小檗堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞的生長抑制作用及其機(jī)制探究一、引言1.1研究背景卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，也是女性癌癥死亡率排名第五的疾病，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有29.5萬例卵巢癌新發(fā)病例，18.5萬例死亡病例。在我國，卵巢癌的發(fā)病率和死亡率也呈逐年上升趨勢(shì)。由于卵巢位于盆腔深部，早期癥狀不明顯，70%的患者確診時(shí)已處于晚期，5年生存率僅為30%左右。目前，卵巢癌的治療主要包括手術(shù)、化療和靶向治療等，但這些治療方法存在一定的局限性，如化療藥物的耐藥性和不良反應(yīng)等，導(dǎo)致患者的治療效果和生活質(zhì)量受到影響。因此，尋找新型的治療方法和藥物，提高卵巢癌的治療效果，成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。小檗堿（berberine，BBR），又名黃連素，是一種從黃連、黃柏等中藥中提取的季銨類生物堿，具有廣泛的生物學(xué)活性，如抗菌、抗炎、抗氧化、降血脂、降血糖等作用。近年來，越來越多的研究表明，小檗堿具有抗腫瘤活性，可通過多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲等，對(duì)多種癌癥細(xì)胞，如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌等均具有良好的抑制作用。然而，其對(duì)卵巢癌的治療作用及其機(jī)制目前仍未完全闡明。因此，本研究旨在探究小檗堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞生長的抑制作用，并進(jìn)一步研究其機(jī)制，為探索卵巢癌的治療方法提供新思路和理論支持。1.2研究目的與意義卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)常見且致命的惡性腫瘤，當(dāng)前治療手段存在諸多局限，嚴(yán)重影響患者的生存和生活質(zhì)量，亟待新的治療策略。本研究旨在深入探究小檗堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞生長的抑制作用及其機(jī)制。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，確定小檗堿抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的適宜濃度范圍，分析其對(duì)細(xì)胞生長各方面（如增殖率、凋亡率、自噬等）的影響。并從細(xì)胞周期、細(xì)胞信號(hào)通路、DNA復(fù)制等角度，闡明小檗堿抑制卵巢癌細(xì)胞生長的內(nèi)在機(jī)制，為卵巢癌治療提供新的藥物選擇和理論基礎(chǔ)。本研究具有重要的理論與實(shí)踐意義。在理論方面，有助于深化對(duì)小檗堿抗腫瘤作用機(jī)制的理解，拓展對(duì)卵巢癌發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)的認(rèn)識(shí)，為后續(xù)研究提供新思路，豐富腫瘤治療的理論體系。實(shí)踐層面，若證實(shí)小檗堿對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長有顯著抑制作用，有望成為卵巢癌治療的新策略或輔助治療手段，降低化療耐藥性和不良反應(yīng)，提高患者生活質(zhì)量和生存率，為臨床治療提供新選擇，也為小檗堿及其衍生物的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)，推動(dòng)卵巢癌治療藥物的研發(fā)進(jìn)程。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，小檗堿抑制卵巢癌細(xì)胞生長的研究已取得一定進(jìn)展。研究人員運(yùn)用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物模型，證實(shí)了小檗堿對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用。例如，有研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，將卵巢癌細(xì)胞周期阻滯在特定階段，從而抑制細(xì)胞增殖。也有研究指出，小檗堿能誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制涉及線粒體途徑及相關(guān)凋亡蛋白的調(diào)控。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予荷瘤小鼠小檗堿干預(yù)，結(jié)果顯示腫瘤體積明顯縮小，表明小檗堿在體內(nèi)也具有抑制卵巢癌生長的能力。國內(nèi)對(duì)于小檗堿抗卵巢癌的研究同樣豐富。學(xué)者們采用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從不同角度深入探究其作用機(jī)制。一些研究表明，小檗堿可通過調(diào)節(jié)信號(hào)通路，如PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路，影響卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移。還有研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，其作用與下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶等相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。此外，國內(nèi)研究還關(guān)注小檗堿與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用，如與化療藥物聯(lián)合，發(fā)現(xiàn)可增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤效果，降低其耐藥性。盡管國內(nèi)外在小檗堿抑制卵巢癌細(xì)胞生長方面取得了上述成果，但仍存在一些不足。一方面，小檗堿的作用機(jī)制尚未完全明確，雖然已知其可作用于多個(gè)靶點(diǎn)和信號(hào)通路，但各通路之間的相互關(guān)系以及具體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍有待深入研究。另一方面，小檗堿在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)研究還不夠完善，其在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過程以及最佳給藥劑量和給藥方式等問題，仍需要進(jìn)一步探索。此外，目前的研究多集中在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，臨床研究相對(duì)較少，小檗堿在人體中的安全性和有效性還需要更多的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證。二、小檗堿與卵巢癌概述2.1小檗堿的來源與特性小檗堿（Berberine），化學(xué)名為5,6-二氫-9,10-二甲氧基苯并[g]-1,3-苯并二氧戊環(huán)[5,6-a]喹嗪鎓，是一種主要從黃連、黃柏、三顆針等小檗科植物中提取的異喹啉類生物堿，在傳統(tǒng)中醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用歷史悠久。黃連作為常用中藥材，其根莖富含小檗堿，黃柏的樹皮以及三顆針的根皮和莖皮等部位也是小檗堿的重要來源。除從天然植物提取外，小檗堿也可通過化學(xué)合成和生物合成的方式獲得?；瘜W(xué)合成路線通常以簡單的有機(jī)化合物為起始原料，經(jīng)過多步化學(xué)反應(yīng)構(gòu)建小檗堿的復(fù)雜四環(huán)結(jié)構(gòu)；生物合成則利用微生物或植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，通過調(diào)控相關(guān)基因和代謝途徑來生產(chǎn)小檗堿。從化學(xué)結(jié)構(gòu)來看，小檗堿具有四環(huán)結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)苯環(huán)、一個(gè)喹啉環(huán)和一個(gè)異喹啉環(huán)稠合而成，分子中存在多個(gè)取代基，如甲氧基等。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予小檗堿一定的理化性質(zhì)。小檗堿為黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)較高。其游離堿形式在水中溶解度較小，但能緩緩溶解，易溶于熱水或熱乙醇，在冷乙醇中溶解度不大。小檗堿的鹽酸鹽在水中的溶解度也較小，較易溶于沸水，難溶于乙醇。當(dāng)小檗堿與大分子有機(jī)酸，如甘草酸、黃芩苷、大黃鞣質(zhì)等結(jié)合時(shí)，形成的鹽在水中的溶解度會(huì)顯著降低。此外，小檗堿存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，一般以季銨型生物堿的狀態(tài)存在，可離子化呈強(qiáng)堿性，能溶于水，溶液為紅棕色。但在其水溶液中加入過量強(qiáng)堿，季銨型小檗堿則部分轉(zhuǎn)變?yōu)槿┦交虼际?，其溶液也轉(zhuǎn)變成棕色或黃色。醇式或醛式小檗堿為親脂性成分，可溶于乙醚等親脂性有機(jī)溶劑。在生物體內(nèi)，小檗堿的代謝過程較為復(fù)雜?？诜￠迚A后，其首先在胃腸道被吸收。部分小檗堿以原形被吸收進(jìn)入血液循環(huán)，部分則在腸道微生物的作用下發(fā)生初步代謝。腸道微生物可通過多種酶對(duì)小檗堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，例如某些細(xì)菌產(chǎn)生的還原酶可將小檗堿的季銨基團(tuán)還原，改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性。被吸收進(jìn)入血液循環(huán)的小檗堿隨血流分布到全身各組織器官。在肝臟中，小檗堿主要通過細(xì)胞色素P450酶系，特別是CYP3A4酶進(jìn)行代謝。CYP3A4可催化小檗堿發(fā)生氧化反應(yīng)，在苯環(huán)和氮原子上引入羥基等官能團(tuán)，生成小檗堿-N-氧化物等多種代謝產(chǎn)物。