WB實(shí)驗(yàn)詳細(xì)操作步驟及注意事項(xiàng)蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot，WB）是分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究中檢測(cè)特定蛋白表達(dá)、修飾的核心技術(shù)。其原理基于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的蛋白分離、轉(zhuǎn)膜后的抗原-抗體特異性結(jié)合，最終通過化學(xué)發(fā)光或顯色反應(yīng)可視化目標(biāo)蛋白。以下從樣本制備到結(jié)果分析，詳述WB實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵操作與實(shí)操要點(diǎn)。一、樣本制備：從組織/細(xì)胞到蛋白提取物（一）組織/細(xì)胞樣本處理組織樣本：新鮮組織離體后，立即用預(yù)冷的PBS沖洗殘留血液，液氮速凍（<5min）后轉(zhuǎn)移至-80℃保存（延緩蛋白降解）。提取時(shí)，按“組織重量:裂解液體積=1:10~1:20”的比例，加入含蛋白酶抑制劑（如1mMPMSF、蛋白酶抑制劑雞尾酒）和磷酸酶抑制劑（如Na?VO?、NaF，研究磷酸化蛋白時(shí)需加）的RIPA或NP-40裂解液，冰上勻漿（手動(dòng)或電動(dòng)勻漿器）或超聲破碎（功率200~300W，每次5s，間隔10s，重復(fù)5~10次）。4℃、____rpm離心15min，取上清（總蛋白提取物），-80℃分裝保存（避免反復(fù)凍融）。細(xì)胞樣本：貼壁細(xì)胞棄培養(yǎng)基后，預(yù)冷PBS洗2次，加裂解液（同組織）后冰上裂解15~30min（期間輕搖培養(yǎng)皿），后續(xù)處理同組織樣本；懸浮細(xì)胞直接離心（3000rpm、5min）收集，PBS洗后加裂解液處理。（二）蛋白濃度定量（以BCA法為例）1.標(biāo)準(zhǔn)品配制：用PBS稀釋BSA至0、25、50、100、200μg/ml（根據(jù)預(yù)期蛋白濃度調(diào)整范圍）。2.加樣與反應(yīng)：96孔板中每孔加20μl標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，隨后加200μlBCA工作液（A液:B液=50:1，現(xiàn)配現(xiàn)用），37℃孵育30min。3.檢測(cè)與計(jì)算：酶標(biāo)儀測(cè)562nm吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入樣品吸光度計(jì)算濃度。注意：樣品需稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)（如吸光度<2.0）；加樣時(shí)槍頭避免掛壁，保證體積準(zhǔn)確；BCA工作液需充分混勻，避免局部濃度不均。二、SDS-PAGE電泳：蛋白的“分子篩”分離（一）凝膠制備（以垂直板膠為例）1.分離膠（如10%，分子量30~200kD蛋白適用）按比例混合：分離膠緩沖液（Tris-HCl，pH8.8）3.9ml、acrylamide（30%）3.3ml、水4.8ml、10%APS100μl、TEMED10μl?？焖倩靹蚝?，沿玻璃板間隙緩慢灌膠（預(yù)留積層膠空間，約距梳子齒1cm），立即加無水乙醇封層（促進(jìn)膠面平整），室溫靜置30min至膠凝固（膠與乙醇分層，膠面透明）。2.積層膠（5%）倒去乙醇，濾紙吸干殘留液體，按比例混合：積層膠緩沖液（Tris-HCl，pH6.8）0.5ml、acrylamide0.33ml、水2.17ml、10%APS50μl、TEMED5μl。混勻后灌膠至玻璃板頂部，插入梳子（避免氣泡），室溫靜置30min待膠凝固。注意：acrylamide具神經(jīng)毒性，操作時(shí)戴手套、口罩，通風(fēng)櫥內(nèi)操作；APS現(xiàn)配現(xiàn)用（4℃保存不超過1周），TEMED易揮發(fā)，需密封避光保存。（二）上樣與電泳1.樣品處理：根據(jù)蛋白濃度，取適量樣品與5×上樣緩沖液（含β-巰基乙醇，還原蛋白二硫鍵）按4:1體積比混合，100℃煮5~10min（或70℃10min，磷酸化蛋白可縮短時(shí)間），瞬時(shí)離心后備用。2.上樣：小心拔出梳子，用1×電泳緩沖液（Tris-甘氨酸緩沖液）沖洗加樣孔（去除殘留膠塊）。按預(yù)定上樣量（20~50μg）加樣，空白孔加等量上樣緩沖液（維持電場(chǎng)均勻）。3.電泳：接通電源，積層膠階段（溴酚藍(lán)在積層膠中）用低電壓（50~80V），待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，調(diào)至高電壓（100~120V），電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)膠底部（約1~2h）。