賽默飛液相色譜（HPLC/UHPLC）培訓(xùn)課件第一章液相色譜基礎(chǔ)概述什么是液相色譜（LC）？液相色譜（LiquidChromatography,LC）是一種強大的分離分析技術(shù)，通過流動相（液體溶劑）攜帶樣品流經(jīng)固定相（色譜柱填料），利用不同化合物在兩相間的分配系數(shù)差異實現(xiàn)高效分離。該技術(shù)的核心原理基于化合物的物理化學(xué)性質(zhì)差異，包括極性、分子大小、電荷狀態(tài)等。當混合物通過色譜柱時，各組分以不同速率移動，最終在時間軸上分離開來，形成特征性的色譜峰。HPLC與UHPLC的區(qū)別顆粒尺寸差異HPLC色譜柱顆粒尺寸通常為3-5μm，而UHPLC采用小于2μm的亞二微米顆粒，顯著提高了柱效和分離能力。分離效率提升UHPLC分離效率更高，峰容量更大，可在更短時間內(nèi)實現(xiàn)更好的分離效果，分析時間通?？s短50-90%。溶劑消耗減少由于流速更低、柱體積更小，UHPLC溶劑消耗量僅為傳統(tǒng)HPLC的10-20%，更加環(huán)保經(jīng)濟。系統(tǒng)壓力要求液相色譜的主要應(yīng)用領(lǐng)域藥物分析用于藥物雜質(zhì)分析、含量測定、穩(wěn)定性研究、溶出度檢測等關(guān)鍵質(zhì)量控制環(huán)節(jié)。符合FDA、ICH等國際法規(guī)要求，是制藥行業(yè)的黃金標準。食品安全檢測檢測食品中的農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、食品添加劑、真菌毒素等有害物質(zhì)，保障公眾健康安全，滿足國家食品安全標準要求。環(huán)境監(jiān)測監(jiān)測水體、土壤、大氣中的有機污染物、持久性污染物、內(nèi)分泌干擾物等環(huán)境污染物，支持環(huán)境保護和生態(tài)評估工作。生物大分子分析賽默飛VanquishUHPLC系統(tǒng)Vanquish系列代表了液相色譜技術(shù)的巔峰，采用模塊化設(shè)計理念，提供卓越的靈活性和可擴展性。系統(tǒng)具備業(yè)界領(lǐng)先的壓力耐受能力、超低系統(tǒng)體積和智能化操作界面。其創(chuàng)新的雙梯度泵技術(shù)、高精度自動進樣器和多種檢測器選項，可滿足從常規(guī)分析到超高通量篩選的各種應(yīng)用需求。智能診斷功能實時監(jiān)控系統(tǒng)狀態(tài)，確保數(shù)據(jù)質(zhì)量和儀器可靠性。第二章賽默飛液相色譜系統(tǒng)組成了解液相色譜系統(tǒng)的各個模塊及其功能，是掌握儀器操作和維護的基礎(chǔ)。本章將詳細介紹賽默飛系統(tǒng)的硬件架構(gòu)和技術(shù)特點。主要硬件模塊介紹01泵系統(tǒng)高壓輸送流動相，提供穩(wěn)定的流速和壓力。賽默飛采用雙柱塞往復(fù)泵或四元低壓梯度泵，實現(xiàn)精確的流量控制和梯度混合。02自動進樣器精準樣品注入系統(tǒng)。采用高精度注射泵和六通閥切換技術(shù)，實現(xiàn)微升級進樣精度，支持多達數(shù)千個樣品的自動化分析。03色譜柱及柱溫箱分離的核心部件。柱溫箱提供±0.1°C的溫度控制精度，確保分離的重現(xiàn)性。支持快速加熱和強制冷卻功能。04檢測器信號檢測與轉(zhuǎn)換。提供紫外可見光檢測器（UV/VWD）、二極管陣列檢測器（DAD）、熒光檢測器（FLD）以及質(zhì)譜接口等多種選擇。賽默飛泵技術(shù)優(yōu)勢技術(shù)創(chuàng)新賽默飛泵系統(tǒng)采用專利的脈動補償技術(shù)和智能混合算法，確保流量穩(wěn)定性達到±0.07%RSD的行業(yè)領(lǐng)先水平。