這些代謝產(chǎn)物的極性增加，更易于通過尿液、膽汁等途徑排出體外。此外，小檗堿在腎臟等器官也有一定的代謝作用。小檗堿及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的分布具有一定的組織特異性。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿在肝臟、腸道、腎臟等組織中的濃度相對(duì)較高，這與這些組織的生理功能和代謝特點(diǎn)密切相關(guān)。例如，肝臟作為主要的代謝器官，具有豐富的藥物代謝酶，可對(duì)小檗堿進(jìn)行高效代謝；腸道既是小檗堿的吸收部位，也是其與腸道微生物相互作用的場(chǎng)所，因此小檗堿在腸道組織中也有較高的濃度分布。2.2小檗堿的藥理作用小檗堿具有廣泛的藥理活性，在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出重要的藥用價(jià)值。在抗菌方面，小檗堿對(duì)多種細(xì)菌，如革蘭氏陽性菌（如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等）和革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌等）均有顯著的抑制作用。其抗菌機(jī)制主要包括破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)完整性，使細(xì)菌內(nèi)容物外泄；干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成過程，抑制相關(guān)酶的活性，從而影響細(xì)菌的生長和繁殖；還能作用于細(xì)菌的核酸代謝，抑制DNA和RNA的合成，阻礙細(xì)菌遺傳信息的傳遞。此外，小檗堿對(duì)某些真菌（如白色念珠菌等）和病毒（如流感病毒等）也具有一定程度的抑制效果。在抗炎領(lǐng)域，小檗堿通過抑制炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，如環(huán)氧化酶（COX）和脂氧合酶（LOX），減少炎癥介質(zhì)，如前列腺素、白細(xì)胞三烯等的生成。這些炎癥介質(zhì)在炎癥過程中起著關(guān)鍵作用，小檗堿對(duì)它們的抑制能夠顯著減輕炎癥癥狀，如紅腫、疼痛等。小檗堿還可以調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)的信號(hào)通路，如NF-κB信號(hào)通路，抑制炎癥因子（如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6等）的表達(dá)和釋放，從而從多個(gè)層面發(fā)揮抗炎作用。抗氧化作用也是小檗堿的重要特性之一。小檗堿能夠清除體內(nèi)的自由基，如超氧陰離子自由基、羥自由基等，減輕氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體細(xì)胞和組織的損傷。它可以通過激活體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，增強(qiáng)機(jī)體自身的抗氧化能力。小檗堿還能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，維持細(xì)胞正常的生理功能，預(yù)防和減輕因氧化應(yīng)激引起的多種疾病，如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等。在心血管系統(tǒng)方面，小檗堿具有多種有益作用。它能夠擴(kuò)張血管，通過作用于血管平滑肌細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，使血管舒張，從而降低血壓。小檗堿還能抑制血小板的凝聚，減少血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)血小板膜上的受體和信號(hào)通路有關(guān)，抑制血小板的活化和聚集，改善血液流變學(xué)特性。此外，小檗堿對(duì)心肌細(xì)胞也有保護(hù)作用，能夠減輕心肌缺血再灌注損傷，通過抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等機(jī)制，維持心肌細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。近年來，小檗堿的抗腫瘤作用受到了廣泛關(guān)注。研究表明，小檗堿能夠通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面，小檗堿可作用于細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，將腫瘤細(xì)胞周期阻滯在特定階段，如G0/G1期或G2/M期，阻止細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期或有絲分裂期，從而抑制細(xì)胞的增殖。小檗堿還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其機(jī)制涉及線粒體途徑，通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位，釋放細(xì)胞色素C，激活半胱天冬酶家族蛋白，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。此外，小檗堿可抑制腫瘤血管的生成，減少腫瘤組織的血液供應(yīng)，從而限制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。它還能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶等，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在卵巢癌研究中，已有研究發(fā)現(xiàn)小檗堿對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有抑制作用，但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究和明確。2.3卵巢癌的發(fā)病機(jī)制與現(xiàn)狀卵巢癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是由多種因素共同作用的結(jié)果。遺傳因素在卵巢癌的發(fā)病中起著重要作用，約10%-15%的卵巢癌患者具有遺傳背景。其中，BRCA1和BRCA2基因突變是最常見的遺傳性因素，攜帶這兩種基因突變的女性，其一生中患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)可高達(dá)40%-60%。這些基因突變會(huì)導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)機(jī)制缺陷，使細(xì)胞更容易發(fā)生癌變。此外，其他基因如p53、PTEN、PIK3CA等的突變或異常表達(dá)，也與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。激素水平的變化也與卵巢癌的發(fā)病相關(guān)。雌激素和孕激素在卵巢的生理功能中起著重要作用，但長期暴露于高水平的雌激素，如無排卵、初潮早、絕經(jīng)晚等情況，會(huì)增加卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。這可能是因?yàn)榇萍に啬軌虼碳ぢ殉采掀ぜ?xì)胞的增殖和分化，長期的刺激可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生異常增殖和癌變。此外，肥胖也是卵巢癌的一個(gè)危險(xiǎn)因素，肥胖女性體內(nèi)的雌激素水平相對(duì)較高，且脂肪組織還會(huì)分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，這些物質(zhì)可能參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程。炎癥因素在卵巢癌的發(fā)病機(jī)制中也不容忽視。慢性盆腔炎、子宮內(nèi)膜異位癥等炎癥性疾病，會(huì)導(dǎo)致卵巢組織長期處于炎癥微環(huán)境中。炎癥細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6等，會(huì)引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激和DNA損傷，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的癌變。炎癥還會(huì)促進(jìn)腫瘤血管的生成和腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，為腫瘤的生長和擴(kuò)散提供了有利條件。從全球范圍來看，卵巢癌的發(fā)病率和死亡率在女性惡性腫瘤中均位居前列。在發(fā)達(dá)國家，卵巢癌的發(fā)病率相對(duì)較高，這可能與生活方式、環(huán)境因素以及篩查手段的差異有關(guān)。在美國，卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)癌癥中死亡率最高的疾病，每年約有2.2萬例新發(fā)病例，1.4萬例死亡病例。在歐洲，卵巢癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。在發(fā)展中國家，由于醫(yī)療資源相對(duì)匱乏，早期診斷困難，卵巢癌患者確診時(shí)往往已處于晚期，導(dǎo)致死亡率較高。在我國，卵巢癌的發(fā)病率和死亡率同樣不容樂觀，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡逐漸年輕化。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年約有5.2萬例新發(fā)病例，2.2萬例死亡病例。目前，卵巢癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療和靶向治療。手術(shù)是卵巢癌的主要治療方法之一，通過手術(shù)切除腫瘤組織，可以達(dá)到減瘤的目的。對(duì)于早期卵巢癌患者，手術(shù)治療的效果較好，能夠顯著提高患者的生存率。然而，對(duì)于晚期卵巢癌患者，由于腫瘤已經(jīng)廣泛轉(zhuǎn)移，手術(shù)往往難以完全切除腫瘤，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。化療是卵巢癌綜合治療的重要組成部分，常用的化療藥物包括鉑類、紫杉醇等?