PAGE1磁性微球用于大豆基因組DNA純化研究近年來，轉基因產(chǎn)業(yè)在迅速發(fā)展。然而，盡管轉基因技術給人類帶來了巨大的利益，但由于基因改造而引起的安全事件屢屢發(fā)生，引起了廣泛的關注和關注。由于轉基因產(chǎn)品的安全性在世界范圍內仍存在爭議，因此世界各國制定了法規(guī)以加強轉基因產(chǎn)品的管理并設置貿易壁壘以限制此類產(chǎn)品的進口，歐盟，新西蘭，澳大利亞，俄羅斯，沙特阿拉伯。日本和韓國等發(fā)達國家已經(jīng)對轉基因產(chǎn)品實施了強制性標簽制度。如果制造商或貿易商向上述國家出售農(nóng)產(chǎn)品，則必須證明該產(chǎn)品不含轉基因成分或不符合相關進口國的法規(guī)要求。自1995年以來，大豆已從凈出口變?yōu)閮暨M口，進口逐年增加。進口大豆主要來自轉基因作物的種植國，例如美國，加拿大，巴西和阿根廷。中國種植的大豆屬于非轉基因品種，這是中國大豆和加工產(chǎn)品在國際競爭中的優(yōu)勢。當前，非轉基因大豆在國際市場上非常受歡迎，其價格比轉基因大豆高15％至20％。加強轉基因大豆的檢測，全面實施“標簽制度”，對發(fā)展我國大豆產(chǎn)業(yè)具有重要意義。它可以標準化非轉基因大豆，確保中國非轉基因大豆的優(yōu)勢，并防止轉基因大豆對中國市場的影響。目前，各國轉基因檢測機構對轉基因產(chǎn)品的檢測主要基于分子水平的檢測，核酸提取質量是影響后續(xù)分子鑒定的重要因素。在轉基因產(chǎn)品的檢測中，分子生物學檢測方法的靈敏度和特異性在很大程度上取決于樣品制備過程（核酸提取過程）。與傳統(tǒng)的核酸提取方法相比，基于納米磁珠的核酸提取方法具有操作簡單，提取結果重復性好，穩(wěn)定性高的特點，已成為一種很有前途的提取方法。一、磁性微球概述1、磁性微球的結構和性質磁性微球是通過適當?shù)睦砘椒▽o機磁性材料和有機高分子材料結合而形成的一種多功能復合材料。根據(jù)球芯和外殼材料的磁性特點可分為磁性核或磁性殼型，混合型和多層型。無機磁性材料主要有金屬（Fe、CO、Ni）、鐵氧體（MeO﹒Fe２O３、Fe３O４）、合金（FeCO）、鐵酸鹽等，其中Fe３O４由于磁性能好，制作工藝簡單，成本低，而成為應用最廣泛的磁核。高分子材料有天然與合成兩類。天然高分子材料主要有瓊脂糖、淀粉、明膠、纖維素、殼聚糖等；合成高分子材料主要有聚苯乙烯、聚苯乙烯醇等。目前磁性微球的制備方法主要有磁性粒子單體聚合法、磁性粒子聚合物組合法和磁性粒子聚合物原位生成法。磁性粒子聚合物組合法制備磁性微球方法簡單，但制備出的磁性微球單分散性差，形貌不規(guī)則。磁性粒子單體聚合法主要是以高分子單體聚合的方法為主，相對磁性粒子聚合物組合法要復雜，制備出的磁性微球分布較寬、粒徑較大或包埋磁性粒子效果差，使得后期應用受到限制。通過不同的制備方法可得到性能不同的磁性微球，再加上表面功能基團的修飾，使得磁性微球幾乎可以偶聯(lián)大部分生物活性物質。應用于生物磁分離技術中的磁性微球應具有合適的磁響應度、均一的粒徑分布、良好的生物相容性、穩(wěn)定的特異吸附表面等特性。2、磁性微球的分離原理磁分離技術的分離有２種方式，即直接分離法和間接分離法。直接分離法是指磁性微球表面連接的是能夠特異性結合目標產(chǎn)物的基團，在溶液體系中特異性結合目標產(chǎn)物，在磁場作用下與其他物質分離。間接分離法是在分離前先對目標產(chǎn)物進行處理（例如抗原純化中，首先將抗原與第一抗體連接），使其能夠與磁性微球表面的基團（第二抗體）結合，在磁場作用下將攜帶目標產(chǎn)物的復合物分離出來，再借助其他手段解吸附目標產(chǎn)物。