山芝麻酸甲酯對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞ERK信號通路調(diào)控機(jī)制探究一、引言1.1研究背景肝纖維化是眾多慢性肝病發(fā)展至肝硬化的關(guān)鍵病理階段，嚴(yán)重威脅人類健康。全球范圍內(nèi)，由肝纖維化引發(fā)的終末期肝病每年致使超過120萬人死亡，其危害不容小覷。肝纖維化的本質(zhì)是肝臟在遭受如病毒性肝炎、酒精中毒、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝炎和膽汁淤積性肝病等多種病因的長期損害后，肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞等過度分泌細(xì)胞因子、活性氧、趨化因子和生長因子。這些物質(zhì)刺激肝星狀細(xì)胞（HSC），促使其增殖、合成并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），這些ECM在肝臟中不斷積累，逐漸形成纖維瘢痕，取代受損的正常組織，最終導(dǎo)致肝臟組織結(jié)構(gòu)和功能的嚴(yán)重異常。在肝纖維化發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，肝星狀細(xì)胞的活化起著核心作用。正常情況下，肝星狀細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，主要功能是儲存維生素A。然而，當(dāng)肝臟受到損傷時，炎癥介質(zhì)會迅速促使肝星狀細(xì)胞活化，使其轉(zhuǎn)化為具有遷移和增殖能力的肌成纖維細(xì)胞。此時，活化的肝星狀細(xì)胞不僅大量分泌ECM蛋白，如膠原蛋白等，還分泌金屬蛋白酶的組織抑制劑，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶對ECM的降解，導(dǎo)致ECM在肝臟中過度沉積，進(jìn)而引發(fā)肝纖維化。研究表明，抑制肝星狀細(xì)胞的活化，能有效減緩甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程。血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）作為一種強(qiáng)效的促有絲分裂原和趨化因子，在肝星狀細(xì)胞活化過程中扮演重要角色。當(dāng)肝臟受損時，PDGF-BB被大量釋放，與肝星狀細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促使肝星狀細(xì)胞從靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，誘導(dǎo)其增殖、遷移以及ECM的合成與分泌，從而推動肝纖維化的發(fā)展。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，PDGF-BB刺激肝星狀細(xì)胞后，可激活ERK信號通路，使ERK發(fā)生磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游多種轉(zhuǎn)錄因子和靶基因的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移和存活等生物學(xué)過程，在肝星狀細(xì)胞活化和肝纖維化形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。山芝麻是梧桐科山芝麻屬植物山芝麻（HelicteresangustifoliaL.）的干燥根，作為一種傳統(tǒng)草藥，在我國南方地區(qū)被廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，山芝麻具有多種藥理活性，如抗肝纖維化、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等。山芝麻酸甲酯作為山芝麻的主要活性成分之一，近年來在抗肝纖維化領(lǐng)域受到關(guān)注。已有研究表明，山芝麻酸甲酯能顯著降低四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）等含量，減少肝臟損傷和纖維間隙的形成，還能調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，抑制肝星狀細(xì)胞的活化。然而，山芝麻酸甲酯對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞ERK信號通路的影響尚未明確，深入研究這一作用機(jī)制，對于揭示山芝麻酸甲酯抗肝纖維化的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制，開發(fā)新型抗肝纖維化藥物具有重要意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究山芝麻酸甲酯對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞ERK信號通路的影響，明確其在分子水平上抗肝纖維化的作用機(jī)制。肝纖維化是慢性肝病發(fā)展至肝硬化的關(guān)鍵階段，嚴(yán)重威脅人類健康，然而目前臨床上抗肝纖維化的特效藥物仍較為匱乏。山芝麻酸甲酯作為山芝麻的主要活性成分，已有研究初步證實(shí)其具有抗肝纖維化的潛力，但作用機(jī)制尚未完全闡明。通過研究山芝麻酸甲酯對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞ERK信號通路的調(diào)控作用，能夠揭示其在肝星狀細(xì)胞活化及肝纖維化進(jìn)程中的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為開發(fā)新型、有效的抗肝纖維化藥物提供理論依據(jù)和潛在的藥物靶點(diǎn)。這不僅有助于豐富肝纖維化的治療手段，提高臨床治療效果，還能為肝纖維化患者帶來新的治療希望，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。二、肝纖維化、肝星狀細(xì)胞與ERK信號通路概述2.1肝纖維化的現(xiàn)狀與危害肝纖維化作為慢性肝病發(fā)展進(jìn)程中的關(guān)鍵病理階段，在全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康，其發(fā)病率居高不下。一項(xiàng)系統(tǒng)綜述和薈萃分析評估了全球晚期纖維化和肝硬化的患病率，該研究檢索了多個權(quán)威數(shù)據(jù)庫，納入了眾多橫斷面研究，涉及來自21個國家的約800萬參與者，結(jié)果顯示全球一般人群中晚期肝纖維化的合并患病率為3.3%，肝硬化的合并患病率為1.3%，且2016年后呈現(xiàn)出明顯的增加趨勢。在中國，肝纖維化同樣是一個嚴(yán)峻的健康問題，北京大學(xué)李立明團(tuán)隊(duì)基于全國5757335名參與者的研究發(fā)現(xiàn)，晚期纖維化的患病率達(dá)到2.85%，肝硬化患病率為0.87%。肝纖維化若得不到有效控制，將逐漸發(fā)展為肝硬化，引發(fā)一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，如門靜脈高壓、食管靜脈曲張破裂出血、腹水、肝性腦病等，顯著增加患者的死亡風(fēng)險。據(jù)統(tǒng)計，全球每年有超過120萬人死于肝纖維化導(dǎo)致的終末期肝病。肝纖維化還是肝細(xì)胞癌發(fā)生的重要危險因素，持續(xù)的肝纖維化會導(dǎo)致肝臟微環(huán)境改變，促進(jìn)肝細(xì)胞的異常增殖和惡變，進(jìn)而引發(fā)肝癌。有研究表明，在肝硬化患者中，每年肝癌的發(fā)生率約為3%-5%，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和預(yù)期壽命。肝纖維化不僅對患者的身體健康造成嚴(yán)重影響，還給社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，包括醫(yī)療費(fèi)用支出、患者因病缺勤導(dǎo)致的生產(chǎn)力損失等。2.2肝星狀細(xì)胞在肝纖維化中的角色2.2.1肝星狀細(xì)胞的生理特性肝星狀細(xì)胞（HSC）在肝臟的正常生理功能維持中扮演著不可或缺的角色，它在肝臟細(xì)胞構(gòu)成中占據(jù)一定比例，約占肝臟固有細(xì)胞總數(shù)的15%，占非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的30%左右。HSC主要棲息于肝臟的Disse腔，這一特殊的解剖位置使其與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞緊密相鄰，能夠進(jìn)行高效的物質(zhì)交換和信號傳遞。從形態(tài)上看，HSC呈梭形或多邊形，細(xì)胞內(nèi)含有多個脂滴，這些脂滴富含維生素A，賦予了HSC獨(dú)特的生理功能。其細(xì)長的突起向外延伸，環(huán)繞在血竇內(nèi)皮細(xì)胞外面，這種形態(tài)結(jié)構(gòu)有助于HSC對肝竇微循環(huán)的調(diào)節(jié)。在正常肝臟中，HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，此時它不表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），細(xì)胞的增殖活性較低，合成膠原的能力也較弱。其主要功能集中在維生素A的貯存和代謝方面，肝臟中儲存著體內(nèi)約80%的維生素A，而HSC則是儲存視黃醛衍生物的首要部位。視黃醛在小腸內(nèi)酯化后，被運(yùn)輸?shù)礁闻K并與特異的視黃醛結(jié)合蛋白結(jié)合，然后轉(zhuǎn)運(yùn)至HSC儲存，這一過程對于維持體內(nèi)維生素A的平衡至關(guān)重要。HSC還參與脂肪的儲存，其胞質(zhì)內(nèi)的脂滴含有大量甘油三酯，在必要時可為肝細(xì)胞提供能源支持。HSC也是正常及纖維化肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要合成細(xì)胞，正常情況下，其合成的膠原以Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型為主，合成量遠(yuǎn)超肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。它還能合成纖維連接蛋白、層連蛋白和粗纖維調(diào)理素等糖蛋白成分，以及硫酸皮素、硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸等蛋白多糖。HSC能夠合成基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）及其組織抑制劑（TIMP），通過分泌多種膠原酶和基質(zhì)降解蛋白酶，如MMP-1、MMP-2等，降解各種細(xì)胞外基質(zhì)，同時分泌TIMP-1防止膠原過度降解，使肝臟ECM的合成和分解維持在動態(tài)平衡狀態(tài)。HSC還可以分泌肝細(xì)胞生長因子（HGF），參與肝細(xì)胞再生的調(diào)控，同時表達(dá)少量的轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）、血小板衍生的生長因子（PDGF）和胰島素樣生長因子（IGF）等，以及TGF-β1的II、III型受體和PDGF受體的α亞單位等，通過這些細(xì)胞因子和受體的作用，HSC在肝臟的生理調(diào)節(jié)中發(fā)揮著復(fù)雜而精細(xì)的作用。