宿主細胞對小反芻獸疫病毒天然免疫應答機制探秘：以山羊細胞模型為例一、引言1.1研究背景與意義小反芻獸疫（PestedesPetitsRuminants，PPR），又被稱為羊瘟，是由小反芻獸疫病毒（PestedesPetitsRuminantsVirus，PPRV）引發(fā)的一種具有高接觸傳染性的疫病，主要感染山羊、綿羊等小反芻動物。該病以發(fā)熱、口炎、腹瀉和肺炎為典型特征，給全球養(yǎng)羊業(yè)帶來了沉重的打擊，造成了巨大的經濟損失。自1942年小反芻獸疫在西非科特迪瓦首次被報道以來，其疫情呈現(xiàn)出不斷擴散蔓延的趨勢，目前已廣泛分布于亞、非等地區(qū)的眾多國家。我國在2007年首次于西藏阿里地區(qū)發(fā)現(xiàn)小反芻獸疫疫情，隨后在2013-2014年，新疆等地再次暴發(fā)疫情，并迅速擴散至全國20多個省市自治區(qū)，對我國養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展構成了嚴重威脅。小反芻獸疫的傳播對養(yǎng)羊業(yè)造成的危害是多方面且極其嚴重的。在經濟層面，患病動物的高發(fā)病率和死亡率直接導致養(yǎng)殖數(shù)量大幅減少，使得羊肉、羊奶等畜產品的產量急劇下降，嚴重影響了養(yǎng)殖戶的經濟收益。同時，為了防控疫情，需要投入大量的人力、物力和財力用于疫情監(jiān)測、隔離封鎖、消毒以及疫苗接種等工作，這無疑進一步增加了養(yǎng)殖成本。在畜牧業(yè)發(fā)展方面，小反芻獸疫的流行破壞了養(yǎng)羊業(yè)的正常生產秩序，阻礙了產業(yè)的規(guī)模化和集約化發(fā)展進程。許多養(yǎng)殖戶因懼怕疫情而減少養(yǎng)殖規(guī)模，甚至放棄養(yǎng)羊業(yè)，導致產業(yè)發(fā)展陷入困境。從國際貿易角度來看，小反芻獸疫作為世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的法定報告動物疫病，一旦某個國家或地區(qū)發(fā)生疫情，必然會遭受國際社會的貿易限制，畜產品的出口受阻，嚴重影響了國際市場的競爭力和貿易收益。在疫病防控中，深入研究宿主細胞對小反芻獸疫病毒的天然免疫應答機制具有至關重要的意義，這是防控疫病的關鍵所在。天然免疫作為機體抵御病毒入侵的第一道防線，能夠在病毒感染的早期迅速啟動免疫反應，對病毒的復制和傳播進行有效的限制。當PPRV侵入宿主細胞后，宿主細胞會通過模式識別受體（PRRs）識別病毒的病原體相關分子模式（PAMPs），進而激活一系列復雜的信號通路，誘導產生干擾素（IFNs）和其他細胞因子，這些物質能夠激活免疫細胞，增強機體的免疫防御能力。通過對這一過程的深入探究，我們能夠全面了解宿主細胞與病毒之間的相互作用機制，為開發(fā)更加有效的防控策略提供堅實的理論基礎。一方面，深入研究天然免疫應答機制有助于我們尋找新的抗病毒靶點。例如，通過對信號通路中關鍵分子的研究，我們可以發(fā)現(xiàn)能夠調節(jié)免疫反應強度和方向的關鍵節(jié)點，以此為靶點開發(fā)特異性的藥物或生物制劑，實現(xiàn)對病毒感染的精準干預。另一方面，了解天然免疫應答機制還有助于優(yōu)化疫苗的設計和應用。疫苗的作用原理是通過模擬病毒感染，激發(fā)機體的免疫反應，從而產生對病毒的免疫力?；趯μ烊幻庖邞饳C制的深入理解，我們可以優(yōu)化疫苗的抗原設計，提高疫苗的免疫原性和安全性，增強疫苗的保護效果。同時，還可以根據不同宿主的免疫特點，制定個性化的免疫程序，提高疫苗的防控效果。此外，研究宿主細胞對小反芻獸疫病毒的天然免疫應答機制，對于豐富和完善動物免疫學理論體系也具有重要的學術價值。它能夠幫助我們更好地理解動物機體的免疫防御機制，為其他動物疫病的研究提供有益的借鑒和參考，推動整個動物疫病防控領域的發(fā)展和進步。1.2國內外研究現(xiàn)狀在國外，小反芻獸疫病毒與宿主細胞互作以及天然免疫應答的研究開展較早，取得了較為豐富的成果。在病毒與宿主細胞互作方面，研究人員深入探究了病毒的入侵機制，發(fā)現(xiàn)PPRV主要通過其表面的血凝蛋白（H蛋白）與宿主細胞表面的受體結合，進而介導病毒進入細胞。例如，H蛋白能夠特異性地識別宿主細胞表面的信號淋巴細胞激活分子（SLAM），二者的結合是病毒感染的關鍵起始步驟。相關研究還揭示了病毒在細胞內的復制和轉錄過程，以及病毒蛋白與宿主細胞蛋白之間的相互作用網絡，為理解病毒的致病機制提供了重要線索。在天然免疫應答方面，國外學者對模式識別受體（PRRs）識別PPRV的機制進行了深入研究。研究表明，Toll樣受體（TLRs）和維甲酸誘導基因I（RIG-I）樣受體（RLRs）等PRRs在識別PPRV病原體相關分子模式（PAMPs）中發(fā)揮著關鍵作用。當PRRs識別到病毒的PAMPs后，會激活下游的信號通路，誘導干擾素（IFNs）和其他細胞因子的產生。例如，RLRs中的RIG-I能夠識別PPRV的雙鏈RNA，通過線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）激活核因子κB（NF-κB）和干擾素調節(jié)因子3（IRF3）等轉錄因子，進而促進IFN-β的表達。此外，國外研究還關注了病毒感染對宿主細胞自噬、凋亡等過程的影響，以及這些過程在天然免疫應答中的作用。國內對小反芻獸疫的研究起步相對較晚，但近年來隨著疫情的出現(xiàn)，相關研究也在迅速開展并取得了一定的進展。在病毒與宿主細胞互作方面，國內學者通過對國內流行毒株的研究，進一步明確了病毒的生物學特性和感染特點，為深入了解病毒的致病機制提供了本土數(shù)據支持。在天然免疫應答方面，國內研究主要圍繞信號通路的激活和調控展開，對關鍵分子的功能和作用機制進行了探索。例如，有研究發(fā)現(xiàn)PPRV感染可通過激活NF-κB信號通路，誘導促炎細胞因子的表達，從而引發(fā)機體的炎癥反應。同時，國內也在積極開展針對小反芻獸疫的疫苗和診斷技術研究，以提高疫病的防控水平。然而，當前關于宿主細胞對小反芻獸疫病毒天然免疫應答機制的研究仍存在一些不足之處。在病毒與宿主細胞互作的研究中，雖然對病毒入侵和復制的基本過程有了一定了解，但對于一些細節(jié)和關鍵環(huán)節(jié)仍不清楚。例如，病毒蛋白與宿主細胞蛋白之間具體的相互作用方式和功能，以及這些相互作用如何影響病毒的感染和致病過程，還需要進一步深入研究。在天然免疫應答方面，雖然對一些主要的信號通路和關鍵分子有了一定認識，但對于不同信號通路之間的相互調控和協(xié)同作用機制，以及天然免疫應答與適應性免疫應答之間的關聯(lián)，研究還不夠深入全面。此外，目前的研究大多集中在體外細胞模型和動物實驗，對于在自然感染條件下宿主細胞的天然免疫應答機制，還需要更多的現(xiàn)場研究和臨床數(shù)據支持。這些不足為未來的研究指明了方向，有待進一步深入探究以完善對小反芻獸疫病毒與宿主細胞天然免疫應答機制的認識。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入解析宿主細胞對小反芻獸疫病毒的天然免疫應答機制，從分子、細胞和整體動物水平全方位揭示宿主與病毒之間的相互作用規(guī)律。通過對這一機制的深入研究，期望能夠發(fā)現(xiàn)新的抗病毒靶點，為開發(fā)更加有效的小反芻獸疫防控策略提供堅實的理論基礎，從而為養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展保駕護航。在研究方法上，本研究將采用多種先進的技術手段，實現(xiàn)多維度、深層次的探究。運用基因編輯技術，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對宿主細胞中的關鍵基因進行精準敲除或編輯，以此明確這些基因在天然免疫應答中的具體功能。利用蛋白質組學技術，全面分析病毒感染前后宿主細胞蛋白質表達譜的變化，篩選出差異表達的蛋白質，深入研究它們在免疫應答過程中的作用機制。結合單細胞測序技術，從單細胞層面解析不同細胞類型在天然免疫應答中的異質性，揭示免疫細胞的分化和功能調控機制，從而為深入理解天然免疫應答提供更細致、全面的信息。