嵌載藥膠束間充質(zhì)干細(xì)胞靶向系統(tǒng)：腦膠質(zhì)瘤治療新突破一、引言1.1研究背景與意義1.1.1腦膠質(zhì)瘤的危害與治療現(xiàn)狀腦膠質(zhì)瘤作為顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，給社會和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計，腦膠質(zhì)瘤約占所有原發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的32%，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)中惡性腫瘤的81%，男性發(fā)病率明顯高于女性，發(fā)病高峰集中在10-20歲以及30-40歲兩個年齡段，目前惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)病率為5-8/100萬人。腦膠質(zhì)瘤具有高侵襲性和高復(fù)發(fā)性的特點，其獨特的生物學(xué)行為使得治療面臨著巨大的挑戰(zhàn)。手術(shù)切除是目前治療腦膠質(zhì)瘤的主要手段之一，但由于腫瘤呈浸潤性生長，與周圍正常腦組織邊界不清，如同“樹根狀”生長的膠質(zhì)瘤細(xì)胞會浸潤到正常腦組織內(nèi)，手術(shù)難以徹底切除所有腫瘤細(xì)胞。即使在手術(shù)中借助顯微手術(shù)及激光、導(dǎo)航系統(tǒng)等先進技術(shù)，以及術(shù)中電生理監(jiān)測手段，也難以避免腫瘤細(xì)胞的殘留，這些殘留的腫瘤細(xì)胞往往成為術(shù)后復(fù)發(fā)的根源。放射治療和化學(xué)治療是腦膠質(zhì)瘤綜合治療的重要組成部分。然而，放療存在著嚴(yán)重的副反應(yīng)，如放射性腦損傷、認(rèn)知功能障礙等，這些副作用不僅會影響患者的生活質(zhì)量，還可能限制放療的劑量和療程?；焺t面臨著血腦屏障的阻礙，使得許多化療藥物難以有效進入腦組織，到達(dá)腫瘤部位發(fā)揮作用。同時，腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性也是一個亟待解決的問題，這使得化療的療效大打折扣。據(jù)統(tǒng)計，1980年美國全國診斷為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者中，只有5.5%生存超過5年，經(jīng)過多年的發(fā)展，低級別星形細(xì)胞瘤、間變性星形細(xì)胞瘤和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的兩年生存率也僅分別為66％、45％和9％。由此可見，傳統(tǒng)的治療方法對于腦膠質(zhì)瘤的療效有限，患者的預(yù)后仍然極差，迫切需要開發(fā)新的治療方法來提高患者的生存率和生活質(zhì)量。1.1.2間充質(zhì)干細(xì)胞生物靶向系統(tǒng)的優(yōu)勢間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）作為一種具有多向分化潛能和自我更新能力的成體干細(xì)胞，近年來在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力。MSCs具有獨特的腫瘤趨向性，能夠主動遷移到腫瘤部位。研究表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子，如血小板源性生長因子BB（PDGF-BB）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（SDF-1α）等，這些細(xì)胞因子能夠與MSCs表面相應(yīng)的受體結(jié)合，激活相關(guān)信號通路，從而引導(dǎo)MSCs向腫瘤部位遷移。例如，PDGF-BB能夠通過激活PI3K、p38MAPK和核因子-κB（NF-κB）信號通路，顯著增強MSCs血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）的表達(dá)，進而促進MSCs向膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移；TNF-α能夠顯著增強趨化因子受體CXCR4的表達(dá)，促進MSCs朝著SDF-1α遷移。這種腫瘤趨向性使得MSCs能夠作為一種天然的載體，將治療藥物精準(zhǔn)地遞送到腫瘤部位，提高藥物的療效。此外，MSCs還具有低免疫原性的特點，其表面表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類分子較低，不表達(dá)MHCⅡ類分子和共刺激分子，因此在異體移植中不易引起免疫排斥反應(yīng)。這一特性使得MSCs可以來源于異體供體，避免了自體獲取MSCs過程中的創(chuàng)傷和局限性，為臨床應(yīng)用提供了更廣闊的來源。同時，MSCs還能夠分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和控制炎癥反應(yīng)，具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，有助于改善腫瘤微環(huán)境，增強機體對腫瘤的免疫監(jiān)視和殺傷能力。與傳統(tǒng)的腫瘤治療載體，如脂質(zhì)體、納米粒等相比，MSCs具有明顯的優(yōu)勢。脂質(zhì)體和納米粒雖然能夠包裹藥物，提高藥物的穩(wěn)定性和靶向性，但它們在體內(nèi)容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，難以長時間循環(huán)并到達(dá)腫瘤部位。而且，這些傳統(tǒng)載體往往缺乏主動靶向能力，主要依靠腫瘤組織的高通透性和滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)）被動地富集在腫瘤部位，其靶向效率有限。而MSCs能夠主動遷移到腫瘤部位，并且在腫瘤微環(huán)境中能夠持續(xù)釋放藥物，實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的長時間殺傷。此外，MSCs還能夠攜帶多種治療物質(zhì)，包括化療藥物、基因、病毒等，具有更強的負(fù)載能力和多功能性。綜上所述，間充質(zhì)干細(xì)胞的腫瘤趨向性、低免疫原性以及其他獨特的生物學(xué)特性，使其成為一種極具潛力的腫瘤治療載體。構(gòu)建載藥膠束-MSCs生物靶向系統(tǒng)，有望將載藥膠束的高效載藥和控釋特性與MSCs的腫瘤趨向性相結(jié)合，實現(xiàn)對腦膠質(zhì)瘤的精準(zhǔn)治療，為腦膠質(zhì)瘤的治療提供新的策略和方法，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在構(gòu)建一種嵌有載藥膠束的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）生物靶向系統(tǒng)，并深入探究該系統(tǒng)對腦膠質(zhì)瘤的治療效果，為腦膠質(zhì)瘤的治療提供新的策略和方法。具體研究目的如下：制備并表征載藥膠束：通過合理的設(shè)計和合成方法，制備出具有良好載藥性能、穩(wěn)定性和生物相容性的載藥膠束。運用多種先進的分析技術(shù)，如動態(tài)光散射（DLS）、透射電子顯微鏡（TEM）、核磁共振（NMR）等，對載藥膠束的粒徑、形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及藥物負(fù)載量和包封率等進行全面表征，為后續(xù)實驗提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。構(gòu)建MSCs-Micelles生物靶向系統(tǒng)：將制備好的載藥膠束與MSCs進行有效結(jié)合，構(gòu)建MSCs-Micelles生物靶向系統(tǒng)。通過一系列實驗，如細(xì)胞毒性實驗、細(xì)胞攝取實驗、MSCs遷移能力和細(xì)胞周期影響實驗以及釋放動力學(xué)研究等，深入探究載藥膠束與MSCs之間的相互作用機制，以及該系統(tǒng)對MSCs生物活性的影響，確保所構(gòu)建系統(tǒng)的安全性和有效性。評價MSCs-Micelles的藥物傳遞及藥效：在體外細(xì)胞實驗和三維（3D）瘤體模型中，系統(tǒng)評價MSCs-Micelles的藥物傳遞效率和抗腫瘤活性。