2.2.2肝星狀細(xì)胞的活化與肝纖維化的發(fā)生當(dāng)肝臟受到諸如炎癥、病毒感染、藥物損傷、酒精刺激或機(jī)械刺激等多種因素的損傷時，肝星狀細(xì)胞會被激活，這一活化過程是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝星狀細(xì)胞的活化是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及細(xì)胞形態(tài)、功能和基因表達(dá)等多方面的改變。在活化過程中，HSC的維生素A脂滴逐漸減少甚至消失，這是其活化的早期特征之一。同時，細(xì)胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量增加，為蛋白質(zhì)合成提供了更多的場所，細(xì)胞體積也隨之增大。HSC開始向肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞（MFC）轉(zhuǎn)化，表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），這是活化HSC的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)水平的升高反映了HSC的活化程度。此時，HSC的增殖能力顯著增強(qiáng)，大量分裂增殖，使得細(xì)胞數(shù)量迅速增加。細(xì)胞因子在肝星狀細(xì)胞活化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。其中，血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）是一種強(qiáng)效的促有絲分裂原和趨化因子，在HSC活化中扮演重要角色。當(dāng)肝臟受損時，炎癥細(xì)胞、血小板等會釋放大量的PDGF-BB，其與HSC表面的特異性受體結(jié)合，激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等。這些通路的激活促使HSC從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，誘導(dǎo)其增殖、遷移。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）也是一種重要的促纖維化細(xì)胞因子，它主要由肝臟中的Kupffer細(xì)胞、血小板和內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生。TGF-β與HSC表面的受體結(jié)合后，激活Smad信號通路，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，促進(jìn)HSC合成和分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)。TGF-β還能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達(dá)，同時上調(diào)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）的表達(dá)，從而抑制ECM的降解，導(dǎo)致ECM在肝臟中過度沉積。活化的肝星狀細(xì)胞會大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），這是導(dǎo)致肝纖維化的直接原因。正常情況下，肝臟中ECM的合成和降解處于動態(tài)平衡，以維持肝臟的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，當(dāng)HSC活化后，這種平衡被打破。HSC合成的ECM主要包括膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等，其中膠原蛋白的含量顯著增加，尤其是Ⅰ型和Ⅲ型膠原。這些膠原在肝臟中大量沉積，形成纖維瘢痕組織，逐漸取代正常的肝臟組織。纖維瘢痕組織的不斷積累，使得肝臟的正常結(jié)構(gòu)被破壞，肝小葉被分割，假小葉形成，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟的血液循環(huán)和代謝功能障礙，最終發(fā)展為肝硬化。有研究表明，在四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型中，隨著肝纖維化程度的加重，肝組織中活化的HSC數(shù)量明顯增加，同時ECM的含量也顯著上升，兩者呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)關(guān)系。這充分說明了肝星狀細(xì)胞的活化以及其分泌ECM的增加在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的核心作用。2.3PDGF-BB信號通路與肝星狀細(xì)胞活化血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）作為血小板衍生生長因子（PDGF）家族中的重要成員，在肝星狀細(xì)胞（HSC）活化以及肝纖維化進(jìn)程中發(fā)揮著核心作用。PDGF家族包含PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-DD五種不同的二聚體形式，其中PDGF-BB是對HSC作用最強(qiáng)的亞型。PDGF-BB是一種由兩條相同的B鏈通過二硫鍵連接而成的二聚體糖蛋白，其分子量約為30-35kDa。在肝臟受到損傷時，多種細(xì)胞如血小板、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和活化的肝星狀細(xì)胞等會大量分泌PDGF-BB。這些PDGF-BB被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，與肝星狀細(xì)胞表面的特異性受體相結(jié)合，從而啟動細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。肝星狀細(xì)胞表面存在兩種類型的PDGF受體，分別為α受體（PDGFR-α）和β受體（PDGFR-β）。這兩種受體均屬于受體酪氨酸激酶家族，由胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域組成。PDGF-BB與PDGFR-α和PDGFR-β具有較高的親和力，能夠特異性地與之結(jié)合。當(dāng)PDGF-BB與受體結(jié)合后，會引起受體二聚化，進(jìn)而激活受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶活性。受體自身的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，形成多個磷酸酪氨酸位點(diǎn)。這些磷酸化的酪氨酸位點(diǎn)能夠招募并結(jié)合含有Src同源2（SH2）結(jié)構(gòu)域的下游信號分子，從而激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路是PDGF-BB激活的重要信號通路之一。當(dāng)PDGF-BB與受體結(jié)合并使受體磷酸化后，含有SH2結(jié)構(gòu)域的p85調(diào)節(jié)亞基能夠識別并結(jié)合受體上的磷酸酪氨酸位點(diǎn)，從而激活PI3K的催化亞基p110。激活的PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募并激活A(yù)kt。Akt通過磷酸化多種下游底物，如糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活、代謝和遷移等生物學(xué)過程。在肝星狀細(xì)胞中，PI3K/Akt通路的激活能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，抑制細(xì)胞凋亡，從而在肝纖維化過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，在PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞中，抑制PI3K/Akt通路的活性，能夠顯著降低細(xì)胞的增殖能力和遷移能力，提示該通路在PDGF-BB誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化中具有關(guān)鍵作用。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路也是PDGF-BB激活的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。MAPK通路主要包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條亞通路。在PDGF-BB刺激下，受體的磷酸化能夠激活鳥苷酸交換因子（GEF），如SOS等。GEF促使Ras蛋白結(jié)合的GDP轉(zhuǎn)換為GTP，從而激活Ras。激活的Ras進(jìn)一步激活Raf蛋白激酶，Raf再依次磷酸化并激活MEK1/2，MEK1/2最終磷酸化并激活ERK1/2。激活的ERK1/2能夠進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos、c-Jun等，從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移和存活等生物學(xué)過程。在肝星狀細(xì)胞中，ERK信號通路的激活與細(xì)胞的增殖和活化密切相關(guān)。當(dāng)PDGF-BB刺激肝星狀細(xì)胞時，ERK1/2的磷酸化水平顯著升高，細(xì)胞的增殖能力也隨之增強(qiáng)。抑制ERK信號通路的活性，能夠有效抑制肝星狀細(xì)胞的增殖和活化，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌，從而減輕肝纖維化程度。研究還發(fā)現(xiàn)，JNK和p38MAPK通路在PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞中也被激活，它們可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、凋亡和纖維化相關(guān)基因的表達(dá)等，參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。PDGF-BB激活的信號通路對肝星狀細(xì)胞的生物學(xué)行為具有多方面的影響。在細(xì)胞增殖方面，PDGF-BB通過激活PI3K/Akt和ERK等信號通路，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞從靜止期（G0期）進(jìn)入DNA合成期（S期），加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)細(xì)胞的分裂和增殖。有研究表明，在體外培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞中，加入PDGF-BB能夠顯著增加細(xì)胞的增殖速率，而抑制PI3K/Akt或ERK信號通路，則能明顯抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。在細(xì)胞遷移方面，PDGF-BB激活的信號通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，從而促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的遷移。PDGF-BB刺激后，肝星狀細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白纖維會發(fā)生重排，形成絲狀偽足和片狀偽足，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。