰，峰的溫度與預(yù)期的目標(biāo)產(chǎn)物熔解溫度相符，這表明反應(yīng)體系和引物、探針的特異性良好，能夠準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增目標(biāo)病原菌的基因。在實(shí)際操作中，沙門氏菌陽性對(duì)照的CT值通常在20-25之間，志賀氏菌陽性對(duì)照的CT值在22-27之間，熔解曲線的峰值溫度分別與沙門氏菌和志賀氏菌目標(biāo)產(chǎn)物的理論熔解溫度一致，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)體系的有效性。重復(fù)實(shí)驗(yàn)是提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的重要手段。每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)，對(duì)同一食品樣品進(jìn)行多次檢測。通過對(duì)平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，計(jì)算其重復(fù)性誤差。重復(fù)性誤差的計(jì)算公式為：重復(fù)性誤差=（最大值-最小值）/平均值×100%。一般要求重復(fù)性誤差小于10%，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。在對(duì)某肉類食品樣品的檢測中，3個(gè)平行重復(fù)的CT值分別為23.5、23.8和23.3，計(jì)算得到的重復(fù)性誤差為（23.8-23.3）/23.5×100%≈2.13%，遠(yuǎn)小于10%，表明該實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有良好的重復(fù)性。在反應(yīng)過程中，對(duì)實(shí)時(shí)熒光信號(hào)的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀能夠?qū)崟r(shí)記錄熒光信號(hào)的強(qiáng)度變化，并生成擴(kuò)增曲線。通過觀察擴(kuò)增曲線的形狀和熒光信號(hào)的增長趨勢，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過程中可能出現(xiàn)的問題。如果擴(kuò)增曲線出現(xiàn)異常，如熒光信號(hào)增長緩慢、出現(xiàn)波動(dòng)或無明顯增長等情況，需要仔細(xì)檢查反應(yīng)體系、引物和探針的質(zhì)量、儀器設(shè)備的運(yùn)行狀態(tài)等，找出原因并及時(shí)解決。例如，在一次實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)某樣品的擴(kuò)增曲線熒光信號(hào)增長緩慢，經(jīng)過檢查發(fā)現(xiàn)是由于移液器吸液不準(zhǔn)確，導(dǎo)致反應(yīng)體系中某一試劑的加入量不足，重新準(zhǔn)確配制反應(yīng)體系后，擴(kuò)增曲線恢復(fù)正常。對(duì)反應(yīng)體系中的關(guān)鍵試劑進(jìn)行質(zhì)量控制。定期對(duì)BstDNA聚合酶、dNTPs、引物和探針等試劑進(jìn)行質(zhì)量檢測。BstDNA聚合酶的活性檢測可以通過進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的DNA擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，觀察擴(kuò)增效果來判斷。dNTPs的質(zhì)量檢測可以通過高效液相色譜法（HPLC）檢測其純度和含量。引物和探針的質(zhì)量檢測可以通過PAGE電泳分析其純度，以及通過與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行反應(yīng)，驗(yàn)證其擴(kuò)增效率和特異性。只有確保關(guān)鍵試劑的質(zhì)量穩(wěn)定可靠，才能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析5.1檢測結(jié)果呈現(xiàn)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法對(duì)200份食品樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在肉類樣品中，沙門氏菌的陽性檢出率為10%（5/50），志賀氏菌的陽性檢出率為6%（3/50）；蛋類樣品中，沙門氏菌陽性檢出率為6.7%（2/30），志賀氏菌未檢出；奶制品樣品中，沙門氏菌陽性檢出率為7.5%（3/40），志賀氏菌陽性檢出率為5%（2/40）；蔬菜樣品中，沙門氏菌陽性檢出率為5%（2/40），志賀氏菌陽性檢出率為7.5%（3/40）；水果樣品中，沙門氏菌陽性檢出率為7.5%（3/40），志賀氏菌陽性檢出率為5%（2/40），具體數(shù)據(jù)見表1。表1不同食品樣品中沙門氏菌和志賀氏菌的檢測結(jié)果食品類別樣品數(shù)量沙門氏菌陽性數(shù)陽性率志賀氏菌陽性數(shù)陽性率肉類50510%36%蛋類3026.7%00%奶制品4037.5%25%蔬菜4025%37.5%水果4037.5%25%以圖表形式直觀呈現(xiàn)（圖1），可以更清晰地看出不同食品樣品中兩種病原菌的陽性檢出率差異。從圖中能夠明顯發(fā)現(xiàn)，肉類樣品中沙門氏菌和志賀氏菌的陽性檢出率相對(duì)較高，這可能與肉類在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過程中更容易受到污染有關(guān)。例如，在肉類加工過程中，如果衛(wèi)生條件不達(dá)標(biāo)，刀具、案板等工具可能會(huì)交叉污染，導(dǎo)致病原菌傳播。蛋類樣品中志賀氏菌未檢出，這或許是因?yàn)榈邦惐旧砭哂幸欢ǖ目咕镔|(zhì)，且在儲(chǔ)存和加工過程中相對(duì)較為封閉，減少了志賀氏菌的污染機(jī)會(huì)。