在研究角度上，本研究將突破傳統(tǒng)研究的局限性，從多個新穎的角度展開探索。不僅關注經典的免疫信號通路，還將深入研究非編碼RNA在天然免疫應答中的調控作用。非編碼RNA，如微小RNA（miRNA）和長鏈非編碼RNA（lncRNA），雖然不編碼蛋白質，但在基因表達調控中發(fā)揮著關鍵作用。通過研究它們與免疫相關基因的相互作用，有望揭示新的免疫調控機制。同時，本研究將探討腸道微生物群與宿主天然免疫應答之間的關聯(lián)。腸道微生物群作為宿主的“第二基因組”，對宿主的免疫功能有著重要影響。研究腸道微生物群在小反芻獸疫病毒感染過程中的變化，以及它們如何通過與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用影響病毒感染的進程，將為疫病防控提供新的思路和方法。此外，本研究還將關注環(huán)境因素對宿主天然免疫應答的影響，綜合考慮環(huán)境因素與宿主、病毒之間的相互作用，為制定更加全面、有效的防控策略提供科學依據。二、小反芻獸疫病毒概述2.1病毒基本特征小反芻獸疫病毒（PPRV）在病毒分類學上隸屬副粘病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbillivirus）。該屬成員還包括牛瘟病毒（RPV）、犬瘟熱病毒（CDV）、海豚麻疹病毒（DMV）、鼠海豹麻疹病毒（PDV）以及麻疹病毒（MV）等，這些病毒在結構和抗原性上具有一定的相似性。PPRV與牛瘟病毒的關系尤為密切，二者在免疫學和生物學特性上存在諸多相似之處，這也使得在早期的研究中，小反芻獸疫曾被誤認為是牛瘟的一種特殊形式。PPRV的病毒粒子呈現(xiàn)出多形性，通常為粗糙的球形，其直徑范圍在130-390nm之間。病毒粒子的最外層是一層厚度約為8.5-14.5nm的囊膜，囊膜來源于宿主細胞的細胞膜，在病毒的感染和傳播過程中發(fā)揮著重要作用，不僅能夠保護病毒的核酸，還參與了病毒與宿主細胞的識別和融合過程。囊膜表面布滿了長度為8-15nm的纖突，這些纖突由病毒的血凝蛋白（H蛋白）和融合蛋白（F蛋白）組成，H蛋白具有神經氨酸酶和血凝素活性，在病毒與宿主細胞表面受體的結合過程中發(fā)揮關鍵作用，決定了病毒的宿主范圍和感染特異性；F蛋白則在病毒與宿主細胞的融合以及病毒進入細胞的過程中起著不可或缺的作用，促進病毒核衣殼進入宿主細胞內，從而啟動病毒的感染進程。病毒粒子內部是呈螺旋中空桿狀的核衣殼，核衣殼由核衣殼蛋白（N蛋白）、磷蛋白（P蛋白）和大蛋白（L蛋白）組成。N蛋白是構成核衣殼的主要成分，它通過自我組裝形成核衣殼粒子，將病毒的基因組RNA緊密包裹其中，保護RNA免受外界核酸酶的降解。N蛋白還與P蛋白和L蛋白協(xié)同作用，共同調控病毒RNA的轉錄和復制過程，確保病毒遺傳信息的準確傳遞和表達。P蛋白在病毒的轉錄和復制過程中起著輔助作用，它與N蛋白和L蛋白相互作用，穩(wěn)定病毒的轉錄和復制復合物，促進病毒基因的轉錄和翻譯。L蛋白是一種依賴于RNA的RNA聚合酶，具有多種酶活性，包括RNA聚合酶活性、甲基轉移酶活性和鳥苷酸轉移酶活性等，在病毒RNA的合成、加帽和甲基化修飾等過程中發(fā)揮著核心作用，保證病毒RNA的正常合成和成熟，為病毒的增殖提供必要的遺傳物質。PPRV的基因組為單股負鏈RNA，長度約為15948nt。基因組的3′末端為基因組啟動子區(qū)，5′末端為反向基因組啟動子區(qū)，這兩個區(qū)域在病毒基因的轉錄和復制起始過程中發(fā)揮著關鍵的調控作用。基因組上依次排列著6個基因，順序為3′-N-P-M-F-H-L-5′，分別編碼6種結構蛋白，即核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝蛋白（H）和大蛋白（L）。除了這6種結構蛋白外，P基因還通過不同的mRNA剪接方式編碼兩個非結構蛋白C和V。這些蛋白在病毒的生命周期中各自承擔著獨特而重要的功能。N蛋白作為核衣殼的主要組成部分，不僅對病毒基因組起到保護作用，還在病毒的轉錄和復制過程中發(fā)揮著關鍵的調控作用，同時它也是一種保守性較強的免疫原性蛋白，當機體感染病毒時，N蛋白能夠刺激機體產生強烈的抗體反應，在體液免疫中發(fā)揮重要作用，并且N蛋白上還含有T細胞表位，能夠激活T細胞，參與細胞免疫反應，對清除病毒感染的細胞具有重要意義。P蛋白與N蛋白和L蛋白相互協(xié)作，共同參與病毒RNA的轉錄和復制過程，同時還可能在病毒蛋白的運輸和定位等方面發(fā)揮作用。M蛋白位于病毒囊膜和核衣殼之間，它在病毒粒子的組裝和出芽過程中起著關鍵作用，通過與囊膜蛋白和核衣殼蛋白的相互作用，介導病毒粒子的形成和釋放，保證病毒的正常形態(tài)和結構。F蛋白和H蛋白位于病毒囊膜表面，F(xiàn)蛋白負責介導病毒與宿主細胞的融合，使病毒能夠進入宿主細胞內，啟動感染過程；H蛋白則負責識別宿主細胞表面的受體，決定了病毒的宿主范圍和感染特異性，二者協(xié)同作用，確保病毒能夠成功感染宿主細胞。L蛋白作為病毒的RNA聚合酶，負責病毒基因組RNA的轉錄和復制，它以病毒基因組RNA為模板，合成病毒的mRNA和子代基因組RNA，為病毒的增殖提供遺傳物質基礎。非結構蛋白C和V則在病毒感染宿主細胞的過程中發(fā)揮著多種調控作用，它們可以通過與宿主細胞的蛋白相互作用，干擾宿主細胞的正常生理功能，逃避宿主的免疫防御機制，促進病毒的感染和復制。2.2病毒的傳播與致病機制小反芻獸疫病毒主要通過直接接觸和間接接觸的方式在易感動物之間傳播。在直接接觸傳播中，患病動物與健康動物的近距離接觸是病毒傳播的重要途徑。例如，當患病動物與健康動物相互舔舐、摩擦或共同進食、飲水時，病毒可以通過口腔、鼻腔、眼睛等黏膜部位進入健康動物體內。病羊在咳嗽、打噴嚏時，會將含有病毒的飛沫噴射到空氣中，周圍的健康動物吸入這些飛沫后，就容易感染病毒。這種傳播方式在養(yǎng)殖密度較高的羊群中尤為常見，如在羊舍內，羊只之間距離較近，一旦有患病羊只，病毒就能夠迅速傳播開來。間接接觸傳播則主要是通過被病毒污染的環(huán)境、物品等媒介進行傳播。病羊的鼻液、糞尿等分泌物和排泄物中含有大量的病毒，這些病毒可以污染飼料、飲水、衣物、工具、圈舍和牧場等。健康動物接觸到被污染的飼料和飲水后，病毒會隨著食物和水進入其體內，從而引發(fā)感染。如果養(yǎng)殖人員在接觸病羊后，沒有對衣物和工具進行徹底消毒，就直接進入健康羊群的圈舍，也可能將病毒傳播給健康羊只。在一些養(yǎng)殖場中，由于缺乏嚴格的消毒措施，飼養(yǎng)工具混用，導致病毒在不同羊群之間傳播，造成疫情的擴散。小反芻獸疫病毒的易感動物主要為山羊、綿羊等小反芻動物，其中山羊的易感性相對更高，感染后臨床癥狀也更為嚴重。不同品種的山羊和綿羊對病毒的易感性存在一定差異，一些品種可能更容易感染病毒，且發(fā)病后的癥狀更為明顯。例如，某些本地品種的山羊由于自身免疫力較低，在接觸病毒后更容易發(fā)病，且病情發(fā)展迅速。除了山羊和綿羊，美國白尾鹿等野生動物也可能感染小反芻獸疫病毒。雖然豬和牛也可被感染，但通常無臨床癥狀，并且豬和牛感染后不能將該病傳給其他動物，在小反芻獸疫的傳播過程中，它們一般不會起到傳播病毒的作用。當小反芻獸疫病毒入侵宿主后，會引發(fā)一系列復雜的致病機制，導致宿主出現(xiàn)各種臨床癥狀。病毒首先會在宿主的呼吸道和消化道黏膜上皮細胞中吸附和侵入，利用細胞內的物質和能量進行大量的復制和繁殖。隨著病毒的不斷增殖，感染細胞會受到破壞，導致呼吸道和消化道的正常生理功能受損。病毒感染呼吸道上皮細胞后，會引起鼻液增多、咳嗽、呼吸困難等癥狀；感染消化道上皮細胞則會導致口腔黏膜潰瘍、腹瀉等癥狀。在感染初期，病毒會在局部淋巴結中大量復制，隨后進入血液循環(huán)，形成病毒血癥，進而擴散到全身各個組織和器官，如脾臟、肝臟、肺臟等，導致這些組織器官的功能障礙。病毒感染還會引發(fā)宿主的免疫反應，然而，小反芻獸疫病毒具有免疫抑制作用，能夠干擾宿主的正常免疫應答，使得宿主的免疫系統(tǒng)難以有效地清除病毒。病毒感染后，會抑制宿主細胞產生干擾素等抗病毒細胞因子，削弱機體的抗病毒能力。