注意：上樣時(shí)避免樣品溢出或產(chǎn)生氣泡；電泳過程中膠板若發(fā)熱（尤其是高電壓時(shí)），可冰浴降溫（防止蛋白降解、電泳不均）；不同分子量蛋白需調(diào)整膠濃度（如30kD以下用15%膠，200kD以上用5%~8%膠）。三、轉(zhuǎn)膜：蛋白從膠到膜的“轉(zhuǎn)移”（一）膜的選擇與預(yù)處理PVDF膜：結(jié)合力強(qiáng)，需用甲醇預(yù)激活（浸泡30s，激活疏水基團(tuán)），立即轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液（Tris-甘氨酸緩沖液+20%甲醇）中平衡10min。NC膜：結(jié)合力稍弱，可直接用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡10min。（二）轉(zhuǎn)膜裝置組裝在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液浸濕的海綿上，按“濾紙（厚）-膠-膜-濾紙（厚）”順序組裝，確保膠與膜完全貼合（用玻璃棒滾動(dòng)排除氣泡，氣泡會(huì)導(dǎo)致局部轉(zhuǎn)膜失?。Ｄさ牡鞍酌妫ㄅc膠接觸的一面）需標(biāo)記（如用筆輕劃一角）。（三）轉(zhuǎn)膜條件恒壓轉(zhuǎn)膜：200mA，30~60min（小分子蛋白30min，大分子如>200kD可延長(zhǎng)至90min或4℃、100V過夜）。恒流轉(zhuǎn)膜：0.8mA/cm2膜面積（如8×10cm膜，電流64mA）。注意：轉(zhuǎn)膜產(chǎn)熱明顯，需冰?。ㄞD(zhuǎn)膜槽置于冰盒上）；轉(zhuǎn)膜緩沖液需預(yù)冷，且含甲醇（維持蛋白疏水性，防止蛋白在膠中擴(kuò)散）；轉(zhuǎn)膜后可麗春紅染色（或直接孵育內(nèi)參抗體）驗(yàn)證轉(zhuǎn)膜效果（條帶清晰、無空白區(qū)域?yàn)槌晒ΓＫ?、封閉與抗體孵育：抗原-抗體的“特異性結(jié)合”（一）封閉將轉(zhuǎn)膜后的膜放入封閉液（5%脫脂牛奶或BSA，磷酸化蛋白用BSA，避免牛奶中內(nèi)源性蛋白干擾）中，室溫?fù)u床封閉1~2h，或4℃封閉過夜（更充分）。封閉液需完全覆蓋膜，搖床轉(zhuǎn)速適中（避免膜漂浮或摩擦損傷）。（二）一抗孵育用含0.1%Tween-20的封閉液（TBST）稀釋一抗（按說明書，通常1:500~1:2000），將膜放入一抗溶液中，4℃搖床孵育過夜（或室溫2h，抗體親和力高時(shí)可縮短）。注意：一抗現(xiàn)用現(xiàn)配，避免反復(fù)凍融；孵育容器密封（防止液體蒸發(fā)）；稀有抗體可提高濃度（如1:200）或延長(zhǎng)孵育時(shí)間（如室溫4h），但需梯度驗(yàn)證最佳條件。（三）二抗孵育選擇與一抗種屬對(duì)應(yīng)的二抗（如兔抗一抗用goatanti-rabbit），TBST稀釋（1:5000~1:____），室溫?fù)u床孵育1h。孵育后用TBST洗膜3次，每次10min（徹底去除未結(jié)合二抗，減少背景）。五、顯影與結(jié)果分析：蛋白的“可視化”（一）化學(xué)發(fā)光顯影（以ECL為例）1.底物孵育：顯影液（A液:B液=1:1，現(xiàn)配現(xiàn)用）平衡至室溫，滴加適量于膜的蛋白面，避光孵育1~5min（根據(jù)蛋白豐度調(diào)整時(shí)間）。2.曝光與顯影：用濾紙吸干膜上多余液體（勿摩擦），放入曝光盒，依次用X膠片（暗室中，先短時(shí)間曝光如10s，顯影后若條帶弱則延長(zhǎng)至30s、1min）或化學(xué)發(fā)光成像儀（自動(dòng)曝光，可調(diào)整時(shí)間）曝光。（二）結(jié)果分析用ImageJ等軟件定量條帶灰度值，需滿足：內(nèi)參（如GAPDH、β-actin）條帶清晰、灰度值差異<20%（保證上樣量均一）；目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶的比值為相對(duì)表達(dá)量，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)（n≥3）減少誤差。六、關(guān)鍵注意事項(xiàng)總結(jié)1.防降解與污染：全程戴手套，樣本處理、試劑配制在冰上或4℃進(jìn)行；蛋白酶/磷酸酶抑制劑現(xiàn)用現(xiàn)加，避免蛋白降解。2.膠與膜的完整性：灌膠時(shí)避免氣泡，轉(zhuǎn)膜時(shí)排除氣泡；膜的預(yù)處理（PVDF膜甲醇激活）不可省略，否則蛋白結(jié)合力弱。3.抗體特異性：一抗需驗(yàn)證種屬、交叉反應(yīng)（如用陰性對(duì)照組織）；二抗避免與封閉液蛋白的抗體交叉（如牛奶封閉時(shí)，二抗不可為抗牛蛋白抗體）。