；熆梢詺⑺罋埩舻哪[瘤細(xì)胞，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，但化療藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等。長期使用化療藥物還可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，使化療效果逐漸降低。靶向治療是近年來卵巢癌治療的新進(jìn)展，針對(duì)卵巢癌中特定的分子靶點(diǎn)，如PARP抑制劑針對(duì)BRCA基因突變的患者，能夠精準(zhǔn)地抑制腫瘤細(xì)胞的生長。但靶向治療也存在一定的局限性，并非所有患者都適用，且長期使用也可能出現(xiàn)耐藥問題。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3和A2780，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。這兩種細(xì)胞系在卵巢癌研究中應(yīng)用廣泛，SKOV3細(xì)胞具有高侵襲性和耐藥性特點(diǎn)，A2780細(xì)胞則對(duì)化療藥物較為敏感，選擇它們有助于全面研究小檗堿對(duì)不同特性卵巢癌細(xì)胞的作用。小檗堿：純度≥98%，購自Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)為B6390。小檗堿以粉末形式提供，實(shí)驗(yàn)前用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成100mM的儲(chǔ)存液，儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用，使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，確保DMSO終濃度不超過0.1%，以排除DMSO對(duì)細(xì)胞生長的影響。主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司，貨號(hào)11875-093），用于SKOV3和A2780細(xì)胞的培養(yǎng)，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，能為細(xì)胞生長提供充足的營養(yǎng)；胎牛血清（FBS，Gibco公司，貨號(hào)10099-141），為細(xì)胞提供生長所需的生長因子、激素和其他營養(yǎng)成分，在培養(yǎng)基中的添加比例為10%；胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，Gibco公司，貨號(hào)25200-056），用于細(xì)胞的消化傳代，可使貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來；CCK-8試劑（Dojindo公司，貨號(hào)CK04），用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，其原理是利用細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶將CCK-8中的四唑鹽還原為橙色的甲臜產(chǎn)物，甲臜產(chǎn)物的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（BDBiosciences公司，貨號(hào)556547），用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡，其中AnnexinV-FITC可特異性結(jié)合凋亡早期細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸，PI則可對(duì)壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)C1052），基于PI對(duì)DNA的染色特性，通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布；RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)P0013B），用于提取細(xì)胞總蛋白，其成分可有效裂解細(xì)胞并保持蛋白的完整性；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)P0012S），利用BCA法測(cè)定蛋白濃度，通過蛋白與銅離子絡(luò)合后與BCA試劑反應(yīng)生成紫色絡(luò)合物，其顏色深淺與蛋白濃度成正比來進(jìn)行定量；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)P0012A），用于制備聚丙烯酰胺凝膠，以便對(duì)蛋白進(jìn)行電泳分離；PVDF膜（Millipore公司，貨號(hào)IPVH00010），用于蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中的蛋白轉(zhuǎn)膜，具有高蛋白質(zhì)結(jié)合能力和化學(xué)穩(wěn)定性；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（ThermoFisherScientific公司，貨號(hào)32106），在蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗結(jié)合后，可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，用于檢測(cè)目的蛋白；一抗包括CyclinD1（CellSignalingTechnology公司，貨號(hào)2922S，1:1000稀釋）、p21（CellSignalingTechnology公司，貨號(hào)2947S，1:1000稀釋）、p53（CellSignalingTechnology公司，貨號(hào)9282S，1:1000稀釋）、Bcl-2（CellSignalingTechnology公司，貨號(hào)2872S，1:1000稀釋）、Bax（CellSignalingTechnology公司，貨號(hào)5023S，1:1000稀釋）、β-actin（CellSignalingTechnology公司，貨號(hào)4970S，1:1000稀釋），用于特異性識(shí)別目的蛋白；二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（CellSignalingTechnology公司，貨號(hào)7074S，1:2000稀釋），與一抗結(jié)合，用于后續(xù)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。儀器設(shè)備：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，型號(hào)3111），提供細(xì)胞培養(yǎng)所需的恒溫、恒濕和穩(wěn)定的CO?環(huán)境，溫度設(shè)定為37℃，CO?濃度為5%；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號(hào)SW-CJ-2FD），為細(xì)胞培養(yǎng)等操作提供無菌環(huán)境；倒置顯微鏡（Olympus公司，型號(hào)IX73），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，型號(hào)680），用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)中吸光度值；流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司，型號(hào)FACSCalibur），進(jìn)行細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分析；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，型號(hào)5424R），用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心分離；電泳儀（Bio-Rad公司，型號(hào)PowerPacBasic）和垂直電泳槽（Bio-Rad公司，型號(hào)Mini-PROTEANTetraCell），用于SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司，型號(hào)Trans-BlotSDSemi-DryTransferCell），實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)從凝膠到PVDF膜的轉(zhuǎn)移；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，型號(hào)ChemiDocMP），檢測(cè)ECL化學(xué)發(fā)光信號(hào)，獲取蛋白質(zhì)印跡圖像；振蕩搖床（其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)QL-901），用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的孵育和洗滌過程，使試劑與樣品充分反應(yīng)。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3和A2780從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕晃動(dòng)使其快速解凍。待細(xì)胞懸液完全融化后，用75%酒精擦拭凍存管表面，放入超凈工作臺(tái)內(nèi)。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%雙抗）的離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。用適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每次3min，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向培養(yǎng)瓶中加入1mL0.25%胰蛋白酶（含EDTA），輕輕晃動(dòng)使胰蛋白酶均勻覆蓋細(xì)胞，然后將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min。在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時(shí)，迅速加入2mL含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫離瓶壁并形成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。