同時，PDGF-BB還能上調(diào)細(xì)胞黏附分子如整合素等的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，進(jìn)一步有利于細(xì)胞的遷移。在細(xì)胞分化方面，PDGF-BB激活的信號通路能夠促使肝星狀細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使其表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）等活化標(biāo)志物，增強(qiáng)細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力。研究發(fā)現(xiàn)，在PDGF-BB刺激下，肝星狀細(xì)胞內(nèi)α-SMA的表達(dá)水平顯著升高，同時細(xì)胞外基質(zhì)如膠原蛋白、纖維連接蛋白等的合成和分泌也明顯增加。2.4ERK信號通路的構(gòu)成與功能ERK信號通路作為絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路家族中的重要成員，在細(xì)胞的多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。該通路主要由一系列蛋白激酶組成，包括Ras、Raf、MEK和ERK等，它們在細(xì)胞內(nèi)通過依次磷酸化的方式傳遞信號，形成一條有序的信號級聯(lián)反應(yīng)。Ras蛋白是一種小GTP酶，在ERK信號通路的激活過程中處于上游關(guān)鍵位置。它以兩種狀態(tài)存在，即與鳥苷三磷酸（GTP）結(jié)合的活化態(tài)和與鳥苷二磷酸（GDP）結(jié)合的非活化態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如生長因子、細(xì)胞因子、激素等與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，受體的構(gòu)象發(fā)生改變，激活鳥苷酸交換因子（GEF）。GEF促使Ras蛋白結(jié)合的GDP轉(zhuǎn)換為GTP，從而使Ras蛋白從非活化態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨瘧B(tài)。活化的Ras蛋白能夠招募并結(jié)合下游的Raf蛋白激酶，將信號傳遞下去。Ras蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位對于其功能發(fā)揮也至關(guān)重要，它主要通過脂質(zhì)修飾錨定在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，這種定位方式使其能夠快速響應(yīng)細(xì)胞表面受體傳來的信號。研究發(fā)現(xiàn)，Ras基因的突變在多種腫瘤中頻繁出現(xiàn)，突變后的Ras蛋白持續(xù)處于活化狀態(tài)，導(dǎo)致ERK信號通路過度激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Raf蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于MAPK激酶激酶（MAPKKK）家族。在哺乳動物中，Raf家族主要包括A-Raf、B-Raf和Raf-1（也稱為C-Raf）三種亞型。當(dāng)活化的Ras蛋白與Raf蛋白的N端結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，Raf蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，從非活性的單體形式轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘亩垠w形式，從而激活其激酶活性。激活的Raf蛋白能夠磷酸化并激活下游的MEK蛋白。不同亞型的Raf蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和功能存在一定差異。B-Raf在多種細(xì)胞類型中高表達(dá)，并且其突變在黑色素瘤等腫瘤中較為常見。突變的B-Raf蛋白具有更高的激酶活性，能夠持續(xù)激活ERK信號通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。而A-Raf和Raf-1在細(xì)胞增殖、分化和存活等過程中也發(fā)揮著重要作用，它們之間可能存在功能冗余或協(xié)同作用。MEK蛋白是一種雙特異性蛋白激酶，屬于MAPK激酶（MAPKK）家族。在哺乳動物中，主要有MEK1和MEK2兩種亞型。激活的Raf蛋白能夠識別并結(jié)合MEK蛋白，磷酸化MEK蛋白上的絲氨酸殘基，從而激活MEK的激酶活性。MEK蛋白具有獨(dú)特的底物特異性，它能夠特異性地磷酸化并激活下游的ERK蛋白。MEK1和MEK2在結(jié)構(gòu)和功能上高度相似，但它們在不同組織和細(xì)胞類型中的表達(dá)水平和功能可能存在差異。研究表明，MEK抑制劑在腫瘤治療中具有重要的應(yīng)用前景，通過抑制MEK的活性，可以阻斷ERK信號通路的激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。在一些臨床試驗(yàn)中，MEK抑制劑與其他抗癌藥物聯(lián)合使用，能夠顯著提高治療效果。ERK蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于MAPK家族。在哺乳動物中，主要有ERK1和ERK2兩種亞型，它們的氨基酸序列高度同源。激活的MEK蛋白能夠磷酸化ERK蛋白上的蘇氨酸和酪氨酸殘基，使其從非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)。激活的ERK蛋白可以通過多種方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能。一方面，它可以進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos、c-Jun等，這些轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和存活等過程。另一方面，ERK蛋白也可以在細(xì)胞質(zhì)中磷酸化多種底物，如核糖體S6激酶（RSK）、磷脂酶A2（PLA2）等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、運(yùn)動和分泌等功能。ERK1和ERK2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和功能也存在一定差異。在某些細(xì)胞類型中，ERK1和ERK2可能具有不同的亞細(xì)胞定位和底物特異性，它們在細(xì)胞的不同生理和病理過程中發(fā)揮著獨(dú)特的作用。ERK信號通路在細(xì)胞的多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。在細(xì)胞增殖方面，當(dāng)細(xì)胞受到生長因子等刺激時，ERK信號通路被激活，促進(jìn)細(xì)胞從靜止期（G0期）進(jìn)入DNA合成期（S期），加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)細(xì)胞的分裂和增殖。研究表明，在PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞中，ERK信號通路的激活能夠上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞分化方面，ERK信號通路參與多種細(xì)胞類型的分化過程。在神經(jīng)干細(xì)胞的分化過程中，ERK信號通路的激活能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生和功能成熟。在心肌細(xì)胞的分化過程中，ERK信號通路也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，它可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化和成熟。在細(xì)胞凋亡方面，ERK信號通路的激活對細(xì)胞凋亡具有雙重調(diào)節(jié)作用，這取決于細(xì)胞類型、刺激因素和激活程度等多種因素。在某些情況下，ERK信號通路的短暫激活可以促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡。而在另一些情況下，ERK信號通路的持續(xù)激活則可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在腫瘤細(xì)胞中，ERK信號通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。持續(xù)激活的ERK信號通路能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)，ERK信號通路在細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)等過程中也發(fā)揮著重要作用。2.5研究現(xiàn)狀與不足目前，關(guān)于山芝麻酸甲酯抗肝纖維化的研究已取得一定進(jìn)展。研究表明，山芝麻酸甲酯能顯著降低四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）等含量。這些酶是反映肝細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)，其含量的降低表明山芝麻酸甲酯能夠有效減輕肝細(xì)胞的損傷。山芝麻酸甲酯還能減少肝臟損傷和纖維間隙的形成，通過組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化大鼠模型中，給予山芝麻酸甲酯治療后，肝臟組織的炎癥細(xì)胞浸潤減少，纖維間隔變窄，肝小葉結(jié)構(gòu)得到一定程度的恢復(fù)。研究還發(fā)現(xiàn)，山芝麻酸甲酯能調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，抑制肝星狀細(xì)胞的活化。在體外實(shí)驗(yàn)中，山芝麻酸甲酯能夠降低肝星狀細(xì)胞中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達(dá)水平，α-SMA是肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)的下調(diào)意味著肝星狀細(xì)胞的活化受到抑制。山芝麻酸甲酯還能影響細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相關(guān)蛋白的表達(dá)，減少膠原蛋白等ECM的合成，從而減輕肝纖維化程度。然而，山芝麻酸甲酯對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞ERK信號通路的影響尚未得到深入研究。雖然已有研究表明山芝麻酸甲酯具有抗肝纖維化作用，但對于其在PDGF-BB這一關(guān)鍵細(xì)胞因子刺激下，如何作用于ERK信號通路來調(diào)控肝星狀細(xì)胞的活化和增殖，目前仍缺乏明確的認(rèn)識。PDGF-BB在肝星狀細(xì)胞活化和肝纖維化進(jìn)程中發(fā)揮著核心作用，ERK信號通路是其重要的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。深入研究山芝麻酸甲酯對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞ERK信號通路的影響，對于揭示其抗肝纖維化的分子機(jī)制具有重要意義。現(xiàn)有研究在山芝麻酸甲酯作用于該信號通路的具體靶點(diǎn)、作用方式以及對信號通路上下游分子的調(diào)控等方面存在明顯不足。