3、磁性微球的制備方法（1）包埋法包埋法是早期研究的制備磁性微球的一種方法，該方法是將預先制備好的磁性粒子分散包埋在一些天然的高聚物中，如淀粉、葡聚糖、纖維素或者蛋白中，通過混合，在一定的條件下使之包埋在其中，從而整個高聚物具有磁性，一般情況下，磁性粒子與高聚物中之間的作用力主要有范德華力、氫鍵、金屬離子與高聚物之間的螯合作用力，這種方法相對來說較簡單，只要預先制備好磁性粒子與高聚物之間有作用力并包埋分散在其中即可，其磁響應性可以根據(jù)磁性粒子的多少調節(jié)，但該方法有其固有的缺點，所得到的磁性聚合物形狀不規(guī)則且不易控制，在包埋過程中可能會混入一些其它雜質，同時，對于聚合物的選擇有一定的要求，因此，其制備受到一定的限制。（2）單體聚合法單體聚合法主要有以下幾種，乳液聚合法、懸浮聚合法、分散聚合法等。乳液聚合法將磁性粒子分散在水相中，然后加入單體，進行乳化，得到乳化體系，然后根據(jù)乳液聚合的基本原理進行聚合，可以得到單分散性較好的磁性微球。懸浮聚合法是將磁性粒子均勻地分散在含有聚合物單體、引發(fā)劑和穩(wěn)定劑等體系中進行聚合反應制得的，這種方法可以將磁性粒子均勻于分散在微球中，傳統(tǒng)的懸浮聚合法采用機械攪拌或震蕩的形式，制備的磁性微球顆粒較大，且不均勻，并且磁性粒子分散不均勻，在磁場下的各個微球的磁性行為不一致，而噴霧式懸浮聚合法可以解決此缺點，陽承利等將疏水性磁流體、甲基丙烯酸甲酯、二乙烯苯、過氧苯甲酰和聚乙烯醇等混合，采用噴霧式懸浮聚合法制得了甲基丙烯酸甲酯磁性微球。包埋法存在諸多缺陷，能制得粒徑分布較窄、球形規(guī)整的單體聚合法應運而生。而分散聚合法對于合成較大粒徑、單分散性的磁性微球具有獨特的優(yōu)勢，同時該方法是向微球表面引入功能基團最為方便有效的方法，Qiu等利用分散聚合法，以聚乙二醇4000為分散劑，水/乙醇為分散介質，合成了含有-COOH、-OH、-CHO等不同表面功能基團的磁性復合膠乳微球，并研究了分散劑、磁流體、分散介質、引發(fā)劑、聚合單體等因素對形成復合微球的影響。（3）原位法原位法，也可稱作化學轉化法、浸漬法或者磁滲法，該方法制備的主要過程是首先制備單分散的具有多孔的聚合物微球，然后加入適當?shù)蔫F鹽溶液（Fe2+或者Fe3+）使之浸漬在孔中，再通過合適的條件生成磁性粒子。同時，多孔聚合物微球需要有適當?shù)幕鶊F，如-COOH、-NH2、-OH、-SO3H等，使之與鐵鹽形成離子鍵或者配位鍵。如果聚合物微球含有-NH2、-COOH等，可以直接加入適量的鐵鹽溶液，使聚合物微球均勻地分散在其中，通過溶脹、滲透使磁性粒子均勻分散于其中，當反應至一定程度時，提高溶液的PH值，就可以得到鐵的氫氧化物，繼而通過高溫即可得到Fe3O4磁性微球；另外一種即是如果聚合物微球上含有一些還原或者氧化性基團，如-NO2、-NH-等，可以分別加入Fe2+和Fe3+等溶液，控制適宜的反應條件（PH和溫度）即可得到Fe3O4磁性微球，該方法與包埋法、單體聚合法相比，主要有以下幾個優(yōu)點：一是磁性微球具有良好的單分散性，因為該聚合物微球在磁滲透過程中粒徑不會變化；二是各個微球在磁場下的磁響應性保持一致，因為磁性粒子可以均勻地滲透到聚合物微球中；三是可以制備不同粒徑的磁性微球，磁響應性不同的微球，利用該方法制備的磁性微球已經(jīng)商品化，即Dynabeads系列產(chǎn)品。（4）Core-Shell法Core-Shell法制備的粒徑可控的磁性微球最早是Iler于19世紀60年代發(fā)明的。