病毒還可能通過感染免疫細胞，如淋巴細胞和巨噬細胞，破壞免疫細胞的功能，導致免疫細胞無法正常發(fā)揮免疫監(jiān)視和免疫防御作用，從而使病毒能夠在宿主體內持續(xù)存在和傳播，進一步加重病情。在病毒的持續(xù)感染和免疫抑制作用下，宿主容易繼發(fā)其他細菌和病毒的感染，引發(fā)多種并發(fā)癥，如肺炎、腸炎等，這些并發(fā)癥會進一步損害宿主的健康，增加病死率。2.3對養(yǎng)羊業(yè)的危害及防控現(xiàn)狀小反芻獸疫病毒對養(yǎng)羊業(yè)的危害極為嚴重，給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經濟損失。在我國，2013-2014年小反芻獸疫疫情的暴發(fā)就是一個典型案例。此次疫情在新疆等地爆發(fā)后，迅速蔓延至全國20多個省市自治區(qū)，大量羊只感染發(fā)病，發(fā)病率和死亡率居高不下。許多養(yǎng)殖戶的羊群遭受重創(chuàng)，養(yǎng)殖數(shù)量急劇減少，經濟損失慘重。據統(tǒng)計，僅在疫情嚴重的部分地區(qū)，養(yǎng)殖戶的直接經濟損失就高達數(shù)千萬元，包括羊只死亡造成的資產損失、治療費用以及為防控疫情而投入的人力、物力和財力等。一些小型養(yǎng)殖場由于無法承受疫情帶來的巨大損失，不得不倒閉關門，養(yǎng)殖戶多年的心血付諸東流。除了直接的經濟損失，小反芻獸疫還對養(yǎng)羊業(yè)的產業(yè)鏈產生了深遠的負面影響。由于疫情導致羊只數(shù)量減少，羊肉、羊奶等畜產品的供應短缺，價格出現(xiàn)大幅波動，影響了市場的穩(wěn)定。畜產品加工企業(yè)因原材料供應不足，生產受到限制，導致企業(yè)效益下滑，部分企業(yè)甚至面臨停產的困境。在國際貿易方面，小反芻獸疫作為世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的法定報告動物疫病，一旦某個國家或地區(qū)發(fā)生疫情，必然會遭受國際社會的貿易限制。我國在疫情暴發(fā)期間，畜產品的出口受到了嚴重阻礙，國際市場份額大幅下降，這不僅給相關企業(yè)帶來了巨大的經濟損失，也對我國養(yǎng)羊業(yè)的國際形象造成了負面影響。針對小反芻獸疫的嚴峻形勢，我國采取了一系列嚴格且全面的防控措施。在疫苗免疫方面，政府積極推廣小反芻獸疫活疫苗的接種工作，要求養(yǎng)殖戶按照規(guī)定的免疫程序對羊只進行免疫接種，以提高羊群的免疫力。通過大規(guī)模的疫苗接種，在一定程度上有效降低了疫情的發(fā)生率。在疫情監(jiān)測方面，建立了完善的疫情監(jiān)測體系，加強了對養(yǎng)殖場、交易市場等重點場所的監(jiān)測力度，及時發(fā)現(xiàn)和排查疫情隱患。一旦發(fā)現(xiàn)疫情，立即啟動應急預案，采取隔離、封鎖、撲殺、無害化處理等措施，防止疫情的擴散蔓延。同時，加強了對養(yǎng)殖人員的培訓和宣傳教育，提高他們的防疫意識和防控能力，使其能夠及時發(fā)現(xiàn)疫情并采取正確的防控措施。然而，在小反芻獸疫的防控過程中，仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。疫苗質量和免疫效果的穩(wěn)定性是一個重要問題。部分疫苗在生產過程中可能存在質量不穩(wěn)定的情況，導致免疫效果不佳，無法有效保護羊只免受病毒感染。不同地區(qū)的養(yǎng)殖環(huán)境和羊只品種存在差異，對疫苗的免疫應答也不盡相同，這給疫苗的選擇和使用帶來了一定的困難。養(yǎng)殖管理水平參差不齊也是一個突出問題。一些養(yǎng)殖戶缺乏科學的養(yǎng)殖管理知識，養(yǎng)殖環(huán)境簡陋，衛(wèi)生條件差，養(yǎng)殖密度過高，這些因素都增加了病毒傳播的風險。部分養(yǎng)殖戶對防疫工作不夠重視，存在僥幸心理，不嚴格按照免疫程序進行接種，甚至在疫情發(fā)生后不及時報告和采取防控措施，導致疫情擴散。此外，小反芻獸疫病毒的變異也給防控工作帶來了新的挑戰(zhàn)。隨著病毒的不斷變異，其生物學特性和致病機制可能發(fā)生改變，現(xiàn)有的防控措施可能無法有效應對，需要不斷加強對病毒變異的監(jiān)測和研究，及時調整防控策略。三、宿主細胞天然免疫應答基礎3.1天然免疫應答的概念與重要性天然免疫應答，又被稱為固有免疫應答，是機體在長期的種系進化和個體發(fā)育過程中逐漸形成的一系列防御機制，是機體抵御病原體入侵的第一道防線。它與生俱來，無需預先接觸病原體即可迅速啟動免疫反應，對病原體的識別沒有特異性，能夠對多種病原體產生廣泛的防御作用。當小反芻獸疫病毒入侵宿主時，天然免疫應答能夠在感染的早期階段迅速發(fā)揮作用，限制病毒的復制和擴散，為后續(xù)的適應性免疫應答爭取時間，對于保護宿主的健康具有至關重要的意義。天然免疫應答主要由多種細胞和分子共同參與完成。皮膚和黏膜作為機體與外界環(huán)境接觸的第一道物理屏障，能夠阻擋病毒的入侵。皮膚的角質層具有機械屏障作用，能夠防止病毒直接穿透皮膚進入體內；黏膜表面的黏液層可以捕獲和清除病毒，同時黏膜上皮細胞還能分泌抗菌肽等物質，具有一定的抗菌和抗病毒作用。吞噬細胞，如巨噬細胞和中性粒細胞，是天然免疫應答中的重要細胞成分。巨噬細胞具有強大的吞噬能力，能夠識別、吞噬和消化病毒等病原體，將其降解為小分子物質，從而清除病毒。巨噬細胞還能通過分泌細胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1（IL-1）等，調節(jié)免疫反應，招募其他免疫細胞到感染部位，增強免疫防御能力。中性粒細胞能夠迅速遷移到感染部位，通過釋放活性氧和抗菌肽等物質，對病毒進行殺傷和清除。自然殺傷細胞（NK細胞）則能夠識別和殺傷被病毒感染的細胞，通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質，直接裂解感染細胞，阻止病毒在細胞內的復制和傳播。模式識別受體（PRRs）在天然免疫應答中發(fā)揮著關鍵的識別作用。PRRs能夠識別病原體相關分子模式（PAMPs），這些PAMPs是病原體所特有的保守分子結構，如病毒的雙鏈RNA（dsRNA）、單鏈RNA（ssRNA）、細菌的脂多糖（LPS）等。當PRRs識別到PAMPs后，會激活下游的信號通路，啟動天然免疫應答。Toll樣受體（TLRs）是一類重要的PRRs，廣泛表達于免疫細胞和上皮細胞表面。TLR3能夠識別病毒的dsRNA，TLR7和TLR8則能夠識別病毒的ssRNA。當TLRs與相應的PAMP結合后，會通過髓樣分化因子88（MyD88）依賴途徑或MyD88非依賴途徑激活下游信號通路，最終激活核因子κB（NF-κB）和干擾素調節(jié)因子（IRFs）等轉錄因子，誘導干擾素（IFNs）和其他細胞因子的表達。維甲酸誘導基因I（RIG-I）樣受體（RLRs）也是一類重要的PRRs，主要包括RIG-I和黑色素瘤分化相關基因5（MDA5）。RIG-I能夠識別含有5′-三磷酸基團的短鏈dsRNA，MDA5則能夠識別長鏈dsRNA。RLRs通過線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）激活下游信號通路，同樣可以激活NF-κB和IRFs，誘導IFNs和其他細胞因子的產生。NOD樣受體（NLRs）則主要識別細菌的細胞壁成分等PAMPs，通過激活炎癥小體，誘導白細胞介素1β（IL-1β）和白細胞介素18（IL-18）等炎癥因子的成熟和分泌，參與炎癥反應和免疫防御。天然免疫應答不僅能夠直接抵御病毒的感染，還對后續(xù)的適應性免疫應答的啟動和調節(jié)起著重要的作用。天然免疫細胞在識別病毒后，會分泌細胞因子和趨化因子，吸引T細胞和B細胞等適應性免疫細胞到感染部位。樹突狀細胞（DCs）作為專職的抗原遞呈細胞，能夠攝取、加工和處理病毒抗原，并將抗原肽呈遞給T細胞，激活T細胞的免疫應答。同時，天然免疫應答所產生的細胞因子還能夠調節(jié)T細胞和B細胞的分化和功能，促進抗體的產生和細胞免疫反應的增強。在小反芻獸疫病毒感染中，天然免疫應答的強度和持續(xù)時間會影響機體對病毒的清除能力和疾病的發(fā)展進程。