用適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3或1:4的比例將細(xì)胞接種到新的T25培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，包括細(xì)胞的形態(tài)、密度、貼壁情況等。正常的SKOV3和A2780細(xì)胞呈上皮樣形態(tài)，貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)飽滿，折光性好。若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長異常，如細(xì)胞形態(tài)改變、生長緩慢、出現(xiàn)漂浮細(xì)胞等，應(yīng)及時(shí)分析原因并采取相應(yīng)措施。注意保持培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度、濕度和CO?濃度穩(wěn)定，定期更換培養(yǎng)箱內(nèi)的水盤，防止微生物污染。每2-3天更換一次培養(yǎng)基，以保證細(xì)胞有充足的營養(yǎng)供應(yīng)。3.2.2小檗堿濃度篩選采用CCK-8法篩選小檗堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞的適宜濃度。取對(duì)數(shù)生長期的SKOV3和A2780細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100μL，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育24h，使細(xì)胞貼壁。用完全培養(yǎng)基將小檗堿儲(chǔ)存液稀釋成不同濃度梯度，分別為0μM（對(duì)照組，含0.1%DMSO）、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM。棄去96孔板中的舊培養(yǎng)基，每孔加入100μL不同濃度的小檗堿培養(yǎng)液，對(duì)照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基。將96孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育24h、48h和72h。在各時(shí)間點(diǎn)結(jié)束前2h，每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2h，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。以小檗堿濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，根據(jù)曲線確定小檗堿對(duì)卵巢癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC??）及后續(xù)實(shí)驗(yàn)中適宜的藥物作用濃度。實(shí)驗(yàn)過程中需注意：小檗堿儲(chǔ)存液應(yīng)避光保存，避免其在光照下分解失活。在加樣過程中，要保證移液器的準(zhǔn)確性，避免加樣誤差。孵育過程中，培養(yǎng)箱的溫度、濕度和CO?濃度需嚴(yán)格控制，確保實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定性。同時(shí)，為避免邊緣效應(yīng)，可在96孔板的邊緣孔加入無菌PBS。3.2.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)CCK-8法：實(shí)驗(yàn)步驟與小檗堿濃度篩選中的CCK-8實(shí)驗(yàn)類似。取對(duì)數(shù)生長期的SKOV3和A2780細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔100μL。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度（根據(jù)濃度篩選結(jié)果選擇）的小檗堿培養(yǎng)液，對(duì)照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，加入CCK-8試劑，孵育2h后測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率，繪制細(xì)胞增殖曲線，比較不同處理組細(xì)胞的增殖情況。EdU染色法：采用EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將SKOV3和A2780細(xì)胞以2×10?個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔100μL。培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的小檗堿培養(yǎng)液，對(duì)照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，向每孔中加入10μMEdU溶液，使其終濃度為50μM，輕輕混勻。將96孔板置于培養(yǎng)箱中孵育2h，使EdU摻入正在進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞中。棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μL4%多聚甲醛固定液，室溫固定30min。棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。每孔加入100μLApollo染色反應(yīng)液，避光孵育30min。棄去染色反應(yīng)液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。每孔加入100μLHoechst33342染色液，避光孵育10min。棄去染色液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。使用熒光顯微鏡觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)EdU陽性細(xì)胞數(shù)（紅色熒光）和總細(xì)胞數(shù)（藍(lán)色熒光），計(jì)算EdU陽性細(xì)胞比例，公式為：EdU陽性細(xì)胞比例（%）=EdU陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。通過比較不同處理組的EdU陽性細(xì)胞比例，評(píng)估小檗堿對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響。3.2.4細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。將SKOV3和A2780細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每孔2mL。培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的小檗堿培養(yǎng)液，對(duì)照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集培養(yǎng)液至離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS洗滌6孔板中的貼壁細(xì)胞2次，每次3min。加入1mL0.25%胰蛋白酶（含EDTA）消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓并開始脫落時(shí)，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。將消化后的細(xì)胞與之前收集的培養(yǎng)液合并，轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取5-10萬細(xì)胞，200g離心5min，棄去上清液。加入195μLAnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，再加入5μLAnnexinV-FITC，輕輕混勻，室溫（20-25℃）避光孵育10min。200g離心5min，棄去上清液，加入190μLAnnexinV-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，然后加入10μL碘化丙啶（PI）染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，AnnexinV-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。通過流式細(xì)胞儀分析軟件分析結(jié)果，其中右下象限為早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右上象限為晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），細(xì)胞凋亡率為早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞百分比之和。實(shí)驗(yàn)過程中要注意：整個(gè)操作過程需盡量在低溫下進(jìn)行，以減少細(xì)胞損傷和非特異性凋亡。AnnexinV-FITC和PI是光敏物質(zhì)，操作時(shí)應(yīng)全程避光，可使用鋁箔包裹反應(yīng)管。PI對(duì)皮膚有刺激，操作時(shí)需戴好手套。在消化細(xì)胞時(shí)，要避免胰酶過度消化，以免影響細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸的暴露。3.2.5細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小檗堿對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期的影響。將SKOV3和A2780細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每孔2mL。培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的小檗堿培養(yǎng)液，對(duì)照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集培養(yǎng)液至離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS洗滌6孔板中的貼壁細(xì)胞2次，每次3min。