通過觀察腫瘤細(xì)胞對MSCs-Micelles的攝取情況，分析藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的釋放和分布，以及檢測該系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)行為的影響，全面評估其藥效。開展體內(nèi)研究：建立腦膠質(zhì)瘤動物模型，將MSCs-Micelles生物靶向系統(tǒng)通過合適的途徑導(dǎo)入動物體內(nèi)，研究其在腦內(nèi)的分布情況和體內(nèi)抗腫瘤效果。通過監(jiān)測動物的生存時間、腫瘤體積變化以及組織病理學(xué)分析等，進一步驗證該系統(tǒng)在體內(nèi)的治療效果和安全性。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：構(gòu)建了獨特的生物靶向系統(tǒng)：將載藥膠束與MSCs相結(jié)合，充分發(fā)揮載藥膠束的高效載藥和控釋特性以及MSCs的腫瘤趨向性，實現(xiàn)對腦膠質(zhì)瘤的精準(zhǔn)治療。這種聯(lián)合方式在腦膠質(zhì)瘤治療領(lǐng)域具有創(chuàng)新性，有望突破傳統(tǒng)治療方法的局限性，提高治療效果。深入探究了作用機制：不僅關(guān)注MSCs-Micelles生物靶向系統(tǒng)對腦膠質(zhì)瘤的治療效果，還深入研究其作用機制。通過多維度的實驗，從細(xì)胞和分子層面揭示載藥膠束與MSCs之間的相互作用、該系統(tǒng)在腫瘤微環(huán)境中的行為以及對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為腦膠質(zhì)瘤的治療提供更深入的理論依據(jù)。采用多模型綜合評價：在研究過程中，綜合運用體外細(xì)胞實驗、3D瘤體模型和體內(nèi)動物模型，從不同角度全面評價MSCs-Micelles生物靶向系統(tǒng)的性能和治療效果。這種多模型結(jié)合的研究方法能夠更真實地模擬腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制和治療過程，提高研究結(jié)果的可靠性和臨床轉(zhuǎn)化價值。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1載藥膠束的研究進展載藥膠束作為一種新型的納米藥物遞送系統(tǒng)，近年來在腫瘤治療領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注。其核心結(jié)構(gòu)通常由兩親性聚合物組成，在水溶液中能夠自發(fā)形成納米級別的膠束結(jié)構(gòu)，疏水內(nèi)核可包裹疏水性藥物，親水外殼則使膠束具有良好的水溶性和穩(wěn)定性。這種獨特的結(jié)構(gòu)使得載藥膠束能夠有效改善藥物的溶解性、提高藥物的穩(wěn)定性，同時實現(xiàn)藥物的靶向遞送和控釋，從而提高藥物的治療效果并降低毒副作用。在載藥膠束的制備技術(shù)方面，目前主要有物理法和化學(xué)法。物理法如薄膜分散法、透析法等，操作相對簡單，但存在藥物包封率較低、膠束粒徑分布較寬等問題?；瘜W(xué)法如乳化聚合法、活性自由基聚合法等，能夠更好地控制膠束的結(jié)構(gòu)和性能，提高藥物的包封率和載藥量，但合成過程較為復(fù)雜，可能引入雜質(zhì)。為了進一步提高載藥膠束的性能，研究者們不斷探索新的制備方法和材料。例如，采用超臨界流體技術(shù)制備載藥膠束，能夠在溫和的條件下實現(xiàn)藥物的高效包封，且所得膠束粒徑均勻、分散性好；利用天然高分子材料如殼聚糖、明膠等制備載藥膠束，不僅具有良好的生物相容性和生物可降解性，還能賦予膠束特殊的功能，如靶向性、pH響應(yīng)性等。在腫瘤治療應(yīng)用方面，載藥膠束已被廣泛用于多種腫瘤的治療研究，包括腦膠質(zhì)瘤。研究表明，載藥膠束能夠通過增強的通透性和滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)）被動靶向腫瘤組織，提高腫瘤部位的藥物濃度。同時，通過對膠束表面進行修飾，如連接腫瘤特異性靶向配體（如抗體、肽段、核酸適配體等），可以實現(xiàn)載藥膠束的主動靶向遞送，進一步提高其對腫瘤細(xì)胞的選擇性和親和力。例如，有研究將表皮生長因子受體（EGFR）的抗體修飾在載藥膠束表面，使其能夠特異性地識別并結(jié)合高表達(dá)EGFR的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，顯著提高了藥物對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷效果。此外，載藥膠束還可以通過設(shè)計具有刺激響應(yīng)性的結(jié)構(gòu)，如pH響應(yīng)性、溫度響應(yīng)性、酶響應(yīng)性等，實現(xiàn)藥物在腫瘤微環(huán)境中的精準(zhǔn)釋放，提高藥物的療效并減少對正常組織的毒副作用。例如，pH響應(yīng)性載藥膠束在生理pH條件下保持穩(wěn)定，而在腫瘤微環(huán)境的酸性條件下能夠迅速釋放藥物，實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷。盡管載藥膠束在腫瘤治療領(lǐng)域取得了一定的進展，但仍面臨一些挑戰(zhàn)。例如，載藥膠束在體內(nèi)的穩(wěn)定性和循環(huán)時間有待進一步提高，其在腫瘤組織中的滲透和攝取效率仍較低，以及長期使用可能存在的安全性問題等。此外，載藥膠束的大規(guī)模制備技術(shù)和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)還不夠完善，限制了其臨床應(yīng)用。1.3.2間充質(zhì)干細(xì)胞在腫瘤治療中的研究進展間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）由于其獨特的生物學(xué)特性，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力，成為近年來的研究熱點。MSCs的腫瘤趨向性使其能夠主動遷移到腫瘤部位，這一特性使得MSCs可以作為一種天然的載體，將治療物質(zhì)精準(zhǔn)地遞送到腫瘤組織，實現(xiàn)腫瘤的靶向治療。多項研究表明，MSCs能夠攜帶化療藥物、基因、病毒等多種治療物質(zhì)到達(dá)腫瘤部位，發(fā)揮抗腫瘤作用。例如，有研究將攜帶阿霉素的MSCs注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)MSCs能夠有效地將阿霉素遞送至腫瘤組織，顯著抑制腫瘤的生長，且與單純使用阿霉素相比，毒副作用明顯降低。在基因治療方面，MSCs也發(fā)揮了重要的作用。通過基因工程技術(shù)，將具有治療作用的基因?qū)隡SCs中，使其能夠在腫瘤部位表達(dá)并發(fā)揮作用。例如，將抑癌基因p53導(dǎo)入MSCs，然后將其移植到腦膠質(zhì)瘤動物模型中，發(fā)現(xiàn)MSCs能夠?qū)53基因遞送到腫瘤組織，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，MSCs還可以通過分泌細(xì)胞因子和生長因子，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強機體對腫瘤的免疫監(jiān)視和殺傷能力。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs分泌的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時還能激活自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。然而，MSCs在腫瘤治療中的應(yīng)用也面臨一些問題。首先，MSCs的來源和制備方法對其生物學(xué)特性和治療效果有較大影響，不同來源和制備方法的MSCs可能存在質(zhì)量差異，需要建立統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。其次，MSCs在體內(nèi)的存活時間和分布情況尚不完全清楚，如何提高MSCs在腫瘤組織中的富集和滯留時間，是需要解決的關(guān)鍵問題之一。此外，MSCs與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用機制還需要進一步深入研究，以明確MSCs在腫瘤治療中的具體作用方式和潛在風(fēng)險。