如果天然免疫應答能夠及時有效地啟動，就能夠限制病毒的復制和傳播，減輕病毒對機體的損害，促進機體的康復；反之，如果天然免疫應答功能低下或受到病毒的抑制，病毒就可能在體內大量復制，導致病情加重，甚至引發(fā)死亡。3.2參與天然免疫應答的細胞類型在宿主細胞對小反芻獸疫病毒的天然免疫應答過程中，多種細胞類型發(fā)揮著關鍵作用，它們協(xié)同合作，共同抵御病毒的入侵。巨噬細胞是天然免疫應答中的重要細胞，具有強大的吞噬能力。當小反芻獸疫病毒入侵機體后，巨噬細胞能夠通過其表面的模式識別受體（PRRs）識別病毒的病原體相關分子模式（PAMPs），如病毒的雙鏈RNA（dsRNA）等。隨后，巨噬細胞伸出偽足，將病毒包裹并攝入胞內，形成吞噬體。吞噬體與溶酶體融合，溶酶體中的多種水解酶對病毒進行降解，從而清除病毒。巨噬細胞還能分泌多種細胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1（IL-1）、白細胞介素6（IL-6）等。TNF-α能夠誘導被病毒感染的細胞凋亡，阻止病毒的進一步復制和傳播；IL-1和IL-6則可以激活其他免疫細胞，如T細胞和B細胞，增強機體的免疫應答。巨噬細胞在抗原遞呈過程中也發(fā)揮著重要作用，它能夠將病毒抗原加工處理成小分子肽段，并與主要組織相容性復合體（MHC）分子結合，呈遞給T細胞，啟動適應性免疫應答。樹突狀細胞（DCs）是功能最強的專職抗原遞呈細胞。未成熟的DCs廣泛分布于皮膚、氣道、淋巴器官等部位，具有極強的抗原攝取和處理能力。當DCs識別到小反芻獸疫病毒后，會攝取病毒抗原，并遷移至次級淋巴組織，在此過程中逐漸成熟。成熟的DCs高表達MHC-Ⅱ類分子、共刺激分子和黏附分子，能夠將病毒抗原肽呈遞給初始T細胞，激活T細胞的免疫應答。傳統(tǒng)DCs（cDCs）包括I型和II型，I型cDCs主要激活CD8+T細胞，啟動細胞免疫應答，對殺傷被病毒感染的細胞具有重要作用；II型cDCs則主要激活CD4+T細胞，輔助B細胞產生抗體，參與體液免疫應答。血漿DCs（pDCs）在抗病毒免疫應答中具有獨特的作用，它能夠分泌大量的I型干擾素（IFN-I），IFN-I可以抑制病毒的復制，激活自然殺傷細胞（NK細胞）等免疫細胞，增強機體的抗病毒能力。NK細胞是天然免疫應答中的重要淋巴細胞，能夠識別和殺傷被小反芻獸疫病毒感染的細胞。NK細胞表面存在多種活化性受體和抑制性受體，當NK細胞接觸到被病毒感染的細胞時，活化性受體識別感染細胞表面的配體，傳遞活化信號；抑制性受體則識別自身正常細胞表面的MHC-I類分子，傳遞抑制信號。在正常情況下，抑制信號占主導地位，NK細胞不被激活。但當細胞被病毒感染后，MHC-I類分子表達下調或缺失，抑制信號減弱，活化信號增強，NK細胞被激活。激活后的NK細胞通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質，在感染細胞的細胞膜上形成小孔，使顆粒酶進入細胞內，激活細胞凋亡途徑，導致感染細胞裂解死亡。NK細胞還能分泌細胞因子，如干擾素γ（IFN-γ）等，IFN-γ可以增強巨噬細胞和DCs的功能，促進它們對病毒的吞噬和抗原遞呈，進一步增強機體的免疫應答。3.3天然免疫應答的信號通路在宿主細胞對小反芻獸疫病毒的天然免疫應答過程中，存在多條重要的信號通路，它們相互協(xié)作、相互調控，共同啟動和調節(jié)免疫反應，以抵御病毒的入侵。Toll樣受體（TLR）信號通路在天然免疫應答中發(fā)揮著關鍵作用。TLRs是一類重要的模式識別受體，廣泛表達于免疫細胞和上皮細胞表面。目前已發(fā)現(xiàn)的TLRs家族成員有多種，不同的TLR識別不同的病原體相關分子模式（PAMPs）。在小反芻獸疫病毒感染中，TLR3和TLR7等發(fā)揮著重要的識別作用。TLR3能夠識別病毒復制過程中產生的雙鏈RNA（dsRNA），當TLR3與dsRNA結合后，其胞內段的Toll/白細胞介素-1受體（TIR）結構域發(fā)生構象變化，招募含有TIR結構域的接頭分子TRIF（含有TIR結構能誘導干擾素β的接頭分子）。TRIF通過與下游信號分子腫瘤壞死因子受體相關因子3（TRAF3）和TANK結合激酶1（TBK1）相互作用，激活干擾素調節(jié)因子3（IRF3）。IRF3發(fā)生磷酸化后，形成二聚體并進入細胞核，與干擾素刺激反應元件（ISRE）結合，誘導干擾素β（IFN-β）等細胞因子的表達。IFN-β可以激活JAK-STAT信號通路，誘導一系列干擾素刺激基因（ISGs）的表達，這些基因產物具有抗病毒、調節(jié)免疫等多種功能，從而限制病毒的復制和傳播。RIG-I樣受體（RLR）信號通路也是抗病毒天然免疫應答的重要組成部分。RLRs主要包括維甲酸誘導基因I（RIG-I）和黑色素瘤分化相關基因5（MDA5）。RIG-I能夠識別含有5′-三磷酸基團的短鏈dsRNA，MDA5則主要識別長鏈dsRNA。在小反芻獸疫病毒感染時，病毒的RNA會被RIG-I或MDA5識別。以RIG-I為例，當RIG-I識別到病毒RNA后，其CARD結構域發(fā)生構象變化，與線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）的CARD結構域相互作用，形成復合物。MAVS定位于線粒體膜上，它通過招募下游信號分子TRAF3和TBK1，激活IRF3和核因子κB（NF-κB）。IRF3促進IFN-β的表達，NF-κB則誘導多種促炎細胞因子的表達，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）等。這些細胞因子共同發(fā)揮作用，激活免疫細胞，增強機體的免疫防御能力，抑制病毒的感染和復制。NF-κB信號通路在炎癥反應和免疫調節(jié)中起著核心作用。在小反芻獸疫病毒感染過程中，多種途徑可以激活NF-κB信號通路。如上述的TLR和RLR信號通路激活后，都可以通過下游信號分子的級聯(lián)反應，最終激活NF-κB。當NF-κB處于未激活狀態(tài)時，它與抑制蛋白IκB結合，以無活性的形式存在于細胞質中。當細胞受到病毒感染等刺激時，IκB激酶（IKK）被激活，IKK使IκB發(fā)生磷酸化，隨后被泛素化降解。NF-κB得以釋放，進入細胞核，與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結合，啟動相關基因的轉錄，如促炎細胞因子、趨化因子等。這些基因產物參與炎癥反應和免疫應答，促進免疫細胞的募集和活化，增強機體對病毒的抵抗能力。然而，如果NF-κB信號通路過度激活，也可能導致炎癥反應失控，對機體造成損傷。四、宿主細胞對小反芻獸疫病毒的免疫識別4.1模式識別受體對病毒的識別模式識別受體（PRRs）在宿主細胞對小反芻獸疫病毒的免疫識別過程中發(fā)揮著關鍵作用，它們能夠精準地識別病毒的病原體相關分子模式（PAMPs），從而啟動天然免疫應答，為機體抵御病毒入侵提供重要保障。Toll樣受體（TLRs）是一類重要的PRRs，在小反芻獸疫病毒的免疫識別中扮演著重要角色。其中，TLR3主要定位于細胞內的內體膜上，它能夠特異性地識別小反芻獸疫病毒在復制過程中產生的雙鏈RNA（dsRNA）。當TLR3與dsRNA結合后，其胞內段的Toll/白細胞介素-1受體（TIR）結構域會發(fā)生構象變化，進而招募含有TIR結構域的接頭分子TRIF（含有TIR結構能誘導干擾素β的接頭分子）。TRIF與下游信號分子腫瘤壞死因子受體相關因子3（TRAF3）和TANK結合激酶1（TBK1）相互作用，最終激活干擾素調節(jié)因子3（IRF3）。IRF3發(fā)生磷酸化后，形成二聚體并進入細胞核，與干擾素刺激反應元件（ISRE）結合，誘導干擾素β（IFN-β）等細胞因子的表達。IFN-β可以激活JAK-STAT信號通路，誘導一系列干擾素刺激基因（ISGs）的表達，這些基因產物具有抗病毒、調節(jié)免疫等多種功能，從而有效地限制病毒的復制和傳播。例如，ISGs編碼的蛋白可以干擾病毒的核酸合成、蛋白質翻譯等過程，阻止病毒在細胞內的增殖。TLR7和TLR8則主要識別病毒的單鏈RNA（ssRNA）。它們也定位于內體膜上，當識別到小反芻獸疫病毒的ssRNA后，通過髓樣分化因子88（MyD88）依賴途徑激活下游信號通路。