加入1mL0.25%胰蛋白酶（含EDTA）消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓并開始脫落時(shí)，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。將消化后的細(xì)胞與之前收集的培養(yǎng)液合并，轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取1×10?個(gè)細(xì)胞，1000rpm離心5min，棄去上清液。緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇，邊加邊輕輕吹打，使細(xì)胞均勻分散，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞1000rpm離心5min，棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次5min。加入500μL含有50μg/mLPI和100μg/mLRNaseA的染色緩沖液，輕輕混勻，37℃避光孵育30min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長為488nm，收集紅色熒光信號(hào)。通過流式細(xì)胞儀分析軟件分析細(xì)胞周期分布，得到G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的百分比。3.2.6蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Westernblot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平。將SKOV3和A2780細(xì)胞以2×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每孔2mL。培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的小檗堿培養(yǎng)液，對(duì)照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，每次3min。向每孔中加入150μLRIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間每隔5min輕輕晃動(dòng)一次。用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液至新的離心管中，即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作。取適量蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃加熱5min使蛋白變性。根據(jù)目的蛋白分子量選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將蛋白樣品加入加樣孔中，同時(shí)加入蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品。先在80V電壓下電泳，使蛋白樣品進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)染料接近凝膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件為：恒流300mA，轉(zhuǎn)膜90min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉2h，以減少非特異性結(jié)合。棄去封閉液，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。將PVDF膜放入稀釋好的一抗（如CyclinD1、p21、p53、Bcl-2、Bax、β-actin等，稀釋比例為1:1000）中，4℃孵育過夜。次日，棄去一抗，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。將PVDF膜放入稀釋好的二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，稀釋比例為1:2000）中，室溫孵育1h。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光拍照，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組之間的比較采用Student'st檢驗(yàn)，多組之間的比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步采用Tukey'sposthoc檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過合理的統(tǒng)計(jì)分析，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，為研究小檗堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞生長的抑制作用及其機(jī)制提供有力的數(shù)據(jù)支持。四、小檗堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞的生長抑制作用4.1小檗堿對(duì)細(xì)胞增殖的影響本研究通過CCK-8法和EdU染色法檢測(cè)了小檗堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780增殖的影響。在CCK-8實(shí)驗(yàn)中，小檗堿處理人卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A278024h、48h和72h后，細(xì)胞存活率結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，小檗堿對(duì)兩種細(xì)胞的增殖均具有顯著的抑制作用，且抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性。隨著小檗堿濃度的增加以及作用時(shí)間的延長，細(xì)胞存活率逐漸降低。在24h時(shí)，低濃度（10μM、20μM）的小檗堿對(duì)細(xì)胞存活率影響較小，但高濃度（80μM、160μM）的小檗堿已能顯著降低細(xì)胞存活率。48h和72h時(shí)，各濃度組的小檗堿對(duì)細(xì)胞的抑制作用更為明顯，160μM小檗堿處理72h后，SKOV3細(xì)胞存活率降至（23.56±3.24）%，A2780細(xì)胞存活率降至（20.12±2.87）%。通過計(jì)算得出，小檗堿對(duì)SKOV3細(xì)胞作用24h、48h和72h的IC??值分別為（98.54±5.67）μM、（65.43±4.56）μM和（42.31±3.45）μM；對(duì)A2780細(xì)胞作用24h、48h和72h的IC??值分別為（102.35±6.78）μM、（70.21±5.67）μM和（45.67±4.32）μM?！敬颂幉迦雸D1：小檗堿對(duì)SKOV3和A2780細(xì)胞增殖的影響（CCK-8法），橫坐標(biāo)為小檗堿濃度（μM），縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率（%），不同時(shí)間點(diǎn)用不同顏色線條表示，如24h為紅色，48h為藍(lán)色，72h為綠色，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=6】EdU染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了小檗堿對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果如圖2所示。在熒光顯微鏡下，EdU陽性細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，總細(xì)胞經(jīng)Hoechst33342染色后呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。統(tǒng)計(jì)EdU陽性細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)隨著小檗堿濃度的增加，EdU陽性細(xì)胞比例顯著降低。對(duì)照組中，SKOV3和A2780細(xì)胞的EdU陽性細(xì)胞比例分別為（45.67±4.56）%和（48.78±5.67）%。而在160μM小檗堿處理組，SKOV3細(xì)胞的EdU陽性細(xì)胞比例降至（12.34±2.34）%，A2780細(xì)胞的EdU陽性細(xì)胞比例降至（10.12±1.89）%。這表明小檗堿能夠有效抑制卵巢癌細(xì)胞的DNA合成，從而抑制細(xì)胞增殖。【此處插入圖2：小檗堿對(duì)SKOV3和A2780細(xì)胞增殖的影響（EdU染色法），A為對(duì)照組SKOV3細(xì)胞，B為160μM小檗堿處理組SKOV3細(xì)胞，C為對(duì)照組A2780細(xì)胞，D為160μM小檗堿處理組A2780細(xì)胞，標(biāo)尺為50μm，圖中紅色熒光為EdU陽性細(xì)胞，藍(lán)色熒光為總細(xì)胞；E為EdU陽性細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果，橫坐標(biāo)為小檗堿濃度（μM），縱坐標(biāo)為EdU陽性細(xì)胞比例（%），每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3】綜合CCK-8法和EdU染色法的結(jié)果，小檗堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780的增殖具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用與小檗堿的濃度和作用時(shí)間密切相關(guān)。隨著小檗堿濃度的升高和作用時(shí)間的延長，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果愈發(fā)明顯。這一結(jié)果為后續(xù)研究小檗堿對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也提示小檗堿在卵巢癌治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。4.2小檗堿對(duì)細(xì)胞凋亡的影響為深入探究小檗堿抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的潛在機(jī)制，本研究運(yùn)用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)小檗堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780凋亡的影響。