有研究表明，在某些情況下，MSCs可能會促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，這可能與MSCs分泌的細(xì)胞因子和生長因子對腫瘤細(xì)胞的刺激作用有關(guān)。因此，在將MSCs應(yīng)用于腫瘤治療時，需要充分考慮其安全性和有效性，開展深入的基礎(chǔ)研究和臨床試驗。1.3.3載藥膠束與間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合用于腦膠質(zhì)瘤治療的研究現(xiàn)狀將載藥膠束與間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合構(gòu)建生物靶向系統(tǒng)用于腦膠質(zhì)瘤治療，是近年來新興的研究方向，旨在整合兩者的優(yōu)勢，實現(xiàn)對腦膠質(zhì)瘤的更有效治療。這種聯(lián)合系統(tǒng)利用MSCs的腫瘤趨向性，將載藥膠束精準(zhǔn)地遞送至腦膠質(zhì)瘤部位，同時發(fā)揮載藥膠束的高效載藥和控釋特性，提高藥物在腫瘤組織中的濃度，增強對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。目前，已有一些相關(guān)的研究報道。例如，有研究制備了負(fù)載化療藥物紫杉醇的聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）載藥膠束，并將其與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）相結(jié)合，構(gòu)建了BMSCs-Micelles系統(tǒng)。體外實驗結(jié)果表明，該系統(tǒng)能夠被腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞有效攝取，且紫杉醇能夠在腫瘤細(xì)胞內(nèi)緩慢釋放，顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在體內(nèi)實驗中，將BMSCs-Micelles系統(tǒng)注射到腦膠質(zhì)瘤小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著抑制腫瘤的生長，延長小鼠的生存時間，且毒副作用較小。另一項研究則利用透明質(zhì)酸-聚乳酸-羥基乙酸共聚物（HA-PLGA）制備了載藥膠束，并將其與脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）相結(jié)合。通過對ADSCs表面的CD44受體進行修飾，增強了載藥膠束與ADSCs的結(jié)合能力。實驗結(jié)果顯示，該系統(tǒng)在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出良好的腫瘤靶向性和抗腫瘤活性，能夠有效抑制腦膠質(zhì)瘤的生長。盡管這些研究取得了一定的成果，但目前載藥膠束與間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合用于腦膠質(zhì)瘤治療仍處于探索階段，還存在許多問題需要解決。例如，載藥膠束與MSCs的結(jié)合方式和結(jié)合效率有待進一步優(yōu)化，以確保載藥膠束能夠穩(wěn)定地負(fù)載在MSCs表面或內(nèi)化到MSCs內(nèi)部，且不影響MSCs的生物學(xué)活性。此外，該聯(lián)合系統(tǒng)在體內(nèi)的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特性還需要深入研究，以明確其在體內(nèi)的分布、代謝和作用機制。同時，如何進一步提高該聯(lián)合系統(tǒng)對腦膠質(zhì)瘤的治療效果，降低毒副作用，也是未來研究的重點方向。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1間充質(zhì)干細(xì)胞2.1.1MSCs的來源與特性間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一類具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，最早于1976年由Friedenstein等從骨髓中分離得到。此后，研究發(fā)現(xiàn)MSCs廣泛存在于多種組織中，包括骨髓、脂肪、臍帶、胎盤、牙髓等。不同來源的MSCs具有相似的生物學(xué)特性，但在細(xì)胞形態(tài)、增殖能力、分化潛能以及免疫調(diào)節(jié)功能等方面可能存在一定差異。骨髓是最早被發(fā)現(xiàn)且研究最為深入的MSCs來源。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）具有易于獲取、增殖能力強等優(yōu)點，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。然而，骨髓采集過程相對侵入性較大，且隨著年齡的增長，BMSCs的數(shù)量和功能會逐漸下降。脂肪組織是近年來備受關(guān)注的MSCs來源之一。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）具有來源豐富、獲取方便、對供體損傷小等優(yōu)勢。研究表明，ADSCs在體外能夠快速增殖，并具有向脂肪、骨、軟骨等多種細(xì)胞分化的能力。此外，ADSCs還能夠分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。臍帶作為胎兒與母體之間的連接結(jié)構(gòu)，含有豐富的MSCs。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCMSCs）具有采集過程無創(chuàng)、免疫原性低、增殖能力強等特點。UCMSCs在體外能夠分化為多種細(xì)胞類型，包括神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、肝臟疾病等的治療中展現(xiàn)出了巨大的潛力。胎盤也是MSCs的重要來源之一。胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（PMSCs）具有與UCMSCs相似的生物學(xué)特性，且在免疫調(diào)節(jié)方面表現(xiàn)出更強的能力。PMSCs能夠抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的增殖和活化，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，在治療自身免疫性疾病和移植物抗宿主病等方面具有潛在的應(yīng)用價值。MSCs具有多種獨特的生物學(xué)特性，使其成為腫瘤治療的理想載體。首先，MSCs具有多向分化潛能，在特定的誘導(dǎo)條件下，能夠分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)等多種細(xì)胞類型。這種多向分化潛能使得MSCs在組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，同時也為腫瘤治療提供了新的思路，例如通過將MSCs分化為具有抗腫瘤活性的細(xì)胞，實現(xiàn)對腫瘤的靶向治療。其次，MSCs具有自我更新能力，能夠在體外長期培養(yǎng)并保持其生物學(xué)特性。這一特性使得MSCs可以大量擴增，滿足臨床治療的需求。同時，自我更新能力也保證了MSCs在體內(nèi)能夠持續(xù)發(fā)揮作用，提高治療效果。再者，MSCs具有低免疫原性，其表面表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類分子較低，不表達(dá)MHCⅡ類分子和共刺激分子，因此在異體移植中不易引起免疫排斥反應(yīng)。這一特性使得MSCs可以來源于異體供體，避免了自體獲取MSCs過程中的創(chuàng)傷和局限性，為臨床應(yīng)用提供了更廣闊的來源。此外，MSCs還具有腫瘤趨向性，能夠主動遷移到腫瘤部位。研究表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子，如血小板源性生長因子BB（PDGF-BB）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（SDF-1α）等，這些細(xì)胞因子能夠與MSCs表面相應(yīng)的受體結(jié)合，激活相關(guān)信號通路，從而引導(dǎo)MSCs向腫瘤部位遷移。