MyD88通過其C端的TIR結構域與TLR7或TLR8的TIR結構域相互作用，招募IL-1受體相關激酶（IRAK）家族成員，包括IRAK1、IRAK2和IRAK4。IRAKs被激活后，發(fā)生磷酸化并與MyD88解離，進而激活腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）。TRAF6通過一系列的信號轉導，激活核因子κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑。NF-κB進入細胞核，與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結合，啟動促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）等的轉錄；MAPK途徑則激活轉錄因子，調節(jié)相關基因的表達，參與炎癥反應和免疫應答。這些促炎細胞因子可以招募和激活免疫細胞，增強機體的免疫防御能力，對病毒進行清除。維甲酸誘導基因I（RIG-I）樣受體（RLRs）也是識別小反芻獸疫病毒的重要PRRs，主要包括RIG-I和黑色素瘤分化相關基因5（MDA5）。RIG-I能夠識別含有5′-三磷酸基團的短鏈dsRNA，而MDA5主要識別長鏈dsRNA。在小反芻獸疫病毒感染宿主細胞時，病毒的RNA會被RIG-I或MDA5識別。以RIG-I為例，當RIG-I識別到病毒RNA后，其N端串聯(lián)的半胱天冬酶激活和募集結構域（CARDs）發(fā)生構象變化，與線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）的CARD結構域相互作用，形成復合物。MAVS定位于線粒體膜上，它通過招募下游信號分子TRAF3和TBK1，激活IRF3和NF-κB。IRF3促進IFN-β的表達，NF-κB則誘導多種促炎細胞因子的表達，如TNF-α、IL-6等。這些細胞因子協(xié)同作用，激活免疫細胞，增強機體的免疫防御能力，抑制病毒的感染和復制。例如，IFN-β可以誘導細胞產生抗病毒蛋白，如蛋白激酶R（PKR），PKR可以磷酸化真核翻譯起始因子2α（eIF2α），抑制病毒蛋白質的合成，從而阻止病毒的增殖。4.2識別過程中的關鍵分子與機制在宿主細胞對小反芻獸疫病毒的免疫識別過程中，髓樣分化因子88（MyD88）和含有TIR結構能誘導干擾素β的接頭分子（TRIF）等關鍵分子發(fā)揮著不可或缺的作用，它們介導的信號轉導機制是啟動天然免疫應答的核心環(huán)節(jié)。MyD88是Toll樣受體（TLRs）信號通路中重要的接頭分子，在小反芻獸疫病毒感染引發(fā)的免疫反應中，其介導的信號轉導機制較為復雜。以TLR7和TLR8識別小反芻獸疫病毒單鏈RNA（ssRNA）的過程為例，當TLR7或TLR8識別到病毒的ssRNA后，會通過自身胞內段的Toll/白細胞介素-1受體（TIR）結構域與MyD88的TIR結構域相互作用，從而招募MyD88。MyD88由296個氨基酸殘基組成，包含N端的死亡結構域（DD）和C端的TIR結構域。在招募過程中，MyD88的C端TIR結構域與TLR7或TLR8的TIR結構域緊密結合，形成穩(wěn)定的復合物。MyD88的N端DD結構域則負責與下游的白細胞介素-1受體相關激酶（IRAK）家族成員相互作用。具體來說，MyD88通過DD結構域招募IRAK1、IRAK2和IRAK4，形成MyD88-IRAK復合物。在這個復合物中，IRAK4首先被激活，它作為一種激酶，使IRAK1發(fā)生磷酸化。磷酸化后的IRAK1與MyD88解離，并進一步激活腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）。TRAF6被激活后，會引發(fā)一系列的信號轉導事件。它通過與泛素結合酶Ubc13和Uev1A相互作用，催化自身第63位賴氨酸發(fā)生泛素化。泛素化的TRAF6在TAK1結合蛋白1（TAB1）和TAK1結合蛋白2（TAB2）的介導下，與絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7（TAK1）結合并激活TAK1。激活后的TAK1可以分別使絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和IκB激酶（IKK）復合物磷酸化。在MAPK途徑中，TAK1激活的MAPK通過細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條級聯(lián)反應，激活轉錄因子c-Jun和c-fos，c-Jun和c-fos進入細胞核后，形成轉錄因子AP-1，調控白細胞介素1（IL-1）、白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）等促炎細胞因子的轉錄。在IKK途徑中，IKK復合物由催化亞基IKKα和IKKβ以及調節(jié)亞基IKKγ組成，它使IκB發(fā)生磷酸化、泛素化并與核因子κB（NF-κB）解離。NF-κB得以釋放并進入細胞核，與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結合，啟動相關基因的轉錄，進一步促進促炎細胞因子的表達，從而激活免疫細胞，增強機體的免疫防御能力。TRIF則在TLR3介導的信號通路中發(fā)揮關鍵作用。當TLR3識別到小反芻獸疫病毒的雙鏈RNA（dsRNA）后，會招募TRIF。TRIF通過其自身的結構域與下游信號分子相互作用，啟動信號轉導。TRIF含有多個功能結構域，其中包括TIR結構域和RIP同源相互作用基序（RHIM）。TRIF通過TIR結構域與TLR3的TIR結構域結合，實現(xiàn)信號的承接。TRIF利用RHIM與腫瘤壞死因子受體相關因子3（TRAF3）相互作用，招募TRAF3。TRAF3被招募后，會激活TANK結合激酶1（TBK1）和IKKε。TBK1和IKKε通過磷酸化干擾素調節(jié)因子3（IRF3），使其形成二聚體并進入細胞核。在細胞核內，IRF3與干擾素刺激反應元件（ISRE）結合，誘導干擾素β（IFN-β）等細胞因子的表達。IFN-β可以激活JAK-STAT信號通路，誘導一系列干擾素刺激基因（ISGs）的表達，這些基因產物具有抗病毒、調節(jié)免疫等多種功能，從而限制病毒的復制和傳播。此外，TRIF還可以通過激活受體相互作用蛋白1（RIP1），進一步激活NF-κB信號通路，誘導促炎細胞因子的表達，增強機體的免疫應答。但與MyD88介導的NF-κB激活途徑不同，TRIF激活NF-κB的機制相對復雜，涉及到RIP1的泛素化等過程。在這個過程中，RIP1被泛素化修飾后，與其他信號分子相互作用，最終激活NF-κB，促進促炎細胞因子的產生，參與免疫防御反應。4.3以山羊細胞模型為例的識別實驗分析為了深入探究模式識別受體對小反芻獸疫病毒的識別機制，本研究以山羊細胞模型為研究對象，開展了一系列實驗。山羊作為小反芻獸疫病毒的主要易感動物之一，其細胞對病毒的免疫識別過程具有典型性和代表性，通過對山羊細胞模型的研究，能夠為揭示宿主細胞對小反芻獸疫病毒的免疫識別機制提供重要的實驗依據。實驗選用山羊肺泡巨噬細胞（GAM）作為研究對象，該細胞在天然免疫應答中發(fā)揮著重要作用，能夠表達多種模式識別受體。首先，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的GAM細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔細胞密度為1×10^5個，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁生長。然后，用小反芻獸疫病毒（PPRV）感染GAM細胞，感染復數(shù)（MOI）為0.1。同時設置未感染病毒的對照組，加入等量的細胞培養(yǎng)液。在感染后的不同時間點（0h、2h、4h、6h、8h、12h）收集細胞及上清液，用于后續(xù)檢測。