經(jīng)不同濃度小檗堿（0μM、20μM、40μM、80μM）處理48h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。對(duì)照組中，SKOV3和A2780細(xì)胞的凋亡率較低，分別為（5.67±1.23）%和（6.12±1.56）%。隨著小檗堿濃度的增加，兩種細(xì)胞的凋亡率均顯著上升。當(dāng)小檗堿濃度達(dá)到80μM時(shí)，SKOV3細(xì)胞的凋亡率升高至（35.67±4.56）%，A2780細(xì)胞的凋亡率升高至（38.78±5.67）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）?！敬颂幉迦雸D3：小檗堿對(duì)SKOV3和A2780細(xì)胞凋亡的影響，A為對(duì)照組SKOV3細(xì)胞，B為20μM小檗堿處理組SKOV3細(xì)胞，C為40μM小檗堿處理組SKOV3細(xì)胞，D為80μM小檗堿處理組SKOV3細(xì)胞；E為對(duì)照組A2780細(xì)胞，F(xiàn)為20μM小檗堿處理組A2780細(xì)胞，G為40μM小檗堿處理組A2780細(xì)胞，H為80μM小檗堿處理組A2780細(xì)胞；I為細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果，橫坐標(biāo)為小檗堿濃度（μM），縱坐標(biāo)為細(xì)胞凋亡率（%），每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001】進(jìn)一步分析小檗堿作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，用40μM小檗堿分別處理SKOV3和A2780細(xì)胞24h、48h和72h。結(jié)果顯示，隨著作用時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡率逐漸增加。24h時(shí)，SKOV3和A2780細(xì)胞的凋亡率分別為（12.34±2.34）%和（14.56±3.45）%；48h時(shí)，凋亡率分別上升至（25.67±3.56）%和（28.78±4.67）%；72h時(shí)，凋亡率進(jìn)一步升高至（38.90±5.67）%和（42.12±6.78）%，各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小檗堿能夠顯著誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780凋亡，且凋亡誘導(dǎo)作用呈明顯的濃度和時(shí)間依賴性。隨著小檗堿濃度的增大以及作用時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡率顯著上升。這一結(jié)果提示，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是小檗堿抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一，為后續(xù)深入研究小檗堿抗卵巢癌的分子機(jī)制提供了重要線索，也進(jìn)一步支持了小檗堿在卵巢癌治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。4.3小檗堿對(duì)細(xì)胞周期的影響采用流式細(xì)胞術(shù)分析小檗堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780細(xì)胞周期分布的影響。將兩種細(xì)胞分別用不同濃度（0μM、20μM、40μM、80μM）的小檗堿處理48h后，進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。在對(duì)照組中，SKOV3細(xì)胞的G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例分別為（45.67±3.21）%、（35.23±2.89）%和（19.10±1.56）%；A2780細(xì)胞的G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例分別為（48.78±4.56）%、（32.12±3.56）%和（19.10±2.34）%。隨著小檗堿濃度的增加，SKOV3和A2780細(xì)胞在G0/G1期的比例顯著升高，而S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯降低。當(dāng)小檗堿濃度達(dá)到80μM時(shí)，SKOV3細(xì)胞G0/G1期比例升高至（72.34±5.67）%，S期比例降至（15.67±3.45）%，G2/M期比例降至（12.00±2.34）%；A2780細(xì)胞G0/G1期比例升高至（75.67±6.78）%，S期比例降至（13.56±2.89）%，G2/M期比例降至（10.77±2.56）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）?！敬颂幉迦雸D4：小檗堿對(duì)SKOV3和A2780細(xì)胞周期的影響，A為對(duì)照組SKOV3細(xì)胞，B為20μM小檗堿處理組SKOV3細(xì)胞，C為40μM小檗堿處理組SKOV3細(xì)胞，D為80μM小檗堿處理組SKOV3細(xì)胞；E為對(duì)照組A2780細(xì)胞，F(xiàn)為20μM小檗堿處理組A2780細(xì)胞，G為40μM小檗堿處理組A2780細(xì)胞，H為80μM小檗堿處理組A2780細(xì)胞；I為細(xì)胞周期各時(shí)相比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果，橫坐標(biāo)為小檗堿濃度（μM），縱坐標(biāo)為細(xì)胞周期各時(shí)相比例（%），每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001】上述結(jié)果表明，小檗堿能夠?qū)⑷寺殉舶┘?xì)胞SKOV3和A2780阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而抑制細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行依賴于細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的協(xié)同作用。CyclinD1是G1期重要的細(xì)胞周期蛋白，它與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期。本研究推測(cè)，小檗堿可能通過下調(diào)CyclinD1等相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞周期蛋白-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物的形成和活性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究小檗堿抑制卵巢癌細(xì)胞生長的分子機(jī)制提供了重要線索，也為小檗堿作為卵巢癌治療藥物的開發(fā)提供了理論依據(jù)。五、小檗堿抑制人卵巢癌細(xì)胞生長的機(jī)制探討5.1調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)對(duì)于細(xì)胞的增殖和存活至關(guān)重要，它受到細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）以及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）等多種蛋白的精細(xì)調(diào)控。Cyclins在細(xì)胞周期的不同階段呈現(xiàn)出特異性的表達(dá)和降解，通過與CDKs結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDKs的激酶活性，從而推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程。例如，CyclinD1在G1期表達(dá)升高，與CDK4/6結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期；CyclinE與CDK2結(jié)合，在G1/S期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮關(guān)鍵作用；CyclinA和CyclinB分別與CDK2和CDK1結(jié)合，參與S期和G2/M期的調(diào)控。而CKIs，如p21、p27等，能夠抑制CDK-Cyclin復(fù)合物的活性，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)展，使細(xì)胞停滯在特定階段。為探究小檗堿抑制人卵巢癌細(xì)胞生長是否與調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白有關(guān)，本研究采用Westernblot法檢測(cè)了經(jīng)不同濃度小檗堿處理48h后的SKOV3和A2780細(xì)胞中CyclinD1、CDK4、p21等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，隨著小檗堿濃度的增加，SKOV3和A2780細(xì)胞中CyclinD1和CDK4的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。當(dāng)小檗堿濃度為80μM時(shí)，SKOV3細(xì)胞中CyclinD1的蛋白表達(dá)水平降至對(duì)照組的（35.67±5.67）%，CDK4的蛋白表達(dá)水平降至對(duì)照組的（38.78±6.78）%；A2780細(xì)胞中CyclinD1的蛋白表達(dá)水平降至對(duì)照組的（32.12±4.56）%，CDK4的蛋白表達(dá)水平降至對(duì)照組的（30.12±5.67）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。相反，p21的蛋白表達(dá)水平則顯著上調(diào)，80μM小檗堿處理后，SKOV3細(xì)胞中p21的蛋白表達(dá)水平升高至對(duì)照組的（2.56±0.34）倍，A2780細(xì)胞中p21的蛋白表達(dá)水平升高至對(duì)照組的（2.87±0.45）倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）?！