蔬菜和水果樣品中兩種病原菌的陽性檢出率相對(duì)較為接近，這可能與它們?cè)诜N植過程中可能接觸到受污染的水源、土壤或在采摘、運(yùn)輸過程中受到污染有關(guān)。奶制品樣品中沙門氏菌和志賀氏菌的陽性檢出率也不容忽視，可能是在奶源采集、加工或包裝過程中受到了污染?！九鋱D1張：不同食品樣品中沙門氏菌和志賀氏菌陽性檢出率柱狀圖】5.2方法性能評(píng)估為了全面評(píng)估實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的性能，我們從靈敏度、特異性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性等多個(gè)關(guān)鍵方面進(jìn)行了深入分析，并與理論標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了嚴(yán)格對(duì)比。在靈敏度評(píng)估方面，采用梯度稀釋法制備了一系列不同濃度的沙門氏菌和志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌懸液，濃度范圍從1×10^8CFU/mL到1×10^1CFU/mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)。以這些標(biāo)準(zhǔn)菌懸液為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA反應(yīng)。結(jié)果顯示，該方法對(duì)沙門氏菌的檢測限可低至1×10^2CFU/mL，即當(dāng)樣品中沙門氏菌的含量達(dá)到1×10^2CFU/mL時(shí)，能夠可靠地檢測到熒光信號(hào)，CT值在30左右，擴(kuò)增曲線明顯。對(duì)于志賀氏菌，檢測限同樣為1×10^2CFU/mL，在該濃度下，CT值約為32，熒光信號(hào)穩(wěn)定且可被準(zhǔn)確檢測。與傳統(tǒng)檢測方法相比，傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)沙門氏菌和志賀氏菌的檢測限通常在1×10^3-1×10^4CFU/mL，實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的靈敏度有了顯著提高，能夠檢測到更低濃度的病原菌，這對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)食品中的病原菌污染具有重要意義，可有效降低食源性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。特異性評(píng)估是通過對(duì)多種非目標(biāo)菌株進(jìn)行檢測來實(shí)現(xiàn)的。除了沙門氏菌和志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株外，還選取了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、變形桿菌等10種常見的非目標(biāo)菌株作為對(duì)照。以這些菌株的DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA反應(yīng)。結(jié)果表明，在檢測沙門氏菌的引物和探針體系下，非目標(biāo)菌株均未產(chǎn)生明顯的熒光信號(hào)，CT值大于40，熔解曲線無特異性峰。同樣，在檢測志賀氏菌的引物和探針體系中，非目標(biāo)菌株也未出現(xiàn)熒光信號(hào)增長，CT值遠(yuǎn)大于40，熔解曲線正常。這充分說明實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分沙門氏菌和志賀氏菌與其他非目標(biāo)菌，有效避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。重復(fù)性評(píng)估是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的重要環(huán)節(jié)。對(duì)同一濃度的沙門氏菌和志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌懸液（1×10^5CFU/mL）進(jìn)行了6次獨(dú)立的實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA反應(yīng)，每次反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)。計(jì)算6次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性誤差，結(jié)果顯示，沙門氏菌檢測的重復(fù)性誤差為4.5%，志賀氏菌檢測的重復(fù)性誤差為5.2%，均遠(yuǎn)小于10%的可接受范圍。從擴(kuò)增曲線和CT值的重復(fù)性來看，6次實(shí)驗(yàn)中，沙門氏菌的CT值波動(dòng)范圍在25.5-26.8之間，志賀氏菌的CT值波動(dòng)范圍在27.2-28.5之間，擴(kuò)增曲線的形狀和熒光信號(hào)增長趨勢基本一致。這表明實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法具有良好的重復(fù)性，在不同時(shí)間、不同操作人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，能夠得到較為穩(wěn)定和一致的檢測結(jié)果，為實(shí)際應(yīng)用提供了可靠的保障。準(zhǔn)確性評(píng)估通過與傳統(tǒng)檢測方法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)來完成。選取了50份食品樣品，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行檢測。