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測模式識別受體Toll樣受體3（TLR3）、Toll樣受體7（TLR7）、維甲酸誘導基因I（RIG-I）和黑色素瘤分化相關基因5（MDA5）的mRNA表達水平。提取細胞總RNA，利用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板，進行qRT-PCR擴增。結果顯示，在感染PPRV后，TLR3和TLR7的mRNA表達水平在2h時開始顯著上調，在4h達到峰值，隨后逐漸下降。RIG-I的mRNA表達水平在4h時開始明顯升高，在6h達到峰值，之后也逐漸降低。MDA5的mRNA表達水平在6h時顯著升高，在8h達到峰值。這表明在PPRV感染山羊肺泡巨噬細胞的過程中，TLR3、TLR7、RIG-I和MDA5等模式識別受體能夠被迅速激活，其表達水平顯著上調，參與對病毒的識別過程。進一步采用免疫熒光技術檢測模式識別受體在細胞內的定位和表達情況。將感染PPRV的GAM細胞接種于預先放置有蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中，在感染后的4h，取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定15min，然后用0.1%TritonX-100透化處理10min。接著用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉30min，加入相應的模式識別受體一抗（如抗TLR3抗體、抗TLR7抗體、抗RIG-I抗體、抗MDA5抗體），4℃孵育過夜。次日，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，每次5min，加入熒光標記的二抗（如AlexaFluor488標記的山羊抗兔IgG抗體），室溫孵育1h。再次用PBS洗滌3次后，用DAPI染核5min，最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。結果顯示，在未感染PPRV的對照組細胞中，TLR3主要定位于細胞內的內體膜上，呈現(xiàn)出微弱的綠色熒光信號；TLR7也主要分布在內體膜，熒光信號較弱。而在感染PPRV的細胞中，TLR3和TLR7的熒光信號明顯增強，且在病毒感染部位周圍的內體膜上聚集更為明顯，表明PPRV感染能夠誘導TLR3和TLR7的表達增加，并使其在細胞內的分布發(fā)生改變，聚集到病毒感染的相關部位，以便更好地識別病毒的核酸。對于RIG-I和MDA5，在未感染細胞中，它們均勻分布于細胞質中，熒光信號較弱。在感染PPRV后，RIG-I和MDA5的熒光信號顯著增強，且在細胞質中呈現(xiàn)出與病毒感染灶相關的聚集分布，說明PPRV感染能夠促使RIG-I和MDA5在細胞質中聚集，識別病毒的RNA。為了驗證模式識別受體對PPRV的識別功能，進行了干擾實驗。利用RNA干擾（RNAi）技術，設計并合成針對TLR3、TLR7、RIG-I和MDA5的小干擾RNA（siRNA）。將GAM細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，按照脂質體轉染試劑的說明書，將siRNA轉染至細胞中，每組設置3個復孔。轉染48h后，用PPRV感染細胞，MOI為0.1。感染12h后，收集細胞及上清液。通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，轉染針對TLR3的siRNA后，TLR3的mRNA表達水平顯著降低，相較于對照組下降了約70%；轉染針對TLR7的siRNA后，TLR7的mRNA表達水平下降了約80%；轉染針對RIG-I的siRNA后，RIG-I的mRNA表達水平降低了約75%；轉染針對MDA5的siRNA后，MDA5的mRNA表達水平下降了約85%。同時，檢測細胞上清液中的干擾素β（IFN-β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）等細胞因子的含量，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒進行檢測。結果顯示，干擾TLR3和TLR7后，IFN-β和TNF-α的分泌量明顯減少，分別相較于對照組下降了約40%和30%。干擾RIG-I和MDA5后，IFN-β和TNF-α的分泌量也顯著降低，分別下降了約50%和40%。這表明通過干擾模式識別受體的表達，能夠抑制其對PPRV的識別，進而影響下游細胞因子的產生，證明了TLR3、TLR7、RIG-I和MDA5在山羊肺泡巨噬細胞對PPRV的免疫識別過程中發(fā)揮著重要作用。五、免疫應答信號傳導與激活5.1信號傳導通路的激活與調控當小反芻獸疫病毒入侵宿主細胞后，會觸發(fā)一系列復雜的免疫應答信號傳導通路，其中核因子κB（NF-κB）和干擾素調節(jié)因子3（IRF3）等轉錄因子的激活和調控在免疫反應中起著核心作用，它們協(xié)同調節(jié)細胞因子的表達，共同抵御病毒的感染。在NF-κB信號通路的激活過程中，病毒感染會引發(fā)一系列的分子事件。以Toll樣受體（TLR）信號通路為例，當TLR識別到小反芻獸疫病毒的病原體相關分子模式（PAMPs）后，會招募髓樣分化因子88（MyD88）。MyD88通過其死亡結構域（DD）與白細胞介素-1受體相關激酶（IRAK）家族成員相互作用，使IRAK發(fā)生磷酸化并激活。激活后的IRAK進一步激活腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）。TRAF6通過與泛素結合酶Ubc13和Uev1A相互作用，催化自身第63位賴氨酸發(fā)生泛素化。泛素化的TRAF6在TAK1結合蛋白1（TAB1）和TAK1結合蛋白2（TAB2）的介導下，與絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7（TAK1）結合并激活TAK1。TAK1激活后，會使IκB激酶（IKK）復合物磷酸化。IKK復合物由催化亞基IKKα和IKKβ以及調節(jié)亞基IKKγ組成，它能夠使IκB發(fā)生磷酸化、泛素化并與NF-κB解離。NF-κB得以釋放并進入細胞核，與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結合，啟動相關基因的轉錄，如促炎細胞因子白細胞介素1（IL-1）、白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）等。這些促炎細胞因子可以招募和激活免疫細胞，增強機體的免疫防御能力。在RIG-I樣受體（RLR）信號通路中，維甲酸誘導基因I（RIG-I）和黑色素瘤分化相關基因5（MDA5）識別病毒RNA后，通過線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）激活下游信號通路。MAVS招募腫瘤壞死因子受體相關因子3（TRAF3）和TANK結合激酶1（TBK1）。TBK1通過磷酸化IRF3，使其形成二聚體并進入細胞核。IRF3在細胞核內與干擾素刺激反應元件（ISRE）結合，誘導干擾素β（IFN-β）等細胞因子的表達。IFN-β可以激活JAK-STAT信號通路，誘導一系列干擾素刺激基因（ISGs）的表達，這些基因產物具有抗病毒、調節(jié)免疫等多種功能，從而限制病毒的復制和傳播。在小反芻獸疫病毒感染過程中，機體存在多種機制對這些信號傳導通路進行精細的調控，以維持免疫平衡，避免過度免疫反應對機體造成損傷。一些負調控因子在其中發(fā)揮著關鍵作用。例如，A20是一種重要的負調控蛋白，它含有多個結構域，包括鋅指結構域和泛素編輯結構域。當NF-κB信號通路被激活后，A20會被誘導表達。A20通過其泛素編輯結構域，對TRAF6上的泛素鏈進行編輯，將其K63連接的泛素鏈替換為K48連接的泛素鏈，從而使TRAF6被蛋白酶體降解，阻斷NF-κB信號通路的持續(xù)激活。A20還可以與IKK復合物相互作用，抑制IKK的活性，進一步抑制NF-κB的激活。還有一些微小RNA（miRNA）也參與了免疫應答信號傳導通路的調控。