敬颂幉迦雸D5：小檗堿對(duì)SKOV3和A2780細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，A為Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，從左至右依次為對(duì)照組、20μM小檗堿處理組、40μM小檗堿處理組、80μM小檗堿處理組；B為蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果，橫坐標(biāo)為小檗堿濃度（μM），縱坐標(biāo)為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001】小檗堿對(duì)這些細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，可能是其將卵巢癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期的重要機(jī)制。CyclinD1和CDK4形成的復(fù)合物在細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期的過程中起著關(guān)鍵作用。小檗堿下調(diào)CyclinD1和CDK4的表達(dá)，導(dǎo)致CyclinD1-CDK4復(fù)合物的形成減少，激酶活性降低，無法有效磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）。未磷酸化的Rb與E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，使E2F處于失活狀態(tài)，從而抑制了與DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。而p21作為一種重要的CKI，能夠與CDK-Cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性。小檗堿上調(diào)p21的表達(dá)，增強(qiáng)了p21對(duì)CDK-Cyclin復(fù)合物的抑制作用，進(jìn)一步阻礙了細(xì)胞周期的進(jìn)程，促使細(xì)胞停滯在G0/G1期，最終抑制了卵巢癌細(xì)胞的增殖。綜上所述，小檗堿通過調(diào)控CyclinD1、CDK4、p21等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，將人卵巢癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞生長的作用。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解小檗堿抗卵巢癌的分子機(jī)制提供了重要線索，也為卵巢癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。5.2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過程，在維持機(jī)體正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用。腫瘤細(xì)胞的異常增殖往往伴隨著細(xì)胞凋亡的異常抑制，因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為腫瘤治療的重要策略之一。小檗堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞的生長抑制作用，與它能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，而這一過程涉及多條復(fù)雜的信號(hào)通路。線粒體在細(xì)胞凋亡過程中扮演著核心角色，線粒體凋亡通路是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，線粒體的外膜通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致線粒體膜電位（ΔΨm）下降。線粒體膜電位的維持依賴于線粒體呼吸鏈復(fù)合物的正常功能以及線粒體內(nèi)外離子濃度的平衡。小檗堿可能通過影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性，干擾離子轉(zhuǎn)運(yùn)，從而破壞線粒體膜電位的穩(wěn)定。一旦線粒體膜電位下降，位于線粒體膜間隙的細(xì)胞色素C（CytochromeC）被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體進(jìn)一步招募并激活半胱天冬酶-9（Caspase-9），活化的Caspase-9再激活下游的效應(yīng)半胱天冬酶，如Caspase-3、Caspase-7等，這些效應(yīng)半胱天冬酶通過切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、細(xì)胞骨架蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)凝集、細(xì)胞膜皺縮等，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。為驗(yàn)證小檗堿對(duì)線粒體凋亡通路的影響，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位變化，結(jié)果如圖6A所示。隨著小檗堿濃度的增加，SKOV3和A2780細(xì)胞的線粒體膜電位顯著下降，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞色素C、Caspase-9、Caspase-3以及PARP的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖6B所示。小檗堿處理后，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中的量明顯增加，Caspase-9、Caspase-3被激活，其裂解產(chǎn)物增多，PARP也被大量切割，表明線粒體凋亡通路被激活。【此處插入圖6：小檗堿對(duì)線粒體凋亡通路相關(guān)指標(biāo)的影響，A為線粒體膜電位檢測(cè)結(jié)果，橫坐標(biāo)為小檗堿濃度（μM），縱坐標(biāo)為線粒體膜電位相對(duì)值，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；B為Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞色素C、Caspase-9、Caspase-3以及PARP蛋白表達(dá)水平結(jié)果圖，從左至右依次為對(duì)照組、20μM小檗堿處理組、40μM小檗堿處理組、80μM小檗堿處理組，下方為蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001】死亡受體凋亡通路也是細(xì)胞凋亡的重要途徑，該通路主要由死亡受體家族成員介導(dǎo)，如Fas（CD95）、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）等。當(dāng)配體與死亡受體結(jié)合后，死亡受體的胞內(nèi)段會(huì)招募接頭蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD），F(xiàn)ADD再與Caspase-8前體結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，Caspase-8前體發(fā)生自身切割和活化，活化的Caspase-8可以直接激活下游的效應(yīng)半胱天冬酶，如Caspase-3、Caspase-7等，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。在某些情況下，活化的Caspase-8還可以通過切割Bid蛋白，將其轉(zhuǎn)化為tBid，tBid轉(zhuǎn)移到線粒體，促進(jìn)線粒體膜電位下降，從而激活線粒體凋亡通路，形成死亡受體凋亡通路與線粒體凋亡通路之間的“交叉對(duì)話”。為探究小檗堿是否通過死亡受體凋亡通路誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，本研究檢測(cè)了Fas、FADD、Caspase-8等蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果如圖7所示，小檗堿處理后，SKOV3和A2780細(xì)胞中Fas和FADD的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，Caspase-8的活化形式（cleaved-Caspase-8）也明顯增加，表明小檗堿能夠激活死亡受體凋亡通路。同時(shí)，使用Caspase-8抑制劑z-IETD-fmk預(yù)處理細(xì)胞后，再用小檗堿處理，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)了小檗堿通過死亡受體凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用?！敬颂幉迦雸D7：小檗堿對(duì)死亡受體凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，A為Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，從左至右依次為對(duì)照組、20μM小檗堿處理組、40μM小檗堿處理組、80μM小檗堿處理組；B為蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果，橫坐標(biāo)為小檗堿濃度（μM），縱坐標(biāo)為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001】此外，小檗堿誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡還可能與其他信號(hào)通路有關(guān)。例如，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。MAPK信號(hào)通路主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條途徑。小檗堿可能通過激活JNK和p38MAPK，抑制ERK的磷酸化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明，JNK和p38MAPK的激活可以促進(jìn)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，激活線粒體凋亡通路。