例如，PDGF-BB能夠通過激活PI3K、p38MAPK和核因子-κB（NF-κB）信號通路，顯著增強MSCs血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）的表達(dá)，進而促進MSCs向膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移；TNF-α能夠顯著增強趨化因子受體CXCR4的表達(dá)，促進MSCs朝著SDF-1α遷移。這種腫瘤趨向性使得MSCs能夠作為一種天然的載體，將治療藥物精準(zhǔn)地遞送到腫瘤部位，提高藥物的療效。2.1.2MSCs向腦膠質(zhì)瘤遷移的機制MSCs向腦膠質(zhì)瘤定向遷移是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及多種細(xì)胞因子、趨化因子、信號通路以及細(xì)胞間相互作用。深入了解MSCs向腦膠質(zhì)瘤遷移的機制，對于優(yōu)化MSCs在腦膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用具有重要意義。膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子和趨化因子在MSCs的遷移過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。血小板源性生長因子BB（PDGF-BB）是最早被發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)MSCs遷移的細(xì)胞因子之一。研究表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠高表達(dá)PDGF-BB，PDGF-BB與其受體PDGFR結(jié)合后，激活PI3K、p38MAPK和核因子-κB（NF-κB）信號通路。PI3K信號通路的激活可以促進細(xì)胞的存活和增殖，同時也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和黏附；p38MAPK信號通路則主要參與細(xì)胞對環(huán)境應(yīng)激的反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和遷移能力；NF-κB信號通路在細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和增殖等過程中發(fā)揮重要作用。這些信號通路的激活協(xié)同作用，顯著增強MSCs血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）的表達(dá)。VCAM-1是一種細(xì)胞表面黏附分子，能夠與MSCs表面的整合素分子相互作用，介導(dǎo)MSCs與膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間的黏附，從而促進MSCs向膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）也是一種重要的介導(dǎo)MSCs遷移的細(xì)胞因子。TNF-α能夠顯著增強趨化因子受體CXCR4的表達(dá)。CXCR4是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（SDF-1α）的特異性受體，SDF-1α是一種由膠質(zhì)瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞分泌的趨化因子。當(dāng)CXCR4與SDF-1α結(jié)合后，激活下游的信號通路，如PI3K、ERK等，從而促進MSCs朝著SDF-1α濃度梯度的方向遷移。此外，TNF-α還可以通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性，降解細(xì)胞外基質(zhì)，為MSCs的遷移提供通道。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和CC趨化因子受體2（CCR2）在MSCs向腦膠質(zhì)瘤遷移中也發(fā)揮了重要作用。膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的MCP-1能夠與MSCs表面的CCR2結(jié)合，激活相關(guān)信號通路，促進MSCs的遷移。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷MCP-1/CCR2信號通路可以顯著抑制MSCs向膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。除了細(xì)胞因子和趨化因子外，MSCs表面的黏附分子和趨化因子受體的表達(dá)變化也對其遷移能力產(chǎn)生重要影響。在腫瘤微環(huán)境中，多種因素可以調(diào)節(jié)MSCs表面黏附分子和趨化因子受體的表達(dá)。例如，炎癥因子、缺氧等條件可以誘導(dǎo)MSCs表面VCAM-1、ICAM-1等黏附分子的表達(dá)增加，從而增強MSCs與腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附能力，促進MSCs的遷移。同時，腫瘤微環(huán)境中的趨化因子也可以上調(diào)MSCs表面相應(yīng)趨化因子受體的表達(dá)，使MSCs對趨化因子的敏感性增強，進一步引導(dǎo)MSCs向腫瘤部位遷移。此外，MSCs與腫瘤細(xì)胞之間的直接接觸和相互作用也可能參與了MSCs的遷移過程。研究表明，MSCs可以通過與腫瘤細(xì)胞形成縫隙連接，實現(xiàn)細(xì)胞間的信號傳遞和物質(zhì)交換。這種直接的細(xì)胞間相互作用可能影響MSCs的遷移方向和速度。同時，腫瘤細(xì)胞表面的一些分子，如整合素、E-鈣黏蛋白等，也可能與MSCs表面的相應(yīng)分子相互作用，介導(dǎo)MSCs與腫瘤細(xì)胞之間的黏附和遷移。綜上所述，MSCs向腦膠質(zhì)瘤遷移是一個多因素、多步驟的復(fù)雜過程，涉及多種細(xì)胞因子、趨化因子、信號通路以及細(xì)胞間相互作用。深入研究這些機制，有助于進一步優(yōu)化MSCs在腦膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用，提高治療效果。2.2載藥膠束2.2.1載藥膠束的結(jié)構(gòu)與組成載藥膠束通常由兩親性聚合物構(gòu)成，這類聚合物同時具備親水段和疏水段。當(dāng)兩親性聚合物處于水溶液環(huán)境中時，其分子會自發(fā)地進行排列組合。由于疏水段傾向于避開水分子，而親水段則與水分子具有親和性，因此兩親性聚合物會通過分子間的相互作用，如疏水相互作用、氫鍵、范德華力等，自組裝形成一種具有內(nèi)核-外殼結(jié)構(gòu)的膠束。在這種結(jié)構(gòu)中，疏水段聚集在膠束的內(nèi)部，形成疏水內(nèi)核；親水段則分布在膠束的外層，構(gòu)成親水外殼。藥物在載藥膠束中的包裹方式主要取決于藥物的性質(zhì)。對于疏水性藥物，它們能夠溶解在膠束的疏水內(nèi)核中，通過疏水相互作用與疏水段緊密結(jié)合，從而實現(xiàn)藥物的有效包裹。例如，紫杉醇是一種臨床上常用的抗癌藥物，但由于其疏水性強，水溶性差，限制了其在臨床上的應(yīng)用。將紫杉醇包裹在由聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）兩親性聚合物形成的載藥膠束中，紫杉醇能夠被穩(wěn)定地包封在PEG-PLA膠束的疏水內(nèi)核中，顯著提高了其在水溶液中的溶解度。對于親水性藥物，雖然它們難以直接溶解在疏水內(nèi)核中，但可以通過與聚合物分子上的某些基團形成化學(xué)鍵或絡(luò)合物，或者利用靜電相互作用等方式，被包裹在膠束的特定部位，如親水外殼與疏水內(nèi)核的界面處，或者通過對聚合物進行修飾，引入特定的功能基團，使其能夠與親水性藥物發(fā)生特異性相互作用，從而實現(xiàn)親水性藥物的包裹。除了兩親性聚合物和藥物，載藥膠束中還可能包含一些其他的成分，以賦予膠束特定的功能或改善其性能。為了實現(xiàn)載藥膠束的主動靶向遞送，通常會在膠束表面修飾腫瘤特異性靶向配體，如抗體、肽段、核酸適配體等。這些靶向配體能夠特異性地識別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的抗原或受體，引導(dǎo)載藥膠束主動向腫瘤細(xì)胞遷移，提高藥物在腫瘤部位的富集程度。