雙柱塞對稱設(shè)計有效降低脈動，保證峰形的完美對稱性。系統(tǒng)具備寬廣的流速范圍（0.001-8.000mL/min）和壓力范圍（最高1500bar），可適配從毛細管到制備級的各種應(yīng)用。在線脫氣裝置和溶劑混合優(yōu)化技術(shù)確保梯度精度。低脈動設(shè)計，基線噪聲<0.2×10??AU快速平衡，梯度延遲體積<100μL智能泄漏檢測和壓力限制保護支持多達四種溶劑的復(fù)雜梯度程序自動進樣器功能與維護自動化處理能力支持多種樣品瓶規(guī)格和樣品架配置，最多可容納數(shù)千個樣品位。具備樣品預(yù)處理功能，包括稀釋、混合、衍生化等。智能樣品追蹤和條碼識別功能提高實驗室效率。日常維護要點定期更換進樣針（建議每3-6個月或10,000次進樣），檢查轉(zhuǎn)子密封圈磨損情況。使用10%硝酸溶液清洗樣品通路，去除蛋白質(zhì)和鹽沉積。保持進樣口清潔，避免交叉污染。校準程序定期進行進樣體積校準（推薦頻率：每月或每1000次進樣）。使用標準品驗證進樣精度和準確度。校準程序包括針頭定位校準、閥切換時間優(yōu)化和進樣量驗證。故障排查技巧進樣量不準確：檢查注射器密封性和針頭堵塞。峰面積重復(fù)性差：檢查樣品混合均勻性和進樣閥泄漏。保留時間漂移：確認系統(tǒng)壓力穩(wěn)定和溫度控制。檢測器類型及應(yīng)用紫外可見光檢測器（UV/VWD）最常用的液相檢測器，適用于具有紫外吸收的化合物。工作波長190-800nm，靈敏度高達0.5×10??AU。適合藥物、農(nóng)藥、芳香化合物等分析。二極管陣列檢測器（DAD）可同時獲取全波長光譜信息，提供化合物定性鑒定的額外維度。支持峰純度檢測和光譜庫匹配。掃描速度可達80Hz，不損失分離效率。質(zhì)譜聯(lián)用接口實現(xiàn)高靈敏度和高選擇性檢測。電噴霧離子化（ESI）接口適合極性和離子化合物。提供分子量和結(jié)構(gòu)信息，是復(fù)雜基質(zhì)分析的首選技術(shù)。液相色譜系統(tǒng)架構(gòu)完整的液相色譜系統(tǒng)由溶劑輸送、樣品導(dǎo)入、分離、檢測和數(shù)據(jù)處理五大部分組成。流動相從溶劑瓶經(jīng)泵加壓后與樣品在色譜柱中混合分離，分離后的組分進入檢測器產(chǎn)生信號，最終由數(shù)據(jù)系統(tǒng)采集處理生成色譜圖。系統(tǒng)中的每個連接點、管路內(nèi)徑和死體積都經(jīng)過精心設(shè)計，以最小化峰展寬和保持分離效率。模塊化設(shè)計允許根據(jù)應(yīng)用需求靈活配置和升級系統(tǒng)。第三章液相色譜方法開發(fā)與優(yōu)化方法開發(fā)是液相色譜應(yīng)用的核心技能?？茖W(xué)的方法開發(fā)流程能夠大幅縮短開發(fā)時間，提高方法的穩(wěn)健性和可靠性。方法開發(fā)基本流程化合物特性分析了解目標化合物的pKa、logP、分子量、溶解性等理化性質(zhì)，預(yù)測最適合的分離模式。固定相選擇根據(jù)化合物極性選擇C18、C8、苯基、氨基等不同鍵合相?？紤]柱長、內(nèi)徑和顆粒尺寸。流動相設(shè)計選擇合適的有機相和水相組成，優(yōu)化pH值和添加劑。設(shè)計等度或梯度洗脫程序。參數(shù)優(yōu)化調(diào)整柱溫、流速、進樣量等參數(shù)，平衡分離度、分析時間和峰形。系統(tǒng)的方法開發(fā)通常需要2-5天時間，但通過質(zhì)量源于設(shè)計（QbD）理念和計算機輔助優(yōu)化可以大幅提高效率。