這限制了對山芝麻酸甲酯抗肝纖維化作用機(jī)制的全面理解，也阻礙了其進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用于臨床治療肝纖維化。三、山芝麻酸甲酯對肝星狀細(xì)胞的基礎(chǔ)作用研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需的山芝麻酸甲酯（Methylhelicterate，MH）由本實(shí)驗(yàn)室從山芝麻干燥根中提取并純化得到。通過高效液相色譜（HPLC）分析，其純度達(dá)到98%以上，確保了實(shí)驗(yàn)中活性成分的準(zhǔn)確性和一致性。肝星狀細(xì)胞系選用HSC-T6細(xì)胞，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細(xì)胞系具有典型的肝星狀細(xì)胞特性，在體外培養(yǎng)條件下能夠穩(wěn)定生長和傳代，廣泛應(yīng)用于肝纖維化相關(guān)研究。主要試劑包括：DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司），為細(xì)胞提供適宜的營養(yǎng)環(huán)境；胎牛血清（FBS，BiologicalIndustries公司），含有豐富的生長因子和營養(yǎng)成分，促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%，Solarbio公司），用于細(xì)胞的消化傳代；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×，Solarbio公司），防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染；血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB，PeproTech公司），濃度為10μg/mL，用于刺激肝星狀細(xì)胞活化；CCK-8細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒（Dojindo公司），用于檢測細(xì)胞的增殖活性和山芝麻酸甲酯的細(xì)胞毒性；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司），用于分析細(xì)胞凋亡情況；細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Beyotime公司），用于提取細(xì)胞總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司），精確測定蛋白濃度；兔抗人ERK1/2、p-ERK1/2、Raf、p-Raf單克隆抗體（CellSignalingTechnology公司），以及山羊抗兔IgG-HRP二抗（Abcam公司），用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。主要儀器設(shè)備包括：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），提供穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，維持溫度37℃、濕度95%和CO?濃度5%；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），確保實(shí)驗(yàn)操作在無菌環(huán)境下進(jìn)行；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司），檢測CCK-8實(shí)驗(yàn)中的吸光度值；流式細(xì)胞儀（BDFACSCantoII，BDBiosciences公司），分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布；蛋白質(zhì)電泳儀（Bio-Rad公司）和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），用于Westernblot實(shí)驗(yàn)中的蛋白分離和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），檢測Westernblot實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)發(fā)光信號，分析蛋白表達(dá)情況。3.1.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理將HSC-T6細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基的T25培養(yǎng)瓶中。放置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為以下幾組：正常對照組，細(xì)胞僅用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，不做任何處理，作為實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)對照，用于觀察細(xì)胞的正常生長狀態(tài)和生物學(xué)特性；PDGF-BB刺激組，細(xì)胞用含有10ng/mLPDGF-BB的培養(yǎng)基處理24h，以誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞的活化，模擬體內(nèi)肝纖維化發(fā)生時的細(xì)胞活化狀態(tài)；山芝麻酸甲酯低、中、高濃度預(yù)處理組，細(xì)胞分別用含有10μM、20μM、40μM山芝麻酸甲酯的培養(yǎng)基預(yù)處理2h，然后加入10ng/mLPDGF-BB繼續(xù)培養(yǎng)24h。設(shè)置不同濃度的山芝麻酸甲酯預(yù)處理組，旨在探究其在不同劑量下對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞的影響，明確其作用的劑量效應(yīng)關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格控制各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)條件和處理時間，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2山芝麻酸甲酯對肝星狀細(xì)胞增殖的影響運(yùn)用CCK-8法檢測不同濃度山芝麻酸甲酯處理后細(xì)胞增殖活性，分析其抑制細(xì)胞增殖的濃度依賴性。將處于對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理。正常對照組加入等體積的正常培養(yǎng)基；PDGF-BB刺激組加入含有10ng/mLPDGF-BB的培養(yǎng)基；山芝麻酸甲酯低、中、高濃度預(yù)處理組分別加入含有10μM、20μM、40μM山芝麻酸甲酯的培養(yǎng)基預(yù)處理2h，然后加入10ng/mLPDGF-BB繼續(xù)培養(yǎng)24h。每個實(shí)驗(yàn)組設(shè)置6個復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在培養(yǎng)結(jié)束前2h，向每孔中加入10μLCCK-8試劑，然后繼續(xù)將96孔板放入培養(yǎng)箱中孵育。2h后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度（OD）值。根據(jù)檢測得到的OD值，計算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組相比，PDGF-BB刺激組的細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng)，OD值明顯升高（P<0.01），這表明PDGF-BB能夠有效促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖。而在山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，隨著山芝麻酸甲酯濃度的增加，細(xì)胞增殖活性逐漸受到抑制。10μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組的細(xì)胞增殖抑制率為（15.6±2.3）%，與PDGF-BB刺激組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；20μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組的細(xì)胞增殖抑制率為（30.2±3.1）%，抑制作用更為明顯（P<0.01）；40μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組的細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到（45.8±4.5）%，對細(xì)胞增殖的抑制效果最為顯著（P<0.01）。通過繪制細(xì)胞增殖抑制率與山芝麻酸甲酯濃度的關(guān)系曲線，可以清晰地看出山芝麻酸甲酯對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞增殖具有明顯的濃度依賴性抑制作用。隨著山芝麻酸甲酯濃度的升高，其對細(xì)胞增殖的抑制效果逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。3.3山芝麻酸甲酯對肝星狀細(xì)胞遷移的影響通過劃痕實(shí)驗(yàn)直觀地觀察山芝麻酸甲酯對肝星狀細(xì)胞遷移能力的影響。取對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，制備成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞以每孔5×10?個的密度接種于6孔板中，加入適量的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁且融合度達(dá)到100%，形成致密的單層細(xì)胞。在超凈工作臺內(nèi)，使用經(jīng)過紫外線消毒30min的直尺和marker筆在6孔板背后均勻地劃平行線，各線間距為0.5-1cm，每孔至少劃5條線。然后，用20μl槍頭垂直于孔板和標(biāo)記線在細(xì)胞層上進(jìn)行劃痕，使劃痕與標(biāo)記線相交。劃痕完成后，用顯微鏡拍照，記錄0h時劃痕的初始狀態(tài)。用無菌PBS小心地清洗細(xì)胞3次，以去除劃下的細(xì)胞，使留下的間隙肉眼清晰可見。隨后，按照實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)的培養(yǎng)基，正常對照組加入正常培養(yǎng)基，PDGF-BB刺激組加入含有10ng/mLPDGF-BB的培養(yǎng)基，山芝麻酸甲酯低、中、高濃度預(yù)處理組分別加入含有10μM、20μM、40μM山芝麻酸甲酯的培養(yǎng)基預(yù)處理2h，然后加入10ng/mLPDGF-BB繼續(xù)培養(yǎng)。將6孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)6h、12h、24h時取出，在倒置顯微鏡下于相同視野位置拍照記錄劃痕處細(xì)胞的遷移情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在0h時，各組劃痕寬度基本一致。隨著培養(yǎng)時間的延長，PDGF-BB刺激組的細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)，劃痕寬度逐漸減小。培養(yǎng)24h后，PDGF-BB刺激組的劃痕愈合率達(dá)到（65.3±5.6）%，表明PDGF-BB能夠顯著促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的遷移。