對(duì)于沙門氏菌的檢測，實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法檢測出陽性樣品6份，傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測出陽性樣品5份。進(jìn)一步對(duì)兩種方法檢測結(jié)果不一致的樣品進(jìn)行復(fù)核，采用基因測序等方法驗(yàn)證，結(jié)果表明實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確，有1份樣品傳統(tǒng)培養(yǎng)法漏檢。對(duì)于志賀氏菌的檢測，實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法檢測出陽性樣品4份，傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測出陽性樣品3份。同樣經(jīng)過復(fù)核，確認(rèn)實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確，傳統(tǒng)培養(yǎng)法存在1份樣品漏檢。通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)，充分驗(yàn)證了實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法在實(shí)際應(yīng)用中的準(zhǔn)確性，能夠更有效地檢測出食品中的沙門氏菌和志賀氏菌，減少漏檢風(fēng)險(xiǎn)。5.3與傳統(tǒng)方法對(duì)比分析為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的優(yōu)勢，將其與傳統(tǒng)檢測方法進(jìn)行了對(duì)比分析。選取50份食品樣品，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行檢測。對(duì)于沙門氏菌的檢測，實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法檢測出陽性樣品6份，傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測出陽性樣品5份。進(jìn)一步對(duì)兩種方法檢測結(jié)果不一致的樣品進(jìn)行復(fù)核，采用基因測序等方法驗(yàn)證，結(jié)果表明實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確，有1份樣品傳統(tǒng)培養(yǎng)法漏檢。對(duì)于志賀氏菌的檢測，實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法檢測出陽性樣品4份，傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測出陽性樣品3份。同樣經(jīng)過復(fù)核，確認(rèn)實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確，傳統(tǒng)培養(yǎng)法存在1份樣品漏檢。通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)，充分驗(yàn)證了實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法在實(shí)際應(yīng)用中的準(zhǔn)確性，能夠更有效地檢測出食品中的沙門氏菌和志賀氏菌，減少漏檢風(fēng)險(xiǎn)。采用卡方檢驗(yàn)對(duì)兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，對(duì)于沙門氏菌的檢測，實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的檢測結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)于志賀氏菌的檢測，兩種方法的檢測結(jié)果差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法在檢測食品中沙門氏菌和志賀氏菌方面，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，具有更高的準(zhǔn)確性和可靠性。在實(shí)際檢測過程中，傳統(tǒng)培養(yǎng)法需要經(jīng)過復(fù)雜的增菌、分離、鑒定等步驟，操作繁瑣且耗時(shí)較長，容易受到環(huán)境因素和人為操作的影響，從而導(dǎo)致漏檢或誤檢。而實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法操作簡便，檢測速度快，能夠在短時(shí)間內(nèi)給出準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，有效避免了傳統(tǒng)方法的局限性。六、實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的優(yōu)勢與應(yīng)用前景6.1方法優(yōu)勢總結(jié)實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法在食品中沙門氏菌和志賀氏菌的檢測方面展現(xiàn)出諸多顯著優(yōu)勢，為食品安全檢測領(lǐng)域帶來了新的變革。從檢測速度上看，該方法具有明顯的優(yōu)勢。傳統(tǒng)檢測方法如傳統(tǒng)培養(yǎng)法，整個(gè)檢測流程需要經(jīng)過增菌培養(yǎng)、分離純化、生化鑒定等多個(gè)步驟，每個(gè)步驟都需要特定的培養(yǎng)時(shí)間，通常整個(gè)檢測過程需要4-7天。而實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的檢測周期大幅縮短，從樣品處理到得出檢測結(jié)果，僅需數(shù)小時(shí)。