賽默飛方法開發(fā)實用技巧快速篩選策略使用賽默飛的方法開發(fā)工具包，通過色譜柱篩選套裝快速評估不同固定相的分離效果。Accucore色譜柱系列采用固相核心技術(shù)，在較低背壓下提供UHPLC級別的效率。軟件輔助優(yōu)化Chromeleon色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)集成的方法開發(fā)向?qū)Э勺詣由蓛?yōu)化方案。輸入分離目標和約束條件，軟件自動計算最優(yōu)梯度、溫度和流速組合，減少試錯次數(shù)。方法轉(zhuǎn)移注意事項使用等效色譜柱和相同品牌溶劑調(diào)整流速補償系統(tǒng)體積差異驗證關(guān)鍵分離對的分離度進行系統(tǒng)適用性測試確認樣品制備與前處理1樣品溶解選擇與流動相相容的溶劑，避免沉淀和峰形異常。必要時使用超聲或渦旋輔助溶解。2過濾除雜使用0.22μm或0.45μm濾膜去除顆粒物，保護色譜柱和進樣閥。選擇合適材質(zhì)避免樣品吸附。3固相萃?。⊿PE）用于復(fù)雜基質(zhì)的凈化和富集，提高檢測靈敏度和選擇性。選擇合適的SPE柱和洗脫條件。4衍生化反應(yīng)對于不具備檢測基團的化合物，進行柱前或柱后衍生化，提高檢測響應(yīng)。關(guān)鍵提示：樣品前處理是保證數(shù)據(jù)質(zhì)量的第一道關(guān)口。不當?shù)那疤幚砜赡軐?dǎo)致色譜柱污染、峰形拖尾、重復(fù)性差等問題。建議制定標準化的樣品處理流程并嚴格執(zhí)行。方法驗證與系統(tǒng)適用性測試專屬性/選擇性驗證方法能夠準確測定目標化合物而不受基質(zhì)干擾。通過空白樣品、安慰劑樣品和加標樣品對比確認。線性與范圍建立至少5個濃度點的校準曲線，相關(guān)系數(shù)r≥0.999。線性范圍應(yīng)覆蓋實際樣品的預(yù)期濃度。準確度與精密度準確度通常要求回收率98-102%。精密度包括重復(fù)性（RSD<2%）和中間精密度（RSD<3%）評估。檢測限與定量限LOD信噪比≥3:1，LOQ信噪比≥10:1。通過標準偏差法或信噪比法確定。穩(wěn)定性評估樣品溶液、標準溶液在不同條件下的穩(wěn)定性，包括室溫、冷藏和凍融循環(huán)。系統(tǒng)適用性每次分析前檢查保留時間、分離度、理論塔板數(shù)、拖尾因子等參數(shù)，確保系統(tǒng)處于良好狀態(tài)。第四章儀器維護與故障診斷預(yù)防性維護和及時的故障診斷是保證儀器長期穩(wěn)定運行的關(guān)鍵。本章將介紹實用的維護技巧和常見問題的解決方案。日常維護要點1溶劑系統(tǒng)維護每周更換溶劑過濾頭，防止顆粒進入泵系統(tǒng)。使用HPLC級或更高純度溶劑，避免緩沖鹽結(jié)晶。長期不用時用純水或甲醇沖洗系統(tǒng)。2泵密封圈更換根據(jù)壓力波動和泄漏情況判斷，通常3-6個月更換一次。使用原廠配件確保密封性能。更換后需進行泄漏測試和壓力校準。3進樣系統(tǒng)保養(yǎng)每月用50%異丙醇溶液清洗進樣針和樣品通路。檢查針頭彎曲和磨損情況。樣品盤和針座保持清潔干燥，避免腐蝕。4色譜柱維護使用保護柱延長分析柱壽命。定期反沖色譜柱去除強保留雜質(zhì)。存放時用合適溶劑封存，避免固定相塌陷和柱效損失。常見故障及排查泵壓力異常壓力過高：檢查在線過濾器堵塞保護柱或色譜柱污染管路連接處堵塞壓力過低：泵密封圈磨損泄漏單向閥損壞管路連接松動基線問題噪聲增大：流動相未充分脫氣檢測器燈能量衰減流通池污染或氣泡基線漂移：柱溫箱溫度不穩(wěn)定流動相配比誤差色譜柱平衡不充分進樣系統(tǒng)故障堵塞現(xiàn)象：樣品過濾不充分進樣針內(nèi)壁沉積轉(zhuǎn)子密封圈碎屑泄漏問題：轉(zhuǎn)子密封圈磨損定子表面劃傷連接管路老化賽默飛硬件維護實操演示泵泄漏測試程序關(guān)閉出口閥，設(shè)定壓力至400bar并保持5分鐘。