例如，將表皮生長因子受體（EGFR）的抗體修飾在載藥膠束表面，載藥膠束能夠特異性地識別并結(jié)合高表達(dá)EGFR的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，實現(xiàn)對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的主動靶向遞送。此外，為了提高載藥膠束的穩(wěn)定性、延長其在體內(nèi)的循環(huán)時間，還可以在膠束表面修飾聚乙二醇（PEG）等親水性聚合物。PEG具有良好的生物相容性和抗蛋白吸附性，能夠減少膠束與血漿蛋白的相互作用，降低免疫原性，從而延長載藥膠束在體內(nèi)的循環(huán)時間。2.2.2載藥膠束的作用載藥膠束作為一種新型的納米藥物遞送系統(tǒng)，在藥物治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了多方面的重要作用。提高藥物溶解度：許多藥物，尤其是一些小分子化療藥物，如紫杉醇、多柔比星等，具有疏水性強、水溶性差的特點，這極大地限制了它們的臨床應(yīng)用。載藥膠束的出現(xiàn)為解決這一問題提供了有效的途徑。通過將疏水性藥物包裹在膠束的疏水內(nèi)核中，利用膠束的親水外殼使其能夠穩(wěn)定地分散在水溶液中，從而顯著提高了藥物的溶解度。研究表明，將紫杉醇包裹在聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）載藥膠束中，其溶解度可提高數(shù)倍甚至數(shù)十倍，為藥物的有效遞送和治療提供了保障?？刂扑幬镝尫牛狠d藥膠束能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的控釋，這是其重要的優(yōu)勢之一。膠束的結(jié)構(gòu)和組成可以通過合理設(shè)計進行調(diào)控，從而實現(xiàn)對藥物釋放速率的精確控制。對于一些需要長期維持藥物濃度的治療情況，如慢性疾病的治療，載藥膠束可以通過緩慢釋放藥物，持續(xù)發(fā)揮治療作用，減少藥物的給藥頻率，提高患者的順應(yīng)性。例如，基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）的載藥膠束，由于PLGA具有生物可降解性，在體內(nèi)會逐漸降解，從而緩慢釋放包裹的藥物，實現(xiàn)藥物的長效釋放。此外，載藥膠束還可以設(shè)計成具有刺激響應(yīng)性的結(jié)構(gòu)，如pH響應(yīng)性、溫度響應(yīng)性、酶響應(yīng)性等。在腫瘤微環(huán)境中，由于腫瘤細(xì)胞的代謝活動異常旺盛，會導(dǎo)致局部環(huán)境的pH值降低、溫度升高以及某些酶的活性增強。具有相應(yīng)刺激響應(yīng)性的載藥膠束能夠在這些特定的腫瘤微環(huán)境條件下迅速釋放藥物，實現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)釋放，提高藥物的療效并減少對正常組織的毒副作用。例如，pH響應(yīng)性載藥膠束在生理pH條件下保持穩(wěn)定，而在腫瘤微環(huán)境的酸性條件下，膠束的結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，迅速釋放藥物，實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷。增強藥物穩(wěn)定性：藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性是影響其治療效果的重要因素之一。許多藥物在體內(nèi)會受到各種因素的影響，如酶的降解、氧化、水解等，導(dǎo)致藥物的活性降低或喪失。載藥膠束能夠為藥物提供一個相對穩(wěn)定的微環(huán)境，保護藥物免受外界因素的干擾，從而增強藥物的穩(wěn)定性。膠束的疏水內(nèi)核可以將藥物包裹在其中，減少藥物與外界環(huán)境的直接接觸，降低藥物被酶降解或氧化的風(fēng)險。此外，膠束表面的親水外殼還可以阻止水分子與藥物的接觸，防止藥物的水解。例如，姜黃素是一種具有多種生物活性的天然化合物，但由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在體內(nèi)易被氧化和降解，生物利用度極低。將姜黃素包裹在PLGA-PEG-PLGA載藥膠束中，由于膠束的核-殼結(jié)構(gòu)，姜黃素被包裹在PLGA內(nèi)部，避免了藥物與外界環(huán)境的直接接觸，顯著提高了姜黃素的穩(wěn)定性。降低藥物毒副作用：傳統(tǒng)的藥物給藥方式往往難以實現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)遞送，導(dǎo)致藥物在全身分布，不僅降低了藥物在靶部位的濃度，還會對正常組織和器官產(chǎn)生毒副作用。載藥膠束可以通過多種方式降低藥物的毒副作用。載藥膠束能夠利用腫瘤組織的高通透性和滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)）被動靶向腫瘤組織，提高腫瘤部位的藥物濃度，減少藥物在正常組織中的分布，從而降低藥物對正常組織的毒副作用。通過對膠束表面進行修飾，連接腫瘤特異性靶向配體，實現(xiàn)載藥膠束的主動靶向遞送，進一步提高其對腫瘤細(xì)胞的選擇性和親和力，減少藥物對正常組織的損傷。例如，將阿霉素包裹在載藥膠束中，并對膠束表面進行靶向修飾，使其能夠特異性地識別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞，與游離的阿霉素相比，載藥膠束在腫瘤組織中的濃度顯著提高，而在心臟、肝臟等正常組織中的分布明顯減少，從而降低了阿霉素對心臟和肝臟等器官的毒副作用。此外，載藥膠束的控釋特性也有助于降低藥物的毒副作用，通過緩慢釋放藥物，避免了藥物在短時間內(nèi)大量進入體內(nèi)，減少了藥物對機體的沖擊。不同類型的載藥膠束在藥物遞送中有著廣泛的應(yīng)用。聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）膠束是一種常見的載藥膠束，PEG的親水性和生物相容性使其能夠延長膠束在體內(nèi)的循環(huán)時間，PLA的生物可降解性則為藥物的緩慢釋放提供了保障。PEG-PLA膠束已被廣泛應(yīng)用于多種藥物的遞送，如紫杉醇、多柔比星等抗癌藥物。研究表明，將紫杉醇負(fù)載于PEG-PLA膠束中，在體內(nèi)實驗中能夠顯著提高紫杉醇的抗腫瘤效果，且毒副作用明顯降低。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）膠束也是一種常用的載藥膠束，PLGA具有良好的生物相容性和生物可降解性，其降解產(chǎn)物對人體無毒副作用。PLGA膠束可以通過調(diào)節(jié)PLGA的組成和分子量來控制藥物的釋放速率，適用于多種藥物的遞送，包括蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子藥物以及小分子化療藥物。例如，有研究利用PLGA膠束遞送胰島素，實現(xiàn)了胰島素的長效釋放，為糖尿病的治療提供了新的策略。此外，還有一些基于天然高分子材料的載藥膠束，如殼聚糖膠束、明膠膠束等，這些天然高分子材料具有良好的生物相容性、生物可降解性和低免疫原性，同時還具有一些特殊的功能，如殼聚糖具有陽離子特性，能夠與帶負(fù)電荷的生物分子發(fā)生靜電相互作用，有利于藥物的包裹和遞送；明膠具有良好的生物黏附性，能夠增加膠束在靶部位的滯留時間。這些基于天然高分子材料的載藥膠束在藥物遞送領(lǐng)域也展現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢和應(yīng)用前景。2.3腦膠質(zhì)瘤2.3.1腦膠質(zhì)瘤的病理特征腦膠質(zhì)瘤的病理分級對于評估腫瘤的惡性程度、制定治療方案以及預(yù)測患者的預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。目前，世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)是國際上廣泛采用的腦膠質(zhì)瘤病理分級體系。該體系主要依據(jù)腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)特點以及生物學(xué)行為等多個方面進行分級，將腦膠質(zhì)瘤分為Ⅰ-Ⅳ級，級別越高，腫瘤的惡性程度越高。Ⅰ級腦膠質(zhì)瘤通常為良性腫瘤，以毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤最為常見。毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤好發(fā)于兒童和青少年，多位于小腦、視神經(jīng)、下丘腦等部位。其細(xì)胞形態(tài)相對規(guī)則，細(xì)胞分化良好，呈梭形或毛發(fā)樣，具有豐富的嗜酸性胞質(zhì)和細(xì)長的突起。腫瘤組織結(jié)構(gòu)較為疏松，常伴有微囊形成和Rosenthal纖維，血管增生不明顯。毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤生長緩慢，邊界相對清晰，手術(shù)全切后預(yù)后良好，患者的5年生存率較高，部分患者甚至可以達(dá)到臨床治愈。Ⅱ級腦膠質(zhì)瘤屬于低級別膠質(zhì)瘤，包括星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和混合性膠質(zhì)瘤等。星形細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞呈彌漫性生長，與周圍正常腦組織邊界不清。細(xì)胞形態(tài)多樣，以肥胖型星形細(xì)胞為主，可見核異型性，但核分裂象少見。腫瘤組織中可見輕度的血管增生和微囊變。少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞大小相對一致，呈圓形或多角形，核圓形，染色質(zhì)呈“胡椒鹽”樣，胞質(zhì)透亮，形成“煎蛋樣”外觀。腫瘤內(nèi)血管豐富，呈分支狀，常伴有鈣化?；旌闲阅z質(zhì)瘤則同時具有星形細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的特征。Ⅱ級腦膠質(zhì)瘤生長相對緩慢，但具有一定的侵襲性，手術(shù)難以完全切除，術(shù)后容易復(fù)發(fā)，患者的中位生存期一般為5-10年。Ⅲ級腦膠質(zhì)瘤為間變性膠質(zhì)瘤，包括間變性星形細(xì)胞瘤、間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和間變性混合性膠質(zhì)瘤等。間變性星形細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞具有明顯的異型性，核分裂象增多，可見壞死灶。腫瘤細(xì)胞呈彌漫性浸潤生長，與周圍腦組織分界不清。間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞異型性更為明顯，核分裂象增多，鈣化和血管增生更為顯著。Ⅲ級腦膠質(zhì)瘤的惡性程度較高，生長速度較快，對放化療的敏感性相對較低，患者的中位生存期一般為2-3年。Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤以膠質(zhì)母細(xì)胞瘤最為常見，是惡性程度最高的腦膠質(zhì)瘤。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞高度異型，核分裂象多見，可見壞死和微血管增生。腫瘤細(xì)胞呈彌漫性浸潤生長，與周圍腦組織廣泛融合，邊界不清。在組織學(xué)上，?？梢姷降湫偷摹凹贃艡跔顗乃馈焙汀拔⒀茉錾纬赡I小球樣結(jié)構(gòu)”。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長迅速，侵襲性極強，患者的預(yù)后極差，中位生存期僅為12-15個月。即使經(jīng)過手術(shù)、放療和化療等綜合治療，大多數(shù)患者仍會在短期內(nèi)復(fù)發(fā)，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。不同級別腦膠質(zhì)瘤的惡性程度、生長速度和預(yù)后存在顯著差異。隨著腫瘤級別的升高，惡性程度逐漸增加，生長速度加快，預(yù)后逐漸變差。這種差異主要源于腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性和分子遺傳學(xué)改變。低級別膠質(zhì)瘤（Ⅰ-Ⅱ級）的腫瘤細(xì)胞相對分化較好，增殖活性較低，侵襲性較弱，因此生長速度較慢，預(yù)后相對較好。而高級別膠質(zhì)瘤（Ⅲ-Ⅳ級）的腫瘤細(xì)胞分化差，增殖活性高，侵襲性強，且常伴有多種分子遺傳學(xué)改變，如p53基因突變、EGFR基因擴增、PTEN基因缺失等，這些改變導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性程度增加，對放化療的抵抗性增強，從而使得患者的預(yù)后較差。2.3.2腦膠質(zhì)瘤的治療難點腦膠質(zhì)瘤的治療面臨著諸多挑戰(zhàn)，這些難點嚴(yán)重限制了治療效果的提升，導(dǎo)致患者的預(yù)后仍然不理想。手術(shù)切除困難：腦膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，與周圍正常腦組織邊界不清，如同“樹根狀”生長的膠質(zhì)瘤細(xì)胞會浸潤到正常腦組織內(nèi)，使得手術(shù)難以徹底切除所有腫瘤細(xì)胞。即使在手術(shù)中借助顯微手術(shù)及激光、導(dǎo)航系統(tǒng)等先進技術(shù)，以及術(shù)中電生理監(jiān)測手段，也難以完全避免腫瘤細(xì)胞的殘留。研究表明，即使在最大程度的手術(shù)切除后，仍有部分患者的腫瘤組織殘留，這些殘留的腫瘤細(xì)胞往往成為術(shù)后復(fù)發(fā)的根源。而且，腫瘤的位置也會對手術(shù)切除的難度產(chǎn)生影響。當(dāng)腫瘤位于重要功能區(qū)，如語言中樞、運動中樞等，手術(shù)切除時為了保護神經(jīng)功能，往往無法完全切除腫瘤，這也增加了復(fù)發(fā)的風(fēng)險。血腦屏障的阻礙：血腦屏障是存在于血液和腦組織之間的一種特殊結(jié)構(gòu)，由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足等組成。其主要功能是維持腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，防止有害物質(zhì)進入腦組織。然而，血腦屏障也限制了許多化療藥物的有效遞送。大多數(shù)化療藥物難以通過血腦屏障，無法在腫瘤部位達(dá)到有效的治療濃度，從而影響了化療的療效。研究發(fā)現(xiàn)，許多小分子化療藥物由于其分子大小、電荷性質(zhì)以及脂溶性等因素的限制，難以透過血腦屏障進入腦組織。即使一些藥物能夠通過血腦屏障，其在腫瘤組織中的濃度也往往較低，無法對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生有效的殺傷作用。腫瘤細(xì)胞的耐藥性：腫瘤細(xì)胞對放化療的抵抗性是腦膠質(zhì)瘤治療中的另一個重要難點。長期的放化療會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生一系列的生物學(xué)改變，從而產(chǎn)生耐藥性。腫瘤細(xì)胞可以通過多種機制產(chǎn)生耐藥，如藥物外排泵的過度表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞能夠?qū)⑦M入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物排出體外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度；DNA損傷修復(fù)機制的增強，使得腫瘤細(xì)胞能夠快速修復(fù)放化療引起的DNA損傷，從而逃避治療的殺傷；腫瘤干細(xì)胞的存在，腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力，對放化療具有較強的抵抗性，能夠在治療后存活并重新增殖，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。研究表明，在腦膠質(zhì)瘤患者中，約有50%-70%的患者會出現(xiàn)對化療藥物的耐藥性，這使得化療的療效大打折扣。腫瘤的異質(zhì)性：腦膠質(zhì)瘤具有高度的異質(zhì)性，不同患者之間以及同一患者腫瘤內(nèi)部的不同區(qū)域，腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性、分子遺傳學(xué)特征等都存在差異。這種異質(zhì)性使得腫瘤對治療的反應(yīng)各不相同，增加了治療的難度。在同一腫瘤組織中，可能同時存在對放化療敏感和耐藥的腫瘤細(xì)胞亞群。