其基本原理為：表面帶有一定量電荷的膠體粒子，如二氧化硅或三氧化二鋁的微粒，在適當?shù)臈l件下可以使之沉積到表面光滑的帶有與膠體粒子相反電荷的微粒表面上，從而形成了表面帶有一層膠體粒子的核殼型結構的復合粒子，在通過一定條件使表面又重新帶有與膠體粒子相反的電荷，從而又可以覆蓋一層膠體粒子，因此，通過反復這樣的步驟，從而可以得到粒徑可控的微球，ZhuYi-hua等人制備的核-殼型結構的二氧化硅/四氧化三鐵單分散復合磁性微球較為典型，首先以溶膠凝膠法制備得到粒徑均一的二氧化硅微球，然后將其分散于PDADMAC(Polydiallydimethylammoniumchloride)中，攪拌，使其表面吸附一層PDADMAC，使二氧化硅微球表面帶負電，通過水洗、離心等步驟出去多余的PDADMAC，然后加入帶正電的磁流體，使磁性粒子吸附在二氧化硅微球上，然后再通過水洗、磁分離方式除掉多余的磁流體，此時微球表面帶正電，然后再加入適量的PDADMAC，使二氧化硅微球表面又帶有負電，通過此過程的不斷重復，即可得到二氧化硅/四氧化三鐵磁性微球，該方法主要缺點是操作步驟繁瑣，不便于大量制備。二、磁性微球在蛋白質提純中的應用磁性微球在生物分離純化中的應用大多都集中在細胞和核酸的分離上。隨著蛋白質組學的快速發(fā)展，磁性微球在蛋白質分離純化中的應用也得到了快速發(fā)展。它是通過在微球表面修飾的功能基團能與靶向蛋白可逆結合，從而達到靶蛋白分離的目的。與傳統(tǒng)分離方法相比有純度高、速度快、回收率高的優(yōu)點。1、磁性微球在蛋白質分離中的應用磁性微球在蛋白質分離中的應用主要集中于常規(guī)實驗室蛋白分離，如酶蛋白、抗體蛋白、重組蛋白等。ShaoMF等制備了由四氧化三鐵／二氧化硅／鎳鋁層狀氫氧化合物組成的三維核殼磁性微球，并將其用于重組蛋白純化中，結果表明微球上的Ni2＋對-His重組蛋白表現(xiàn)出較高的吸附率（239μｇ／ｍｇ）并能持續(xù)幾個純化周期。LiZH等利用染料配基（活性紅120）偶聯(lián)殼聚糖磁性微球從蛋清溶液中特異性吸附溶菌酶，循環(huán)使用4次后吸附率仍能達到92.6％，最終提取的溶菌酶純度達80.7％，回收率89.1％。VijaykumarLD等將氨基苯硼酸磁性微球用于抗體分子的純化，通過磁性微球表面的氨基與抗體偶聯(lián)，每克磁球可結合170ｍｇ±10ｍｇ并能能洗脫回收160ｍｇ±5ｍｇ的IgG；當直接從CHO細胞上清中純化時，98％的IgG可結合，其中95％可有效回收，最終純度達到98％以上。2、磁分離技術和其他技術結合在蛋白質分離中的應用隨著磁分離技術的發(fā)展，許多研究者將磁分離技術與分子印跡或雙水相萃取相結合應用于蛋白質分離純化中。分子印跡聚合物包裹磁性粒子可形成表面具有分子印跡的磁性材料，通過印跡位點、形狀、官能團的互補作用達到分離蛋白質的目的。該方法操作簡單，選擇性高抗。ＴａｎＣＪ等提出一種共價固定模板蛋白表面印跡法，利用乳液聚合法制備了表面共價結合模板蛋白（牛血清白蛋白）的印跡亞微米磁性粒子，該粒子內包納米磁性粒子，有很強的超順磁性，在水溶液中對模板蛋白具有非常好的識別性能。由于模板蛋白固定對蛋白質的成功印跡是十分重要的，因此該方法將有望成為一種普適性蛋白質印跡法。另外，在雙水相體系中，親水性蛋白通常在表面活性劑較少的相中的分配系數(shù)較大，當磁性吸附劑（磁性微球）引入雙水相后，吸附目標蛋白，使其從表面活性劑較少的相進入富含表面活性劑的相，可加速相分離，提高生產(chǎn)能力。