觀察壓力下降速率，標準為<5bar/min。如超出范圍，檢查密封圈和單向閥狀態(tài)。進樣閥拆解清洗使用專用工具拆卸轉(zhuǎn)子和定子組件。用軟布蘸取50%異丙醇擦拭密封表面，檢查劃痕和磨損。安裝新密封圈時涂抹少量硅脂。檢測器燈管更換關(guān)閉電源并等待冷卻。按說明書取出舊燈管，安裝新燈管時避免觸碰石英窗口。更換后預(yù)熱30分鐘并進行波長校準。安全提示：維護操作前務(wù)必關(guān)閉電源并釋放系統(tǒng)壓力。使用原廠配件和工具，遵循標準操作程序。不熟悉的操作應(yīng)聯(lián)系賽默飛技術(shù)支持。軟件操作與數(shù)據(jù)處理基礎(chǔ)Chromeleon色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)賽默飛ChromeleonCDS是業(yè)界領(lǐng)先的色譜數(shù)據(jù)管理平臺，提供直觀的用戶界面和強大的數(shù)據(jù)處理功能。核心功能模塊：Cobra向?qū)В褐悄芑瘍x器控制，簡化方法設(shè)置和序列創(chuàng)建流程SmartPeaks?：自動峰檢測和積分，減少人工干預(yù)eWorkflow：集成樣品管理、數(shù)據(jù)采集、處理和報告的完整工作流法規(guī)遵從：滿足FDA21CFRPart11和數(shù)據(jù)完整性要求系統(tǒng)支持多儀器控制、遠程訪問和云端數(shù)據(jù)同步，實現(xiàn)實驗室的數(shù)字化轉(zhuǎn)型?；静僮髁鞒虇酉到y(tǒng)并檢查儀器狀態(tài)創(chuàng)建或加載分析方法設(shè)置樣品序列和進樣順序啟動序列并監(jiān)控運行審核數(shù)據(jù)和峰積分結(jié)果生成標準化報告數(shù)據(jù)歸檔和備份第五章液相色譜典型應(yīng)用案例通過實際案例深入理解液相色譜技術(shù)的應(yīng)用價值。本章將展示藥物、食品、環(huán)境等領(lǐng)域的成功應(yīng)用實例。藥物分析案例藥物雜質(zhì)檢測與含量測定采用AccucoreC18色譜柱（100×2.1mm,2.6μm）分析某頭孢類抗生素原料藥。流動相為乙腈-0.05M磷酸鹽緩沖液（pH3.0）梯度洗脫，DAD檢測波長254nm。方法能夠在8分鐘內(nèi)分離主成分和7個相關(guān)雜質(zhì)，雜質(zhì)檢出限達0.05%，滿足藥典要求。主成分含量測定的RSD<0.5%，加標回收率99.2-100.8%。該方法已成功應(yīng)用于三批次驗證和穩(wěn)定性研究，數(shù)據(jù)穩(wěn)健可靠。生物制藥蛋白質(zhì)純度分析使用MAbPacSEC-1色譜柱進行單克隆抗體聚集體分析。流動相為50mM磷酸鉀緩沖液（pH6.8）含200mM氯化鈉，等度洗脫。UV檢測280nm，流速0.4mL/min。方法能夠有效分離單體、二聚體和高分子量聚集體，分離度>2.0。單體峰面積百分比的重復(fù)性RSD<1%。該方法適用于抗體藥物的質(zhì)量控制和工藝優(yōu)化，支持生物制藥的發(fā)展。食品安全檢測案例農(nóng)藥殘留多殘留篩查建立QuEChERS前處理結(jié)合UHPLC-MS/MS的方法，同時測定水果蔬菜中150種農(nóng)藥殘留。樣品用乙腈提取，經(jīng)C18和PSA凈化后進樣分析。