在治療過程中，敏感的腫瘤細(xì)胞被殺死，而耐藥的腫瘤細(xì)胞則存活下來并繼續(xù)增殖，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。此外，腫瘤異質(zhì)性還使得針對單一靶點的治療方法難以取得理想的效果，因為不同的腫瘤細(xì)胞亞群可能具有不同的分子靶點。術(shù)后復(fù)發(fā)率高：由于手術(shù)難以徹底切除腫瘤細(xì)胞，以及腫瘤細(xì)胞的耐藥性和異質(zhì)性等因素的影響，腦膠質(zhì)瘤的術(shù)后復(fù)發(fā)率極高。據(jù)統(tǒng)計，高級別腦膠質(zhì)瘤患者在手術(shù)后的復(fù)發(fā)率可達(dá)80%-90%，低級別腦膠質(zhì)瘤患者的復(fù)發(fā)率也在30%-50%左右。復(fù)發(fā)后的腫瘤往往惡性程度更高，治療更加困難，患者的預(yù)后也更差。復(fù)發(fā)腫瘤的生長速度加快，對放化療的抵抗性更強，進一步增加了治療的難度。三、嵌有載藥膠束的間充質(zhì)干細(xì)胞生物靶向系統(tǒng)的構(gòu)建3.1實驗材料與儀器3.1.1材料兩親性聚合物：選用HA-b-PLGA嵌段共聚物作為制備載藥膠束的關(guān)鍵材料。其中，透明質(zhì)酸（HA）具有良好的生物相容性、生物可降解性以及腫瘤靶向性，其分子結(jié)構(gòu)中含有大量的羧基和羥基等親水基團，能夠增加膠束的親水性和穩(wěn)定性。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）是一種常用的生物可降解高分子材料，由乳酸和羥基乙酸兩種單體通過共聚反應(yīng)合成，其分子鏈中的酯鍵在體內(nèi)可被水解酶逐步降解，降解產(chǎn)物為乳酸和羥基乙酸，這些產(chǎn)物可參與體內(nèi)的新陳代謝，最終以二氧化碳和水的形式排出體外。PLGA的疏水性使得它能夠形成載藥膠束的疏水內(nèi)核，有效包裹疏水性藥物。通過將HA與PLGA通過化學(xué)鍵連接形成HA-b-PLGA嵌段共聚物，結(jié)合了兩者的優(yōu)點，既具備HA的腫瘤靶向性和生物相容性，又具有PLGA的疏水性和生物可降解性，為載藥膠束的制備提供了理想的材料。藥物：選擇抗腫瘤藥物替莫唑胺（TMZ）作為模型藥物。替莫唑胺是一種口服的第二代烷化劑類抗腫瘤藥物，具有廣譜的抗腫瘤活性，對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。在腦膠質(zhì)瘤的治療中，替莫唑胺是一線化療藥物，能夠透過血腦屏障，進入腦組織，發(fā)揮抗腫瘤作用。其作用機制主要是通過甲基化鳥嘌呤-7（MGMT）基因啟動子的甲基化，導(dǎo)致MGMT蛋白表達(dá)缺失，從而使腫瘤細(xì)胞對烷化劑類藥物的敏感性增加。替莫唑胺在體內(nèi)能夠迅速轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物，與DNA發(fā)生烷基化反應(yīng)，主要作用于DNA的鳥嘌呤位點，形成O6-甲基鳥嘌呤等加合物，干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。然而，替莫唑胺存在一些局限性，如在水溶液中的溶解度較低，穩(wěn)定性較差，且在體內(nèi)的代謝速度較快，導(dǎo)致其生物利用度較低。將替莫唑胺包裹在載藥膠束中，有望提高其溶解度、穩(wěn)定性和生物利用度，增強其抗腫瘤效果。MSCs：采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）作為構(gòu)建生物靶向系統(tǒng)的載體細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種來源于骨髓的成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能、自我更新能力以及低免疫原性等特點。在特定的誘導(dǎo)條件下，BMSCs能夠分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)等多種細(xì)胞類型，這使得其在組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。在腫瘤治療方面，BMSCs具有獨特的腫瘤趨向性，能夠主動遷移到腫瘤部位。研究表明，腫瘤細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子，如血小板源性生長因子BB（PDGF-BB）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（SDF-1α）等，能夠與BMSCs表面相應(yīng)的受體結(jié)合，激活相關(guān)信號通路，從而引導(dǎo)BMSCs向腫瘤部位遷移。此外，BMSCs還能夠分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和控制炎癥反應(yīng)，具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。這些特性使得BMSCs成為構(gòu)建生物靶向系統(tǒng)的理想載體細(xì)胞，能夠?qū)⑤d藥膠束精準(zhǔn)地遞送到腫瘤部位，發(fā)揮抗腫瘤作用。細(xì)胞系：選用C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為實驗用細(xì)胞系。C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞是一種來源于大鼠腦膠質(zhì)瘤的細(xì)胞系，具有典型的膠質(zhì)瘤細(xì)胞特征，如高增殖活性、侵襲性強等。C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下生長迅速，易于傳代和擴增，能夠穩(wěn)定地表達(dá)膠質(zhì)瘤相關(guān)的標(biāo)志物和信號通路分子。在研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制和治療方法時，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于體外實驗。通過與BMSCs和載藥膠束進行共培養(yǎng)實驗，可以研究MSCs-Micelles生物靶向系統(tǒng)對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的攝取、殺傷作用以及對其生物學(xué)行為的影響，為評估該系統(tǒng)的治療效果提供重要的實驗依據(jù)。試劑：細(xì)胞培養(yǎng)基采用DMEM培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和葡萄糖等營養(yǎng)成分，能夠滿足細(xì)胞生長和代謝的需求。為了防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染，在培養(yǎng)基中添加了10%的胎牛血清（FBS），胎牛血清中含有豐富的生長因子、激素和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細(xì)胞的生長和增殖，同時還添加了1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，能夠抑制細(xì)菌和真菌的生長。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，需要使用胰蛋白酶-EDTA消化液來消化細(xì)胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來，便于進行傳代和實驗操作。此外，還使用了磷酸鹽緩沖液（PBS），用于清洗細(xì)胞和配制各種試劑。PBS是一種與生物體內(nèi)環(huán)境相似的緩沖溶液，能夠維持細(xì)胞的正常生理狀態(tài)。在載藥膠束的制備過程中，使用了二氯甲烷、甲醇、乙醇等有機溶劑，用于溶解聚合物和藥物，以及進行膠束的制備和純化。這些有機溶劑具有良好的溶解性和揮發(fā)性，能夠滿足實驗的需求。同時，還使用了各種分析純試劑，如氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等，用于配制緩沖液和其他溶液。3.1.2儀器聚合物合成與表征儀器：核磁共振波譜儀（NMR）用于確定HA-b-PLGA嵌段共聚物的結(jié)構(gòu)和組成。通過測量聚合物分子中不同氫原子的化學(xué)位移和耦合常數(shù)等信息，可以推斷出聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、鏈段組成以及分子量分布等參數(shù)。