在實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)于緊急需要檢測的食品樣品，如在食品安全突發(fā)事件中，實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法能夠快速給出檢測結(jié)果，為及時(shí)采取防控措施提供了有力支持。這使得監(jiān)管部門能夠在最短的時(shí)間內(nèi)對(duì)問題食品進(jìn)行處理，有效減少了食源性疾病的傳播風(fēng)險(xiǎn)，保障了公眾的飲食安全。靈敏度高是實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的另一大優(yōu)勢。本研究通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該方法對(duì)沙門氏菌和志賀氏菌的檢測限均可低至1×10^2CFU/mL。相比之下，傳統(tǒng)培養(yǎng)法的檢測限通常在1×10^3-1×10^4CFU/mL。較低的檢測限意味著實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法能夠檢測到更低濃度的病原菌，即使食品中病原菌的含量極少，也能被準(zhǔn)確檢測出來。這對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)食品中的病原菌污染具有重要意義，能夠有效預(yù)防食源性疾病的發(fā)生。在一些食品加工企業(yè)的原料檢測中，實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)原料中極微量的病原菌污染，避免了使用污染原料生產(chǎn)食品，從而保證了產(chǎn)品的質(zhì)量安全。特異性強(qiáng)也是實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的突出特點(diǎn)。通過精心設(shè)計(jì)針對(duì)沙門氏菌和志賀氏菌的特異性引物和探針，該方法能夠準(zhǔn)確地區(qū)分這兩種病原菌與其他非目標(biāo)菌。在特異性試驗(yàn)中，對(duì)多種非目標(biāo)菌株進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示均未產(chǎn)生明顯的熒光信號(hào)，有效避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。在復(fù)雜的食品樣品中，可能存在多種微生物，實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法憑借其高度的特異性，能夠準(zhǔn)確地檢測出目標(biāo)病原菌，為食品安全檢測提供了可靠的依據(jù)。在對(duì)含有多種微生物的混合食品樣品進(jìn)行檢測時(shí)，該方法能夠準(zhǔn)確識(shí)別出其中的沙門氏菌和志賀氏菌，而不會(huì)受到其他微生物的干擾。該方法還具備同時(shí)檢測多種病菌的能力，這是傳統(tǒng)檢測方法所無法比擬的。在一次檢測中，實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法能夠同時(shí)對(duì)食品中的沙門氏菌和志賀氏菌進(jìn)行檢測，大大提高了檢測效率。在實(shí)際的食品安全檢測中，食品往往可能受到多種病原菌的污染，傳統(tǒng)檢測方法通常只能針對(duì)單一病原菌進(jìn)行檢測，需要進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，耗費(fèi)大量的時(shí)間和資源。而實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的多病菌同時(shí)檢測能力，能夠在一次實(shí)驗(yàn)中完成對(duì)多種病原菌的檢測，減少了檢測次數(shù)和成本，提高了檢測的效率和準(zhǔn)確性。在對(duì)一批市場上的生鮮食品進(jìn)行檢測時(shí)，使用實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法可以同時(shí)檢測其中是否存在沙門氏菌和志賀氏菌，無需分別進(jìn)行兩次檢測，節(jié)省了時(shí)間和人力成本。實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的操作相對(duì)簡便。與傳統(tǒng)檢測方法復(fù)雜的操作流程相比，該方法只需進(jìn)行簡單的樣品DNA提取和實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA反應(yīng)體系的構(gòu)建，后續(xù)反應(yīng)過程由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)完成。這不僅減少了人工操作的環(huán)節(jié)，降低了人為誤差的可能性，還對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的專業(yè)技能要求相對(duì)較低。對(duì)于一些基層的食品安全檢測機(jī)構(gòu)或小型食品企業(yè)，實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的操作簡便性使其更容易推廣和應(yīng)用。在一些縣級(jí)食品安全檢測機(jī)構(gòu)中，實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)過簡單的培訓(xùn)，就能夠熟練掌握實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法的操作，開展食品中沙門氏菌和志賀氏菌的檢測工作。6.2在食品安全監(jiān)管中的應(yīng)用場景實(shí)時(shí)熒光雙重SRCA方法在食品安全監(jiān)管中具有廣泛的應(yīng)