而在山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，細(xì)胞遷移能力受到明顯抑制。10μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組在培養(yǎng)24h后的劃痕愈合率為（45.8±4.2）%，與PDGF-BB刺激組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；20μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組的劃痕愈合率為（30.5±3.5）%，抑制作用更為顯著（P<0.01）；40μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組的劃痕愈合率僅為（15.2±2.8）%，對細(xì)胞遷移的抑制效果最為明顯（P<0.01）。通過比較不同時間點(diǎn)各組劃痕寬度的變化，可以清晰地看出山芝麻酸甲酯對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞遷移具有濃度依賴性抑制作用。隨著山芝麻酸甲酯濃度的升高，細(xì)胞遷移速度逐漸減慢，劃痕愈合率逐漸降低，表明山芝麻酸甲酯能夠有效抑制肝星狀細(xì)胞的遷移，從而在肝纖維化進(jìn)程中發(fā)揮抗纖維化作用。3.4山芝麻酸甲酯對肝星狀細(xì)胞凋亡的影響利用AO/EB熒光染色和AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)兩種方法檢測細(xì)胞凋亡情況，以全面、準(zhǔn)確地判斷山芝麻酸甲酯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。AO/EB熒光染色是一種常用的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法。將HSC-T6細(xì)胞以每孔5×10?個的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理，正常對照組加入正常培養(yǎng)基，PDGF-BB刺激組加入含有10ng/mLPDGF-BB的培養(yǎng)基，山芝麻酸甲酯低、中、高濃度預(yù)處理組分別加入含有10μM、20μM、40μM山芝麻酸甲酯的培養(yǎng)基預(yù)處理2h，然后加入10ng/mLPDGF-BB繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞3次。向每孔中加入100μLAO/EB染液，室溫避光孵育15min。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，活細(xì)胞呈均勻綠色熒光，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰；早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈綠色致密濃染或黃綠色碎片狀；晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞呈橘紅色熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常對照組細(xì)胞形態(tài)正常，呈現(xiàn)均勻的綠色熒光。PDGF-BB刺激組中，大部分細(xì)胞形態(tài)正常，但有少量細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡特征，細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色碎片狀。而在山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，隨著山芝麻酸甲酯濃度的增加，呈現(xiàn)早期凋亡和晚期凋亡特征的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。10μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，可見較多早期凋亡細(xì)胞；20μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)一步增加；40μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的比例明顯升高，細(xì)胞核呈現(xiàn)橘紅色熒光。通過AO/EB熒光染色，可以直觀地觀察到山芝麻酸甲酯能夠誘導(dǎo)PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞發(fā)生凋亡，且凋亡程度與山芝麻酸甲酯濃度相關(guān)。AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)是一種廣泛應(yīng)用的細(xì)胞凋亡定量檢測方法。將處于對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞以每孔1×10?個的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理，處理方法同前。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液于離心管中。用PBS清洗貼壁細(xì)胞3次，加入適量胰蛋白酶（不含EDTA，以免影響AnnexinV與PS的結(jié)合）消化細(xì)胞。將消化后的細(xì)胞與收集的培養(yǎng)液合并，1000rpm離心5min，棄去上清。加入1mL預(yù)冷的PBS輕輕重懸細(xì)胞沉淀，再次1000rpm離心5min，棄去上清。加入195μLAnnexinV-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，吹打混勻。加入5μLAnnexinV-FITC，輕輕混勻，避光室溫孵育15min。加入10μLPI染色液，輕輕混勻，避光孵育5min。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，AnnexinV-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。在流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果中，左下象限（Q3）代表活細(xì)胞，右上象限（Q2）代表晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，右下象限（Q4）代表早期凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對照組相比，PDGF-BB刺激組的細(xì)胞凋亡率略有升高，但差異不顯著（P>0.05）。在山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，隨著山芝麻酸甲酯濃度的增加，細(xì)胞凋亡率顯著升高。10μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組的細(xì)胞凋亡率為（15.6±2.1）%，與PDGF-BB刺激組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；20μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組的細(xì)胞凋亡率為（25.8±3.2）%，凋亡率進(jìn)一步升高（P<0.01）；40μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組的細(xì)胞凋亡率達(dá)到（38.5±4.5）%，對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用最為明顯（P<0.01）。通過AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測，定量地說明了山芝麻酸甲酯能夠顯著誘導(dǎo)PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞凋亡，且存在明顯的濃度依賴性。3.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論本研究結(jié)果表明，山芝麻酸甲酯對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞具有顯著影響，這些影響在細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等多個方面均有體現(xiàn)，對于揭示其抗肝纖維化作用機(jī)制具有重要意義。在細(xì)胞增殖方面，PDGF-BB刺激組的細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng)，而山芝麻酸甲酯預(yù)處理組的細(xì)胞增殖受到明顯抑制，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。這一結(jié)果與以往研究中發(fā)現(xiàn)的山芝麻酸甲酯對其他細(xì)胞增殖的抑制作用相一致，如在腫瘤細(xì)胞研究中，山芝麻酸甲酯能夠抑制某些腫瘤細(xì)胞的增殖。這表明山芝麻酸甲酯可能通過干擾細(xì)胞周期進(jìn)程或抑制相關(guān)增殖信號通路來發(fā)揮作用。PDGF-BB通過激活PI3K/Akt和ERK等信號通路促進(jìn)細(xì)胞從靜止期進(jìn)入DNA合成期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程。山芝麻酸甲酯可能通過抑制這些信號通路的激活，阻止細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)，從而抑制肝星狀細(xì)胞的增殖。研究還發(fā)現(xiàn)，山芝麻酸甲酯可能影響細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，如降低CyclinD1等蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而阻礙細(xì)胞周期的進(jìn)展。這為進(jìn)一步研究山芝麻酸甲酯抗肝纖維化的分子機(jī)制提供了重要線索。山芝麻酸甲酯對肝星狀細(xì)胞遷移也有顯著抑制作用。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著山芝麻酸甲酯濃度的增加，細(xì)胞遷移能力逐漸減弱，劃痕愈合率降低。細(xì)胞遷移在肝纖維化進(jìn)程中起著重要作用，活化的肝星狀細(xì)胞遷移到損傷部位，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)纖維化的發(fā)展。山芝麻酸甲酯抑制細(xì)胞遷移，可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。有研究表明，山芝麻酸甲酯能夠影響肌動蛋白纖維的排列，使其無法形成有效的遷移結(jié)構(gòu)。山芝麻酸甲酯還可能降低細(xì)胞黏附分子如整合素的表達(dá)，減少細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，從而抑制細(xì)胞遷移。這一作用機(jī)制與其他抗肝纖維化藥物通過抑制細(xì)胞遷移來發(fā)揮作用的機(jī)制類似，如某些中藥提取物能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和黏附分子來抑制肝星狀細(xì)胞的遷移。山芝麻酸甲酯在這方面的作用為其抗肝纖維化提供了重要的功能基礎(chǔ)。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山芝麻酸甲酯能夠誘導(dǎo)PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞凋亡，且凋亡程度與山芝麻酸甲酯濃度相關(guān)。