采用HypersilGOLDC18色譜柱（100×2.1mm,1.9μm），乙腈-5mM甲酸銨梯度洗脫，分析時間12分鐘。ESI正負離子切換模式，MRM檢測。方法線性范圍0.5-100μg/kg，定量限達到歐盟標準要求。基質(zhì)加標回收率70-120%，RSD<15%。已應(yīng)用于數(shù)千個樣品的日常檢測。食品添加劑定量分析開發(fā)HPLC-DAD方法同時測定飲料中的10種合成色素。樣品經(jīng)聚酰胺吸附凈化后直接進樣。使用AcclaimC18色譜柱（250×4.6mm,5μm），甲醇-乙酸銨緩沖液梯度洗脫。DAD全波長掃描（200-700nm），各色素在最大吸收波長處定量。方法能夠?qū)崿F(xiàn)檸檬黃、日落黃、胭脂紅等色素的基線分離，線性范圍0.5-50mg/L，回收率95-105%。滿足國家食品安全標準的檢測要求。環(huán)境監(jiān)測案例水體有機污染物分析采用固相萃取-UHPLC-MS/MS方法檢測地表水中的多環(huán)芳烴（PAHs）。水樣經(jīng)HLB固相萃取柱富集1000倍后進樣。HypersilGOLDaQC18色譜柱分離，乙腈-水梯度洗脫，APCI離子源MRM檢測。方法檢出限達到0.1-1.0ng/L，滿足國家地表水環(huán)境質(zhì)量標準。土壤有機污染物檢測建立索氏提取-柱層析凈化-HPLC-FLD方法測定土壤中的苯并芘等PAHs。土樣用二氯甲烷提取，硅膠柱凈化后濃縮進樣。熒光檢測器（激發(fā)260nm，發(fā)射430nm）提供高靈敏度和選擇性。方法回收率85-115%，檢出限0.01mg/kg，用于污染場地調(diào)查和修復(fù)效果評估。賽默飛LC-MS聯(lián)用技術(shù)簡介技術(shù)優(yōu)勢與特點液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）結(jié)合了液相色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性檢測優(yōu)勢，是現(xiàn)代分析化學(xué)最強大的工具之一。超高靈敏度：檢出限可達pg-fg級別，比UV檢測提高2-3個數(shù)量級結(jié)構(gòu)鑒定：提供分子量和碎片離子信息，實現(xiàn)化合物確證高選擇性：通過多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式消除基質(zhì)干擾寬動態(tài)范圍：線性范圍可達5個數(shù)量級多組分分析：一次進樣可同時檢測數(shù)百種化合物賽默飛提供QExactive、TSQ系列等多款高性能質(zhì)譜平臺，搭配VanquishUHPLC系統(tǒng)，實現(xiàn)無縫對接和最優(yōu)性能。接口技術(shù)電噴霧離子化（ESI）：適用于極性、離子性化合物，是生物分子分析的首選。大氣壓化學(xué)離子化（APCI）：適用于中低極性化合物，熱穩(wěn)定性好。H-ESI探頭：賽默飛專利技術(shù)，提高離子化效率和穩(wěn)定性。第六章培訓(xùn)總結(jié)與資源推薦恭喜您完成賽默飛液相色譜技術(shù)培訓(xùn)！持續(xù)學(xué)習(xí)和實踐是提升分析技能的關(guān)鍵。讓我們回顧重點并探索更多學(xué)習(xí)資源。賽默飛技術(shù)支持與學(xué)習(xí)資源官方學(xué)習(xí)中心訪問賽默飛官網(wǎng)學(xué)習(xí)中心，獲取免費在線課程、應(yīng)用文獻、操作視頻和技術(shù)手冊。涵蓋液相色譜、質(zhì)譜、樣品前處理等全方位內(nèi)容。網(wǎng)址：/lear