研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a可以通過靶向IRAK1和TRAF6，抑制NF-κB信號通路的激活。在小反芻獸疫病毒感染時，miR-146a的表達會上調，它與IRAK1和TRAF6的mRNA結合，抑制其翻譯過程，減少IRAK1和TRAF6蛋白的表達，從而減弱NF-κB信號通路的激活程度，避免過度的炎癥反應。在RLR信號通路中，miR-21可以通過靶向MAVS，抑制IFN-β的產生。miR-21與MAVS的mRNA結合，降低MAVS的表達水平，從而減少下游IRF3的激活和IFN-β的表達，對免疫應答進行適度調控。5.2關鍵信號分子的作用在宿主細胞對小反芻獸疫病毒的免疫應答信號傳導過程中，IκB激酶（IKK）、TANK結合激酶1（TBK1）等激酶發(fā)揮著至關重要的作用，它們通過對轉錄因子的磷酸化激活，精確調控著免疫應答的啟動和強度，是信號傳導通路中的關鍵節(jié)點。IKK在核因子κB（NF-κB）信號通路的激活中扮演著核心角色。IKK是一個由三個亞單位組成的復合物，包括催化亞基IKKα和IKKβ以及調節(jié)亞基IKKγ（也稱為NEMO）。在正常情況下，NF-κB與抑制蛋白IκB結合，以無活性的形式存在于細胞質中。當宿主細胞受到小反芻獸疫病毒感染等刺激時，IKK復合物被激活。激活后的IKK能夠使IκB發(fā)生磷酸化，具體來說，IKKβ在這個過程中起主要的催化作用，它將ATP上的磷酸基團轉移到IκB的特定絲氨酸殘基上。磷酸化后的IκB發(fā)生構象變化，暴露出其被泛素化修飾的位點。隨后，IκB被泛素連接酶識別并結合，多個泛素分子依次連接到IκB上，形成多聚泛素鏈。帶有多聚泛素鏈的IκB被蛋白酶體識別并降解，從而使NF-κB得以釋放。釋放后的NF-κB迅速進入細胞核，與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結合，啟動一系列基因的轉錄，這些基因包括促炎細胞因子白細胞介素1（IL-1）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等。這些促炎細胞因子能夠招募和激活免疫細胞，如巨噬細胞、T細胞、B細胞等，增強機體的免疫防御能力。例如，IL-1可以激活T細胞，促進T細胞的增殖和分化，使其更好地發(fā)揮免疫功能；TNF-α能夠誘導被病毒感染的細胞凋亡，阻止病毒的進一步復制和傳播。TBK1在干擾素調節(jié)因子3（IRF3）的激活過程中起著關鍵作用。TBK1是非經典的IκB激酶，與IKKα和IKKβ相關。在小反芻獸疫病毒感染時，當模式識別受體如Toll樣受體（TLR）或維甲酸誘導基因I（RIG-I）樣受體（RLR）識別到病毒的病原體相關分子模式（PAMPs）后，會通過一系列的接頭分子傳遞信號，最終激活TBK1。以RLR信號通路為例，當RIG-I識別到病毒RNA后，通過線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）招募腫瘤壞死因子受體相關因子3（TRAF3），進而激活TBK1。激活后的TBK1作為激酶，能夠對IRF3進行磷酸化修飾。TBK1催化ATP上的磷酸基團轉移到IRF3的特定絲氨酸殘基上，使IRF3發(fā)生磷酸化。磷酸化后的IRF3分子內部的自我抑制域被打開，形成同二聚體或與IRF7形成異二聚體。這些二聚體具有更高的活性，能夠進入細胞核。在細胞核內，IRF3二聚體與共同活化因子CBP/p300結合，與干擾素刺激反應元件（ISRE）結合，誘導干擾素β（IFN-β）等細胞因子的表達。IFN-β可以激活JAK-STAT信號通路，誘導一系列干擾素刺激基因（ISGs）的表達，這些基因產物具有抗病毒、調節(jié)免疫等多種功能，從而限制病毒的復制和傳播。例如，ISGs編碼的蛋白可以干擾病毒的核酸合成、蛋白質翻譯等過程，阻止病毒在細胞內的增殖。5.3細胞因子與趨化因子的產生與作用在宿主細胞對小反芻獸疫病毒的免疫應答過程中，細胞因子和趨化因子的產生和作用是免疫反應的重要組成部分，它們在抗病毒感染和免疫細胞招募等方面發(fā)揮著關鍵作用，共同維護機體的免疫平衡和健康。干擾素（IFNs）是一類具有廣泛抗病毒活性的細胞因子，在宿主抵御小反芻獸疫病毒感染中發(fā)揮著核心作用。I型干擾素（IFN-I）包括IFN-α和IFN-β等，在病毒感染早期，宿主細胞通過模式識別受體（PRRs）識別小反芻獸疫病毒的病原體相關分子模式（PAMPs）后，激活相關信號通路，誘導IFN-I的表達。如Toll樣受體（TLR）信號通路和RIG-I樣受體（RLR）信號通路被激活后，會促使干擾素調節(jié)因子3（IRF3）和核因子κB（NF-κB）等轉錄因子活化，進而誘導IFN-β等IFN-I的產生。IFN-I與靶細胞表面的受體結合后，激活JAK-STAT信號通路，誘導一系列干擾素刺激基因（ISGs）的表達。這些ISGs編碼的蛋白具有多種抗病毒功能，如蛋白激酶R（PKR）可以磷酸化真核翻譯起始因子2α（eIF2α），抑制病毒蛋白質的合成；2′,5′-寡腺苷酸合成酶（OAS）能夠激活核糖核酸酶L（RNaseL），降解病毒RNA，從而有效抑制小反芻獸疫病毒的復制和傳播。腫瘤壞死因子α（TNF-α）是一種重要的促炎細胞因子，在免疫應答中具有多種作用。當宿主細胞受到小反芻獸疫病毒感染時，巨噬細胞、單核細胞等免疫細胞會被激活，分泌TNF-α。TNF-α可以誘導被病毒感染的細胞凋亡，通過與感染細胞表面的TNF受體1（TNFR1）結合，激活細胞內的凋亡信號通路，促使感染細胞發(fā)生程序性死亡，從而阻止病毒在細胞內的進一步復制和傳播。TNF-α還能激活其他免疫細胞，如T細胞和NK細胞，增強它們的免疫活性，促進免疫細胞對病毒感染細胞的殺傷作用。TNF-α可以調節(jié)炎癥反應，促進血管內皮細胞表達黏附分子，使免疫細胞更容易黏附和遷移到感染部位，增強機體的免疫防御能力。然而，如果TNF-α的表達過度，可能會導致炎癥反應失控，引發(fā)全身炎癥反應綜合征等病理狀態(tài)，對機體造成損傷。白細胞介素6（IL-6）也是一種在免疫應答中發(fā)揮重要作用的細胞因子。在小反芻獸疫病毒感染過程中，多種免疫細胞，如巨噬細胞、T細胞等，會產生IL-6。IL-6具有廣泛的生物學活性，它可以促進T細胞的增殖和分化，增強T細胞的免疫功能，使其更好地識別和殺傷被病毒感染的細胞。IL-6還能刺激B細胞產生抗體，促進B細胞的活化和分化，增強體液免疫應答。IL-6參與炎癥反應的調節(jié)，與其他細胞因子協(xié)同作用，共同調節(jié)免疫反應的強度和持續(xù)時間。IL-6可以誘導急性期蛋白的合成，增強機體的非特異性免疫防御能力。趨化因子是一類能夠吸引免疫細胞定向遷移的小分子蛋白質，在免疫細胞招募到感染部位的過程中發(fā)揮著關鍵作用。在小反芻獸疫病毒感染時，感染部位的細胞會分泌多種趨化因子，如CC趨化因子配體2（CCL2）、CC趨化因子配體5（CCL5）和CXC趨化因子配體10（CXCL10）等。CCL2能夠吸引單核細胞、巨噬細胞和T細胞等免疫細胞向感染部位遷移。它通過與免疫細胞表面的CC趨化因子受體2（CCR2）結合，激活細胞內的信號通路，促使免疫細胞發(fā)生定向遷移。CCL5則主要吸引T細胞、NK細胞和嗜酸性粒細胞等，它與免疫細胞表面的CCR5結合，引導這些細胞到達感染部位，參與免疫防御。CXCL10能夠吸引T細胞和NK細胞，它與免疫細胞表面的CXC趨化因子受體3（CXCR3）結合，促進免疫細胞的遷移。這些趨化因子通過協(xié)同作用，將不同類型的免疫細胞招募到感染部位，形成有效的免疫防線，共同抵御小反芻獸疫病毒的感染。六、免疫效應機制6.1干擾素介導的抗病毒作用干擾素（IFNs）在宿主抵御小反芻獸疫病毒感染的過程中發(fā)揮著核心的抗病毒作用，其作用機制涉及多個層面，通過誘導細胞產生一系列抗病毒蛋白，形成一個嚴密的抗病毒防御網絡，有效抑制小反芻獸疫病毒的復制和傳播。當宿主細胞受到小反芻獸疫病毒感染后，模式識別受體（PRRs）識別病毒的病原體相關分子模式（PAMPs），激活相關信號通路，促使干擾素調節(jié)因子3（IRF3）和核因子κB（NF-κB）等轉錄因子活化，進而誘導干擾素的表達。