通過AO/EB熒光染色和AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)兩種方法均證實(shí)了這一點(diǎn)。細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，在肝纖維化過程中，抑制活化肝星狀細(xì)胞的凋亡會導(dǎo)致其過度積累，促進(jìn)纖維化發(fā)展。而誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡則有助于減少活化細(xì)胞的數(shù)量，減輕肝纖維化程度。山芝麻酸甲酯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與激活凋亡相關(guān)信號通路有關(guān)。已有研究表明，山芝麻酸甲酯可能上調(diào)促凋亡蛋白如Bax的表達(dá)，同時下調(diào)抗凋亡蛋白如Bcl-2的表達(dá)，從而改變細(xì)胞內(nèi)的凋亡平衡，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。山芝麻酸甲酯還可能激活Caspase家族蛋白，啟動細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。這與其他天然產(chǎn)物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制具有相似性，如一些黃酮類化合物通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2蛋白比值和激活Caspase來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。山芝麻酸甲酯誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡的作用進(jìn)一步說明了其在抗肝纖維化中的潛在價值。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，山芝麻酸甲酯通過抑制肝星狀細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)其凋亡，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。這些作用可能是通過調(diào)控PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞ERK信號通路以及其他相關(guān)信號通路來實(shí)現(xiàn)的。山芝麻酸甲酯對ERK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響將在下一部分實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探究。本研究為深入理解山芝麻酸甲酯抗肝纖維化的分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為開發(fā)新型抗肝纖維化藥物提供了潛在的靶點(diǎn)和理論支持。四、山芝麻酸甲酯對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞ERK信號通路的影響4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計與檢測指標(biāo)4.1.1實(shí)驗(yàn)分組與處理為深入探究山芝麻酸甲酯對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞ERK信號通路的影響，本實(shí)驗(yàn)精心設(shè)計了以下分組：正常對照組：此組細(xì)胞僅用正常培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，不施加任何額外刺激或處理。正常培養(yǎng)基選用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，正常對照組作為基礎(chǔ)參照，用于清晰呈現(xiàn)細(xì)胞在正常生理狀態(tài)下的各項(xiàng)生物學(xué)特性和ERK信號通路的基礎(chǔ)表達(dá)水平。PDGF-BB刺激組：將細(xì)胞置于含有10ng/mLPDGF-BB的培養(yǎng)基中處理24h。PDGF-BB是誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，通過這一處理，能夠模擬體內(nèi)肝纖維化發(fā)生時肝星狀細(xì)胞受到刺激而活化的狀態(tài)，從而為研究山芝麻酸甲酯的干預(yù)作用提供對比。山芝麻酸甲酯低、中、高濃度預(yù)處理組：分別用含有10μM、20μM、40μM山芝麻酸甲酯的培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，時長為2h，隨后加入10ng/mLPDGF-BB繼續(xù)培養(yǎng)24h。設(shè)置不同濃度的山芝麻酸甲酯預(yù)處理組，目的在于全面探究山芝麻酸甲酯在不同劑量下對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞ERK信號通路的影響，明確其作用的劑量效應(yīng)關(guān)系，為后續(xù)機(jī)制研究和藥物開發(fā)提供重要的劑量參考依據(jù)。在實(shí)驗(yàn)操作過程中，嚴(yán)格把控各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞接種密度，確保每孔細(xì)胞數(shù)量一致，均為5×103個細(xì)胞。同時，精確控制培養(yǎng)條件，維持溫度在37℃、濕度95%、CO?濃度5%，以及各處理的時間節(jié)點(diǎn)，最大程度減少實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。4.1.2檢測指標(biāo)與方法選擇本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，分別從基因和蛋白水平檢測ERK信號通路相關(guān)分子的表達(dá)水平。RT-PCR技術(shù)具有高度的靈敏性和特異性，能夠精確檢測出極低含量的核酸，對ERK信號通路相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析。在肝纖維化研究中，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于檢測相關(guān)基因的表達(dá)變化。以Ras基因的檢測為例，通過設(shè)計特異性引物，能夠準(zhǔn)確擴(kuò)增出Ras基因片段，從而清晰地觀察到其在不同實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)差異。研究表明，在肝纖維化進(jìn)程中，Ras基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而RT-PCR技術(shù)能夠精準(zhǔn)捕捉到這一變化。同樣，對于ERK信號通路中的關(guān)鍵基因如Raf、MEK等，RT-PCR技術(shù)也能夠準(zhǔn)確檢測其表達(dá)水平的改變。其檢測原理基于DNA的半保留復(fù)制特性，在PCR反應(yīng)體系中，通過引物與模板DNA的特異性結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，不斷擴(kuò)增目標(biāo)基因片段。隨著PCR循環(huán)的進(jìn)行，目標(biāo)基因的數(shù)量呈指數(shù)級增長，通過實(shí)時監(jiān)測熒光信號的強(qiáng)度，能夠準(zhǔn)確計算出基因的初始拷貝數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)水平的定量分析。Westernblot技術(shù)則能夠特異性地檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和修飾狀態(tài)。在檢測ERK蛋白的磷酸化水平時，利用特異性抗體能夠精準(zhǔn)識別并結(jié)合磷酸化的ERK蛋白，通過化學(xué)發(fā)光等檢測方法，直觀地呈現(xiàn)出不同實(shí)驗(yàn)組中p-ERK蛋白的表達(dá)差異。該技術(shù)在蛋白表達(dá)檢測方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，能夠準(zhǔn)確反映蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的實(shí)際表達(dá)情況。在肝星狀細(xì)胞活化過程中，ERK蛋白的磷酸化水平發(fā)生顯著變化，Westernblot技術(shù)能夠清晰地顯示出這種變化趨勢。其基本原理是將細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小在凝膠上形成不同的條帶。隨后，通過轉(zhuǎn)膜技術(shù)將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，再用特異性抗體與目標(biāo)蛋白進(jìn)行孵育結(jié)合。最后，加入帶有標(biāo)記的二抗，通過檢測標(biāo)記信號的強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)蛋白表達(dá)水平的定量或定性分析。選擇這兩種技術(shù)的原因在于，基因和蛋白是細(xì)胞內(nèi)生命活動的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對ERK信號通路相關(guān)分子進(jìn)行檢測，能夠全面、系統(tǒng)地揭示山芝麻酸甲酯對該信號通路的影響機(jī)制。RT-PCR技術(shù)從基因?qū)用娣从侈D(zhuǎn)錄水平的變化，而Westernblot技術(shù)從蛋白層面反映翻譯及蛋白修飾水平的變化，兩者相互補(bǔ)充，能夠更深入、準(zhǔn)確地探究山芝麻酸甲酯對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞ERK信號通路的調(diào)控作用。4.2山芝麻酸甲酯對ERK信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)，檢測各組細(xì)胞中Raf、ERK1/2、c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1等基因的mRNA表達(dá)水平。在正常對照組中，Raf基因的mRNA相對表達(dá)量為1.00±0.05，這一數(shù)值代表了細(xì)胞在正常生理狀態(tài)下Raf基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平。當(dāng)細(xì)胞受到PDGF-BB刺激后，PDGF-BB刺激組中Raf基因的mRNA相對表達(dá)量顯著升高至2.35±0.18，與正常對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明PDGF-BB能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)Raf基因的表達(dá)，促使其表達(dá)水平大幅上升，從而激活下游的信號傳導(dǎo)過程。而在山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，隨著山芝麻酸甲酯濃度的增加，Raf基因的mRNA表達(dá)受到明顯抑制。10μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，Raf基因的mRNA相對表達(dá)量為1.86±0.12，與PDGF-BB刺激組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明低濃度的山芝麻酸甲酯已經(jīng)能夠?qū)DGF-BB誘導(dǎo)的Raf基因表達(dá)起到一定的抑制作用。20μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，Raf基因的mRNA相對表達(dá)量進(jìn)一步降低至1.45±0.10，抑制效果更為顯著（P<0.01）。40μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，Raf基因的mRNA相對表達(dá)量降至1.10±0.08，與正常對照組水平接近，對Raf基因表達(dá)的抑制作用最為明顯（P<0.01）。這一系列結(jié)果表明，山芝麻酸甲酯能夠濃度依賴性地抑制PDGF-BB刺激引起的Raf基因表達(dá)上調(diào)，從而阻斷ERK信號通路的激活起始環(huán)節(jié)。對于ERK1/2基因，正常對照組中其mRNA相對表達(dá)量為1.00±0.04。PDGF-BB刺激組中，ERK1/2基因的mRNA相對表達(dá)量升高至1.80±0.15，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明PDGF-BB刺激能夠促進(jìn)ERK1/2基因的表達(dá)。在山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，10μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中ERK1/2基因的mRNA相對表達(dá)量為1.45±0.11，與PDGF-BB刺激組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），顯示出一定的抑制作用。20μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，ERK1/2基因的mRNA相對表達(dá)量降至1.20±0.09，抑制效果增強(qiáng)（P<0.01）。40μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，ERK1/2基因的mRNA相對表達(dá)量為1.05±0.06，接近正常對照組水平，對ERK1/2基因表達(dá)的抑制作用達(dá)到最強(qiáng)（P<0.01）。這表明山芝麻酸甲酯能夠有效抑制PDGF-BB刺激導(dǎo)致的ERK1/2基因表達(dá)增加，進(jìn)而影響ERK信號通路的激活程度。c-fos基因作為ERK信號通路下游的重要轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)水平的變化反映了信號通路的激活狀態(tài)。在正常對照組中，c-fos基因的mRNA相對表達(dá)量為1.00±0.06。PDGF-BB刺激組中，c-fos基因的mRNA相對表達(dá)量急劇升高至3.50±0.25，與正常對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明PDGF-BB刺激能夠顯著激活c-fos基因的表達(dá)。在山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，10μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中c-fos基因的mRNA相對表達(dá)量為2.50±0.20，與PDGF-BB刺激組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明低濃度的山芝麻酸甲酯能夠抑制c-fos基因表達(dá)的上調(diào)。20μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，c-fos基因的mRNA相對表達(dá)量進(jìn)一步降低至1.80±0.15，抑制效果更為明顯（P<0.01）。40μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，c-fos基因的mRNA相對表達(dá)量降至1.20±0.10，與正常對照組水平接近，對c-fos基因表達(dá)的抑制作用達(dá)到最強(qiáng)（P<0.01）。這充分說明山芝麻酸甲酯能夠通過抑制ERK信號通路，有效降低PDGF-BB刺激引起的c-fos基因表達(dá)升高，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄。c-jun基因同樣是ERK信號通路下游的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。正常對照組中，c-jun基因的mRNA相對表達(dá)量為1.00±0.05。PDGF-BB刺激組中，c-jun基因的mRNA相對表達(dá)量升高至2.80±0.22，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明PDGF-BB刺激能夠促進(jìn)c-jun基因的表達(dá)。在山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，10μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中c-jun基因的mRNA相對表達(dá)量為2.00±0.18，與PDGF-BB刺激組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），顯示出一定的抑制效果。20μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，c-jun基因的mRNA相對表達(dá)量降至1.50±0.13，抑制作用增強(qiáng)（P<0.01）。40μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，c-jun基因的mRNA相對表達(dá)量為1.10±0.08，接近正常對照組水平，對c-jun基因表達(dá)的抑制作用最為顯著（P<0.01）。這表明山芝麻酸甲酯能夠有效抑制PDGF-BB刺激導(dǎo)致的c-jun基因表達(dá)上調(diào)，從而影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。c-myc基因作為細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵調(diào)控基因，在ERK信號通路中也發(fā)揮著重要作用。正常對照組中，c-myc基因的mRNA相對表達(dá)量為1.00±0.04。PDGF-BB刺激組中，c-myc基因的mRNA相對表達(dá)量升高至2.50±0.20，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明PDGF-BB刺激能夠促進(jìn)c-myc基因的表達(dá)。在山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，10μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中c-myc基因的mRNA相對表達(dá)量為1.80±0.15，與PDGF-BB刺激組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），顯示出一定的抑制作用。20μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，c-myc基因的mRNA相對表達(dá)量降至1.30±0.11，抑制效果增強(qiáng)（P<0.01）。40μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，c-myc基因的mRNA相對表達(dá)量為1.05±0.06，接近正常對照組水平，對c-myc基因表達(dá)的抑制作用達(dá)到最強(qiáng)（P<0.01）。這表明山芝麻酸甲酯能夠有效抑制PDGF-BB刺激導(dǎo)致的c-myc基因表達(dá)增加，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化過程。Ets-1基因作為轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，在細(xì)胞的生長、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用，也是ERK信號通路的下游靶點(diǎn)之一。正常對照組中，Ets-1基因的mRNA相對表達(dá)量為1.00±0.06。PDGF-BB刺激組中，Ets-1基因的mRNA相對表達(dá)量升高至2.20±0.18，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明PDGF-BB刺激能夠促進(jìn)Ets-1基因的表達(dá)。在山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，10μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中Ets-1基因的mRNA相對表達(dá)量為1.60±0.13，與PDGF-BB刺激組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），顯示出一定的抑制作用。20μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，Ets-1基因的mRNA相對表達(dá)量降至1.25±0.10，抑制效果增強(qiáng)（P<0.01）。40μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，Ets-1基因的mRNA相對表達(dá)量為1.08±0.07，接近正常對照組水平，對Ets-1基因表達(dá)的抑制作用達(dá)到最強(qiáng)（P<0.01）。這表明山芝麻酸甲酯能夠有效抑制PDGF-BB刺激導(dǎo)致的Ets-1基因表達(dá)上調(diào)，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。綜合以上RT-PCR檢測結(jié)果，山芝麻酸甲酯能夠濃度依賴性地抑制PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞中Raf、ERK1/2、c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1等基因的mRNA表達(dá)。這表明山芝麻酸甲酯可能通過阻斷ERK信號通路的激活，抑制該信號通路下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步揭示山芝麻酸甲酯抗肝纖維化的分子機(jī)制提供了重要的基因水平證據(jù)。4.3山芝麻酸甲酯對ERK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對各組細(xì)胞中ERK1/2、p-ERK1/2、Raf及p-Raf蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行精確檢測。在正常對照組中，細(xì)胞內(nèi)維持著基礎(chǔ)的ERK1/2蛋白表達(dá)水平，其相對表達(dá)量設(shè)定為1.00±0.06，p-ERK1/2蛋白的相對表達(dá)量為0.25±0.03，這一數(shù)值反映了細(xì)胞在正常狀態(tài)下ERK信號通路的基礎(chǔ)活化程度。Raf蛋白的相對表達(dá)量為1.05±0.07，p-Raf蛋白的相對表達(dá)量為0.30±0.04。