ＢｅｃｋｅｒＪＳ等將磁性吸附劑和雙水相體系結合，從溶菌酶和卵清蛋白混合體系中純化親水性蛋白溶菌酶，結果顯示溶菌酶最終回收產(chǎn)率達74％，純度超過80％。該方法可用于親水性蛋白的分離。3、磁性微球分離蛋白質的發(fā)展趨勢磁性微球在蛋白質分離純化領域的應用主要依賴于吸附容量高、選擇性好、可重復使用、價格便宜的磁性微球的制備。因此，應用于蛋白質分離純化領域的理想磁性微球的制備將是未來的發(fā)展趨勢之一。另外，隨著智能高分子材料的快速發(fā)展，將磁性微球與對外界環(huán)境（如溫度、ｐＨ、離子強度、光等）敏感的智能高分子材料相結合，合成智能型磁性微粒并將其用于蛋白質的分離純化中也將是未來的發(fā)展方向之一。三、磁性微球用于大豆基因組DNA純化研究我國自從1995年起，大豆就由凈出口變?yōu)閮暨M口，而且進口量呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。進口的大豆主要來源于美國、加拿大、巴西和阿根廷等轉基因作物的種植大國。我國種植的大豆均是非轉基因品種，這是我國大豆及其加工產(chǎn)品在國際競爭中的優(yōu)勢所在。目前，非轉基因大豆走俏國際市場，其價格要高出轉基因大豆15%～20%。加強轉基因大豆的檢測，全面實行“標簽制度”，對發(fā)展我國大豆產(chǎn)業(yè)具有重要意義，可使種植非轉基因大豆更加規(guī)范，保證我國非轉基因大豆的優(yōu)勢地位，預防轉基因大豆對我國市場的沖擊。目前，各國轉基因檢測機構對轉基因產(chǎn)品的檢測主要基于分子水平的檢測，而核酸提取的質量是影響后續(xù)分子鑒定的重要因素。轉基因產(chǎn)品檢測工作中，分子生物學檢測方法的敏感性和特異性很大程度上決定于樣品前處理環(huán)節(jié)（核酸提取過程）。與傳統(tǒng)的核酸提取方法相比，以納米磁珠為載體的核酸提取方法由于其操作簡單、提取結果重復性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點而成為一種非常有前景的提取方法，該方法已經(jīng)廣泛應用到植物病毒檢測中來。趙曉麗等研究了4-羧基苯硼酸修飾的納米粒子的制備過程，并應用磁性納米粒子對轉基因大豆基因組DNA進行提取和評價，來取代國外昂貴的相關試劑盒，能夠在相關轉基因檢測機構中進行推廣使用。其利用熱分解法合成Fe3O4磁性納米顆粒。具體如下：將0.5g乙酰丙酮鐵放入三口燒瓶中，然后加入20mL苯甲醇作為溶劑，室溫抽真空，再在氬氣保護下加熱至190℃，在此溫度下持續(xù)攪拌2h，得到黑色的膠體溶液。室溫自然冷卻后使用磁鐵收集產(chǎn)物，分別用正己烷和乙醇清洗數(shù)次，真空冷凍干燥48h，得到穩(wěn)定的Fe3O4。取合成的Fe3O4磁性納米顆粒10mg，分散于2mL乙醇中，超聲30min，加入30mg4-羧基苯硼酸，繼續(xù)超聲處理45min后呈透明膠體溶液，室溫放置過夜。將飽和氯化鈉溶液加入膠體溶液中，磁分離收集磁性納米粒子，分別用無水乙醇和去離子水清洗數(shù)次，真空冷凍干燥48h，即可獲得羧基苯硼酸修飾的磁性納米顆粒（CPBA-MNPs）。利用自動破碎儀破碎轉基因大豆和非轉基因大豆。分別稱取50mg樣本材料，利用CPBA-MNPs提取大豆基因組DNA，具體操作步驟如下：首先加入1mLCTAB裂解液（2%CTAB，1.4mol/LNaCl，pH8.0），混勻后65℃裂解10min，冷卻至室溫后加入2μLRNaseA1（50mg/μL），37℃孵育10min后加入100μL醋酸鉀（5mol/L，pH5.2），然后置于冰上6min；1200