以I型干擾素（IFN-I）為例，包括IFN-α和IFN-β等，它們與靶細胞表面的干擾素受體（IFNAR）結合，啟動JAK-STAT信號通路。IFNAR由IFNAR1和IFNAR2兩個亞基組成，當IFN-I與IFNAR結合后，會引起受體亞基的二聚化，從而招募并激活與之相關的酪氨酸激酶JAK1和TYK2。激活后的JAK1和TYK2會使IFNAR的胞內段酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，形成磷酸化位點。這些磷酸化位點能夠招募信號轉導和轉錄激活因子（STATs）家族成員，主要是STAT1和STAT2。STAT1和STAT2被招募到受體復合物后，在JAK1和TYK2的作用下發(fā)生磷酸化。磷酸化后的STAT1和STAT2形成異二聚體，并與干擾素調節(jié)因子9（IRF9）結合，形成干擾素刺激基因因子3（ISGF3）復合物。ISGF3復合物隨后進入細胞核，與干擾素刺激反應元件（ISRE）結合，啟動一系列干擾素刺激基因（ISGs）的轉錄，從而誘導抗病毒蛋白的產生。蛋白激酶R（PKR）是一種重要的抗病毒蛋白，由ISGs編碼產生。PKR在細胞內通常以無活性的單體形式存在。當細胞感染小反芻獸疫病毒后，病毒的雙鏈RNA（dsRNA）作為一種PAMP，能夠與PKR結合，促使PKR發(fā)生二聚化并自磷酸化，從而被激活。激活后的PKR具有激酶活性，它可以磷酸化真核翻譯起始因子2α（eIF2α）。eIF2α在蛋白質翻譯起始過程中起著關鍵作用，它與鳥苷三磷酸（GTP）結合形成eIF2-GTP復合物，該復合物能夠與起始甲硫氨酰-tRNA（Met-tRNAi）結合，然后與40S核糖體亞基結合，形成43S起始前復合物。43S起始前復合物在eIF4F復合物等的協(xié)助下，結合到mRNA的5′端，掃描到起始密碼子AUG后，60S核糖體亞基加入，形成80S起始復合物，從而啟動蛋白質翻譯過程。而PKR磷酸化eIF2α后，eIF2α-GDP復合物與鳥苷酸交換因子eIF2B的親和力大大增強，導致eIF2B被抑制，無法將eIF2α-GDP轉換為eIF2α-GTP，從而阻斷了蛋白質翻譯起始過程。由于病毒的復制需要大量合成自身的蛋白質，PKR對eIF2α的磷酸化作用有效地抑制了病毒蛋白質的合成，進而阻止了病毒的增殖。2′,5′-寡腺苷酸合成酶（OAS）也是ISGs編碼的重要抗病毒蛋白之一。OAS能夠識別病毒的dsRNA，在ATP的參與下，將ATP連接成2′,5′-寡腺苷酸（2-5A）。2-5A作為一種第二信使，能夠激活核糖核酸酶L（RNaseL）。RNaseL是一種內切核糖核酸酶，在未激活狀態(tài)下以無活性的單體形式存在。當2-5A與RNaseL結合后，會促使RNaseL發(fā)生二聚化，從而被激活。激活后的RNaseL具有內切酶活性，能夠特異性地切割病毒的RNA，將其降解為小片段，破壞病毒RNA的結構和功能，使其無法作為模板進行病毒蛋白質的合成和病毒基因組的復制，從而有效抑制小反芻獸疫病毒的復制和傳播。Mx蛋白同樣是一種由ISGs編碼的抗病毒蛋白，具有GTP酶活性。Mx蛋白可以分為Mx1和Mx2等亞型，在不同物種和組織中表達存在差異。以Mx1蛋白為例，它能夠特異性地識別小反芻獸疫病毒的核衣殼蛋白（N蛋白）等病毒成分。Mx1蛋白通過其N端的GTP酶結構域結合GTP，在與病毒成分相互作用時，水解GTP釋放能量，改變自身的構象，從而與病毒的核衣殼緊密結合。這種結合能夠干擾病毒的轉錄和復制過程，阻止病毒基因組RNA從核衣殼中釋放，使其無法進行轉錄和復制，進而抑制病毒的增殖。研究表明，過表達Mx蛋白的細胞對小反芻獸疫病毒的感染具有更強的抵抗力，病毒的復制水平明顯降低。6.2免疫細胞的抗病毒反應巨噬細胞作為天然免疫的重要防線，在抵御小反芻獸疫病毒感染中發(fā)揮著關鍵作用。當小反芻獸疫病毒入侵機體后，巨噬細胞能夠迅速識別病毒，并通過多種方式發(fā)揮抗病毒作用。巨噬細胞表面表達豐富的模式識別受體（PRRs），如Toll樣受體（TLRs）和清道夫受體等。以TLR3為例，當它識別到小反芻獸疫病毒的雙鏈RNA（dsRNA）后，會激活下游的信號通路。在這個過程中，TLR3通過其胞內段的Toll/白細胞介素-1受體（TIR）結構域招募含有TIR結構域的接頭分子TRIF（含有TIR結構能誘導干擾素β的接頭分子）。TRIF進一步與腫瘤壞死因子受體相關因子3（TRAF3）和TANK結合激酶1（TBK1）相互作用，激活干擾素調節(jié)因子3（IRF3）。IRF3發(fā)生磷酸化后，形成二聚體并進入細胞核，與干擾素刺激反應元件（ISRE）結合，誘導干擾素β（IFN-β）等細胞因子的表達。IFN-β可以激活JAK-STAT信號通路，誘導一系列干擾素刺激基因（ISGs）的表達，這些基因產物具有抗病毒、調節(jié)免疫等多種功能，從而限制病毒的復制和傳播。巨噬細胞還能通過吞噬作用直接清除病毒。巨噬細胞伸出偽足，將病毒包裹并攝入胞內，形成吞噬體。吞噬體與溶酶體融合，溶酶體中的多種水解酶對病毒進行降解。在這個過程中，巨噬細胞的吞噬活性受到多種因素的調節(jié)。研究表明，細胞因子如干擾素γ（IFN-γ）可以增強巨噬細胞的吞噬能力。IFN-γ與巨噬細胞表面的受體結合，激活細胞內的信號通路，上調吞噬相關蛋白的表達，促進吞噬體的形成和成熟，從而提高巨噬細胞對小反芻獸疫病毒的吞噬效率。巨噬細胞在吞噬病毒后，會將病毒抗原加工處理成小分子肽段，并與主要組織相容性復合體（MHC）分子結合，呈遞給T細胞，啟動適應性免疫應答，進一步增強機體對病毒的免疫防御能力。自然殺傷細胞（NK細胞）在宿主抵御小反芻獸疫病毒感染的過程中也發(fā)揮著重要作用，其殺傷機制獨特而高效。NK細胞表面存在多種活化性受體和抑制性受體，這些受體的平衡調節(jié)決定了NK細胞的活化狀態(tài)。當小反芻獸疫病毒感染宿主細胞后，感染細胞表面的分子表達會發(fā)生改變，這一變化會被NK細胞識別。正常情況下，細胞表面表達的主要組織相容性復合體I類分子（MHC-I）會與NK細胞表面的抑制性受體結合，傳遞抑制信號，使NK細胞處于抑制狀態(tài)。但當細胞被小反芻獸疫病毒感染后，MHC-I類分子的表達會下調，導致抑制信號減弱。與此同時，感染細胞表面會表達一些應激誘導的配體，如UL16結合蛋白（ULBPs）和主要組織相容性復合體I類相關鏈A/B（MICA/B）等，這些配體能夠與NK細胞表面的活化性受體結合，傳遞活化信號。當活化信號超過抑制信號時，NK細胞被激活。激活后的NK細胞主要通過釋放穿孔素和顆粒酶來殺傷被小反芻獸疫病毒感染的細胞。穿孔素是一種類似于補體C9的蛋白質，它在Ca2+的存在下，能夠插入感染細胞的細胞膜，形成多聚穿孔素管狀通道。這些通道允許顆粒酶等物質進入細胞內。顆粒酶是一類絲氨酸蛋白酶，進入細胞后，它們可以激活細胞內的凋亡途徑。顆粒酶B能夠切割半胱天冬酶3（caspase-3）等凋亡相關蛋白，使其活化，進而啟動級聯(lián)反應，導致細胞凋亡。通過這種方式，NK細胞能夠有效地清除被小反芻獸疫病毒感染的細胞，阻止病毒在細胞內的復制和傳播。NK細胞還能分泌細胞因子，如干擾素γ（IFN-γ）等。IFN-γ可以增強巨噬細胞和樹突狀細胞的功能，促進它們對病毒的吞噬和抗原遞呈，進一步增強機體的免疫應答，協(xié)同其他免疫細胞共同抵御小反芻獸疫病毒的感染。6.3炎癥反應在免疫應答中的作用炎癥反應是宿主細胞對小反芻獸疫病毒感染的重要免疫應答之一，在清除病毒感染中發(fā)揮著重要作用，但過度的炎癥反應也會對宿主造成負面影響。在小反芻獸疫病毒感染初期，炎癥反應能夠迅速啟動，幫助機體抵御病毒入侵。當模式識別受體（PRRs）識別到病毒的病原體相關分子模式（PAMPs）后，會激活下游的信號通路，如核因子κB（NF-κB）信號通路，誘導促炎細胞因子的表達。腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1（IL-1）和白細胞介素6（IL-6）等促炎細胞因子的釋放，能夠招募免疫細胞到感染部位，增強免疫細胞的活性，促進對病毒的清除。TNF-α可以誘導被病毒感染的細胞凋亡，阻止病毒在細胞內的進一步復制和傳播；IL-1和IL-6能夠激活T細胞和B細胞，增強機體的免疫應答。炎癥反應還可以促進血管通透性增加，使免疫細胞和免疫分子更容易到達感染部位，形