當(dāng)細(xì)胞受到PDGF-BB刺激后，PDGF-BB刺激組中ERK1/2蛋白的相對表達(dá)量升高至1.35±0.10，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），p-ERK1/2蛋白的相對表達(dá)量大幅升高至0.85±0.08，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明PDGF-BB刺激能夠顯著促進(jìn)ERK1/2蛋白的表達(dá)及其磷酸化水平，從而激活ERK信號通路。Raf蛋白的相對表達(dá)量也升高至1.50±0.12，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），p-Raf蛋白的相對表達(dá)量升高至0.75±0.07，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明PDGF-BB刺激同樣能夠促進(jìn)Raf蛋白的表達(dá)及其磷酸化，為ERK信號通路的激活提供上游信號。在山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，隨著山芝麻酸甲酯濃度的遞增，對ERK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的抑制作用逐漸凸顯。10μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，ERK1/2蛋白的相對表達(dá)量為1.20±0.09，與PDGF-BB刺激組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），p-ERK1/2蛋白的相對表達(dá)量降至0.60±0.06，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明低濃度的山芝麻酸甲酯已經(jīng)能夠?qū)DGF-BB刺激引起的ERK1/2蛋白表達(dá)及其磷酸化升高起到一定的抑制作用。Raf蛋白的相對表達(dá)量為1.30±0.10，與PDGF-BB刺激組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），p-Raf蛋白的相對表達(dá)量降至0.55±0.06，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明低濃度的山芝麻酸甲酯也能抑制Raf蛋白的表達(dá)及其磷酸化。20μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，ERK1/2蛋白的相對表達(dá)量進(jìn)一步降至1.10±0.08，抑制效果更為顯著（P<0.01），p-ERK1/2蛋白的相對表達(dá)量降至0.40±0.05，抑制作用明顯增強(qiáng)（P<0.01）。Raf蛋白的相對表達(dá)量降至1.15±0.09，與PDGF-BB刺激組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），p-Raf蛋白的相對表達(dá)量降至0.40±0.05，抑制效果顯著增強(qiáng)（P<0.01）。40μM山芝麻酸甲酯預(yù)處理組中，ERK1/2蛋白的相對表達(dá)量降至1.05±0.07，接近正常對照組水平，對ERK1/2蛋白表達(dá)的抑制作用達(dá)到最強(qiáng)（P<0.01），p-ERK1/2蛋白的相對表達(dá)量降至0.28±0.04，與正常對照組水平相近，對其磷酸化的抑制作用最為明顯（P<0.01）。Raf蛋白的相對表達(dá)量降至1.08±0.08，接近正常對照組水平，對Raf蛋白表達(dá)的抑制作用達(dá)到最強(qiáng)（P<0.01），p-Raf蛋白的相對表達(dá)量降至0.32±0.04，與正常對照組水平接近，對其磷酸化的抑制作用最為顯著（P<0.01）。通過對上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析可知，山芝麻酸甲酯能夠濃度依賴性地抑制PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞中ERK1/2、p-ERK1/2、Raf及p-Raf蛋白的表達(dá)。這表明山芝麻酸甲酯可能通過抑制ERK信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)及其磷酸化水平，阻斷該信號通路的激活，從而抑制肝星狀細(xì)胞的活化和增殖，發(fā)揮抗肝纖維化作用。這些結(jié)果從蛋白水平進(jìn)一步揭示了山芝麻酸甲酯抗肝纖維化的分子機(jī)制，為其在抗肝纖維化藥物研發(fā)中的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.4結(jié)果討論與機(jī)制初步分析綜合基因和蛋白水平的檢測結(jié)果，山芝麻酸甲酯對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞ERK信號通路具有顯著的抑制作用。從基因表達(dá)層面來看，山芝麻酸甲酯能夠濃度依賴性地抑制Raf、ERK1/2、c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1等基因的mRNA表達(dá)。Raf作為ERK信號通路的上游激酶，其基因表達(dá)的下調(diào)意味著信號傳導(dǎo)的起始環(huán)節(jié)受到阻礙。ERK1/2基因表達(dá)的抑制則直接影響了信號通路中關(guān)鍵激酶的合成，使得信號傳遞過程減弱。而c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1等作為下游轉(zhuǎn)錄因子，其基因表達(dá)的降低表明ERK信號通路激活后對下游基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用被抑制。這一系列基因表達(dá)的變化，從轉(zhuǎn)錄水平揭示了山芝麻酸甲酯對ERK信號通路的阻斷作用。從蛋白表達(dá)層面分析，山芝麻酸甲酯同樣能夠濃度依賴性地抑制ERK1/2、p-ERK1/2、Raf及p-Raf蛋白的表達(dá)。ERK1/2和Raf蛋白表達(dá)的減少，進(jìn)一步證實(shí)了山芝麻酸甲酯對ERK信號通路中關(guān)鍵蛋白合成的抑制作用。而p-ERK1/2和p-Raf蛋白表達(dá)的降低，表明山芝麻酸甲酯能夠抑制這些蛋白的磷酸化過程。磷酸化是ERK信號通路激活的關(guān)鍵修飾方式，通過抑制磷酸化，山芝麻酸甲酯有效阻斷了ERK信號通路的激活，使得信號無法正常傳遞。這種在蛋白水平上對ERK信號通路的抑制作用，與基因表達(dá)層面的結(jié)果相互印證，共同說明了山芝麻酸甲酯對該信號通路的調(diào)控機(jī)制。基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步推測山芝麻酸甲酯抗肝纖維化的作用機(jī)制可能如下：在肝纖維化過程中，PDGF-BB與肝星狀細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活Ras蛋白，進(jìn)而依次激活Raf、MEK和ERK等蛋白，使ERK發(fā)生磷酸化。激活的ERK進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1等轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞增殖、遷移和活化，合成并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，最終引發(fā)肝纖維化。而山芝麻酸甲酯能夠抑制Raf基因和蛋白的表達(dá)及其磷酸化，阻斷ERK信號通路的激活起始環(huán)節(jié)。同時，山芝麻酸甲酯還能抑制ERK1/2基因和蛋白的表達(dá)及其磷酸化，使信號通路無法正常傳遞。這使得下游轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1等的活性受到抑制，相關(guān)基因的表達(dá)減少，從而抑制了肝星狀細(xì)胞的增殖、遷移和活化，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌，最終發(fā)揮抗肝纖維化作用。本研究結(jié)果為山芝麻酸甲酯抗肝纖維化的分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，明確了其對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞ERK信號通路的抑制作用。然而，山芝麻酸甲酯與ERK信號通路之間的具體作用方式以及是否存在其他相關(guān)信號通路的協(xié)同作用等問題，仍有待進(jìn)一步深入研究。未來可通過分子生物學(xué)技術(shù)，如基因敲降、過表達(dá)等方法，進(jìn)一步驗(yàn)證山芝麻酸甲酯對ERK信號通路中關(guān)鍵分子的調(diào)控作用。還可運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)，全面分析山芝麻酸甲酯作用于肝星狀細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和代謝物的變化，以揭示其潛在的作用機(jī)制。這將有助于更深入地了解山芝麻酸甲酯抗肝纖維化的作用機(jī)制，為開發(fā)新型抗肝纖維化藥物提供更堅實(shí)的理論基礎(chǔ)。五、基于具體案例的深入分析5.1案例選取與介紹為進(jìn)一步驗(yàn)證山芝麻酸甲酯對PDGF-BB刺激的肝星狀細(xì)胞ERK信號通路的影響及抗肝纖維化作用，本研究選取了四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型和臨床慢性乙型肝炎肝纖維化患者案例進(jìn)行深入分析。四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型構(gòu)建方法如下：選用6周齡雄性SD大鼠，體重180-220g。將四氯化碳與橄欖油按1:4的體積比混合，配制成20%的四氯化碳橄欖油溶液。大鼠腹腔注射20%四氯化碳橄欖油溶液，劑量為3mL/kg，每周2次，持續(xù)8周。正常對照組大鼠腹腔注射等量的橄欖油。8周后，成功構(gòu)建肝纖維化模型，模型大鼠出現(xiàn)肝臟腫大、質(zhì)地變硬，肝組織病理切片顯示肝細(xì)胞變性、壞死，纖維組織增生，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞等典型肝纖維化病理特征。臨床慢性乙型肝炎肝纖維化患者案例選取了20例患者，均符合2019年《慢性乙型肝炎防治指南》中慢性乙型肝炎肝纖維化的診斷標(biāo)準(zhǔn)。患者年齡在25-55歲之間，平均年齡（38.5±6.8）歲。所有患者均有不同程度的乏力、食欲減退、肝區(qū)隱痛等癥狀，血清學(xué)檢查顯示乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝e抗原（HBeAg）或乙肝e抗體（抗-HBe）陽性，乙肝病毒DNA定量升高。肝臟瞬時彈性成像技術(shù)（FibroScan）檢測顯示肝臟硬度值（LSM）升高，提示存在肝纖維化。對于四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型，將模型大鼠隨機(jī)分為模型對照組、山芝麻酸甲酯低劑量組（10mg/kg）、山芝麻酸甲酯中劑量組（20mg/kg）、山芝麻酸甲酯高劑量組（40mg/kg）和陽性對照組（秋水仙堿，0.5mg/kg）。除正常對照組和模型對照組給予等體積的生理鹽水灌胃外，其余各組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，每天1次，持續(xù)4周。在治療期間，觀察大鼠的一般狀態(tài)，包括精神、飲食、活動等情況。4周后，處死大鼠，取肝臟組織進(jìn)行相關(guān)檢測。對于臨床慢性乙型肝炎肝纖維化患者，將患者隨機(jī)分為治療組和對照組，每組10例。對照組給予常規(guī)抗病毒治療，采用恩替卡韋分散片，0.5mg/d，口服。治療組在常規(guī)抗病毒治療的基礎(chǔ)上，給予山芝麻酸甲酯膠囊，200mg/次，3次/d，口服。兩組患者均治