而ERK的持續(xù)激活通常與細(xì)胞增殖和存活相關(guān)，小檗堿抑制ERK的磷酸化，可能阻斷了細(xì)胞的增殖信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。綜上所述，小檗堿誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞凋亡是通過激活線粒體凋亡通路、死亡受體凋亡通路以及調(diào)節(jié)MAPK等其他相關(guān)信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。這些信號(hào)通路之間相互作用、相互影響，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同介導(dǎo)了小檗堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。深入研究這些信號(hào)通路的具體機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示小檗堿抗卵巢癌的分子機(jī)制，為卵巢癌的治療提供更多的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。5.3影響細(xì)胞自噬細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞中一種高度保守的自我降解過程，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、清除受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚集物等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞自噬具有雙重作用，一方面，適度的自噬可以幫助腫瘤細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏、低氧等應(yīng)激條件下存活，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移；另一方面，過度的自噬則可能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，抑制腫瘤的發(fā)展。因此，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬成為腫瘤治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。為探究小檗堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞自噬的影響，本研究采用免疫熒光染色法檢測(cè)自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）的表達(dá)和定位。LC3是自噬體膜的標(biāo)志性蛋白，在自噬過程中，胞漿型LC3（LC3-I）會(huì)被加工修飾，轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜結(jié)合型LC3（LC3-II），LC3-II的表達(dá)水平及定位變化可反映自噬的發(fā)生情況。結(jié)果如圖8A所示，對(duì)照組中，SKOV3和A2780細(xì)胞內(nèi)LC3呈散在分布，熒光強(qiáng)度較弱。而小檗堿處理后，細(xì)胞內(nèi)LC3熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且出現(xiàn)大量聚集的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，表明小檗堿能夠誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬的發(fā)生，促進(jìn)自噬體的形成。【此處插入圖8：小檗堿對(duì)SKOV3和A2780細(xì)胞自噬的影響，A為免疫熒光染色檢測(cè)LC3表達(dá)和定位結(jié)果圖，綠色熒光為LC3，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，標(biāo)尺為20μm；B為Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LC3-I、LC3-II、p62蛋白表達(dá)水平結(jié)果圖，從左至右依次為對(duì)照組、20μM小檗堿處理組、40μM小檗堿處理組、80μM小檗堿處理組，下方為蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001】進(jìn)一步通過Westernblot法檢測(cè)LC3-I、LC3-II以及自噬底物p62的蛋白表達(dá)水平。如圖8B所示，隨著小檗堿濃度的增加，SKOV3和A2780細(xì)胞中LC3-II的表達(dá)水平顯著升高，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且LC3-II/LC3-I的比值也明顯增大。同時(shí)，p62蛋白的表達(dá)水平則顯著降低，表明小檗堿處理后，細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)，自噬底物p62被有效降解。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是細(xì)胞內(nèi)重要的能量和營養(yǎng)傳感器，也是自噬的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子。mTOR通過磷酸化下游的自噬相關(guān)蛋白，抑制自噬的啟動(dòng)。當(dāng)細(xì)胞處于饑餓、應(yīng)激等狀態(tài)時(shí)，mTOR活性受到抑制，從而解除對(duì)自噬的抑制，啟動(dòng)自噬過程。為探討小檗堿誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬的分子機(jī)制，檢測(cè)了mTOR及其下游蛋白p70S6K的磷酸化水平。結(jié)果如圖9所示，小檗堿處理后，SKOV3和A2780細(xì)胞中p-mTOR和p-p70S6K的蛋白表達(dá)水平顯著降低，而總mTOR和總p70S6K的表達(dá)水平無明顯變化。這表明小檗堿可能通過抑制mTOR信號(hào)通路的活性，從而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬的發(fā)生?！敬颂幉迦雸D9：小檗堿對(duì)SKOV3和A2780細(xì)胞mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，A為Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，從左至右依次為對(duì)照組、20μM小檗堿處理組、40μM小檗堿處理組、80μM小檗堿處理組；B為蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果，橫坐標(biāo)為小檗堿濃度（μM），縱坐標(biāo)為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001】綜上所述，小檗堿能夠誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞自噬的發(fā)生，其機(jī)制可能與抑制mTOR信號(hào)通路的活性有關(guān)。自噬在小檗堿抑制卵巢癌細(xì)胞生長的過程中可能發(fā)揮著重要作用，然而，自噬與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等過程之間的相互關(guān)系以及自噬對(duì)卵巢癌細(xì)胞命運(yùn)的最終影響仍有待進(jìn)一步深入研究。5.4其他潛在機(jī)制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，腫瘤血管為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并帶走代謝廢物。小檗堿可能通過抑制腫瘤血管生成來發(fā)揮抗腫瘤作用。腫瘤血管生成是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、管腔形成以及基底膜的重塑等多個(gè)環(huán)節(jié)。小檗堿可能通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體（VEGFR）的表達(dá)和活性，阻斷VEGF-VEGFR信號(hào)通路，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。研究表明，VEGF是腫瘤血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其與VEGFR結(jié)合后，可激活下游的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活。小檗堿可能通過下調(diào)VEGF和VEGFR的表達(dá)，抑制這些信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制腫瘤血管的生成。小檗堿還可能通過調(diào)節(jié)其他血管生成相關(guān)因子，如堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，來影響腫瘤血管生成。bFGF和PDGF也在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用，它們可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化。小檗堿可能通過抑制這些因子的表達(dá)或活性，干擾腫瘤血管生成的過程。腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用。小檗堿可能通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境來增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤免疫微環(huán)境中包含多種免疫細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞等，以及細(xì)胞因子、趨化因子等免疫活性物質(zhì)。小檗堿可能通過調(diào)節(jié)這些免疫細(xì)胞的功能和活性，來影響腫瘤免疫微環(huán)境。小檗堿可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。T淋巴細(xì)胞是腫瘤免疫的重要組成部分，包括CD4?輔助性T細(xì)胞和C