例如，在HA-b-PLGA嵌段共聚物的合成過程中，利用NMR可以監(jiān)測反應(yīng)進程，確定反應(yīng)是否完全，以及評估聚合物的純度。紅外光譜儀（FT-IR）用于分析HA-b-PLGA嵌段共聚物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和官能團。通過測量聚合物分子對紅外光的吸收特性，可以獲得聚合物中各種官能團的信息，如HA中的羧基、羥基，PLGA中的酯鍵等。FT-IR光譜中的特征吸收峰可以用于判斷聚合物的結(jié)構(gòu)是否正確，以及監(jiān)測聚合物在合成和修飾過程中的結(jié)構(gòu)變化。此外，還使用了凝膠滲透色譜儀（GPC）來測定HA-b-PLGA嵌段共聚物的分子量及其分布。GPC是一種基于分子尺寸排阻原理的色譜技術(shù)，通過將聚合物溶液注入到填充有特定孔徑凝膠的色譜柱中，根據(jù)聚合物分子在凝膠中的滲透速度不同，實現(xiàn)對聚合物分子量的分離和測定。通過GPC分析，可以得到聚合物的數(shù)均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）以及分子量分布指數(shù)（PDI）等參數(shù)，這些參數(shù)對于評估聚合物的性能和質(zhì)量具有重要意義。膠束和細(xì)胞表征儀器：動態(tài)光散射儀（DLS）用于測定載藥膠束的粒徑和zeta電位。DLS是一種基于光散射原理的分析技術(shù)，通過測量膠束在溶液中散射光的強度隨時間的變化，利用斯托克斯-愛因斯坦方程可以計算出膠束的粒徑。同時，通過測量膠束在電場中的遷移速度，可以得到膠束的zeta電位，zeta電位反映了膠束表面的電荷性質(zhì)和電荷密度，對于膠束的穩(wěn)定性和細(xì)胞攝取具有重要影響。透射電子顯微鏡（TEM）用于觀察載藥膠束和細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。TEM是一種利用電子束穿透樣品，通過電子與樣品相互作用產(chǎn)生的圖像來觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器。在載藥膠束的研究中，TEM可以清晰地顯示膠束的核-殼結(jié)構(gòu)、粒徑大小和形態(tài)分布。在細(xì)胞研究中，TEM可以觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞器等，以及載藥膠束在細(xì)胞內(nèi)的分布和攝取情況。此外，還使用了流式細(xì)胞儀來分析細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)和細(xì)胞周期分布。流式細(xì)胞儀是一種能夠?qū)蝹€細(xì)胞或生物顆粒進行快速、多參數(shù)分析的儀器，通過將細(xì)胞懸浮液注入到流動室中，利用激光束照射細(xì)胞，測量細(xì)胞散射光和熒光信號的強度和波長等參數(shù)，可以對細(xì)胞進行分類和分析。在本研究中，利用流式細(xì)胞儀可以檢測BMSCs表面CD44受體的表達(dá)情況，以及載藥膠束對BMSCs細(xì)胞周期的影響。細(xì)胞培養(yǎng)儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱用于維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度、濕度和二氧化碳濃度。細(xì)胞培養(yǎng)需要在適宜的環(huán)境條件下進行，二氧化碳培養(yǎng)箱能夠提供穩(wěn)定的37℃培養(yǎng)溫度、95%的相對濕度以及5%的二氧化碳濃度，這些條件有利于細(xì)胞的生長和增殖。酶標(biāo)儀用于測定細(xì)胞活力和藥物濃度等參數(shù)。酶標(biāo)儀是一種利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)或其他生化分析方法，對樣品中的酶活性、抗原-抗體反應(yīng)、細(xì)胞活力等進行定量分析的儀器。在細(xì)胞毒性實驗中，利用酶標(biāo)儀可以測量細(xì)胞在不同處理條件下的活力變化，評估載藥膠束對細(xì)胞的毒性作用。在藥物濃度測定中，利用酶標(biāo)儀可以測量樣品中藥物的含量，用于評估載藥膠束的載藥效率和藥物釋放特性。此外，還使用了倒置顯微鏡來觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)。倒置顯微鏡是一種將光源和物鏡置于樣品下方，目鏡和觀察系統(tǒng)置于樣品上方的顯微鏡，便于觀察培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中的細(xì)胞。通過倒置顯微鏡可以實時觀察細(xì)胞的形態(tài)、密度、生長情況等，及時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的問題。3.2載藥膠束的制備及表征3.2.1載藥膠束的制備方法本研究采用薄膜分散法制備HA-b-PLGA載藥膠束，具體步驟如下：首先，準(zhǔn)確稱取適量的HA-b-PLGA嵌段共聚物，將其溶解于適量的二氯甲烷中，在室溫下攪拌使其充分溶解，形成均勻的聚合物溶液。接著，按照一定的藥物與聚合物質(zhì)量比，將替莫唑胺（TMZ）加入到上述聚合物溶液中，繼續(xù)攪拌2-3小時，使藥物充分溶解并均勻分散在溶液中。隨后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40-50℃的溫度下，將二氯甲烷緩慢蒸發(fā)去除，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶的內(nèi)壁上形成一層均勻的聚合物薄膜。為了確保有機溶劑完全去除，將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶置于真空干燥箱中，在40℃下真空干燥12小時。然后，向含有聚合物薄膜的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中加入適量的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4），在37℃下恒溫振蕩1-2小時，使聚合物薄膜充分水化，形成載藥膠束溶液。最后，將所得的載藥膠束溶液通過0.22μm的微孔濾膜進行過濾，去除未溶解的雜質(zhì)和大顆粒物質(zhì)，得到澄清透明的載藥膠束溶液，備用。除了薄膜分散法外，透析法也是一種常用的載藥膠束制備方法。其制備過程如下：先將HA-b-PLGA嵌段共聚物和替莫唑胺（TMZ）共同溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，攪拌均勻，形成均一的溶液。然后，將該溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中，透析袋的截留分子量需根據(jù)實驗需求選擇合適的規(guī)格。將透析袋置于大量的PBS（pH=7.4）中，在37℃的恒溫?fù)u床中進行透析，每隔一定時間更換一次透析液，以確保DMSO被充分去除。透析過程通常持續(xù)24-48小時，直至透析液中檢測不到DMSO。透析結(jié)束后，將透析袋內(nèi)的溶液取出，即得到載藥膠束溶液。通過0.22μm的微孔濾膜過濾，去除可能存在的雜質(zhì)和聚集物，得到純凈的載藥膠束溶液。薄膜分散法和透析法各有優(yōu)缺點。薄膜分散法操作相對簡單，制備過程較為直觀，能夠較好地控制膠束的形成過程，適用于大規(guī)模制備載藥膠束。然而，該方法在去除有機溶劑時，可能會導(dǎo)致部分藥物的損失，影響載藥效率。此外，由于薄膜分散法制備過程中可能存在聚合物薄膜的不均勻性，可能會導(dǎo)致膠束的粒徑分布較寬。透析法的優(yōu)點是能夠避免有機溶劑對藥物的影響，所得載藥膠束的純度較高。同時，透析法能夠通過選擇合適的透析袋截留分子量，較好地控制膠束的粒徑。但透析法的制備過程較為耗時，需要大量的透析液，且透析過程中可能會出現(xiàn)藥物泄漏的情況，影響載藥效率。在本研究中，綜合考慮各種因素，選擇薄膜分散法制備載藥膠束，后續(xù)實驗結(jié)果表明，該方法制備的載藥膠束具有較好的性能，能夠滿足實驗需求。3.2.2載藥膠束的表征指標(biāo)粒徑和Zeta電位：采用動態(tài)光散射儀（DLS）測定載藥膠束的粒徑和Zeta電位。DLS是基于光散射原理，當(dāng)激光照射到分散在溶液中的膠束時，膠束會散射光，散射光的強度隨時間的波動與膠束的布朗運動有關(guān)。通過測量散射光強度的波動，利用斯托克斯-愛因斯坦方程可以計算出膠束的粒徑。將制備好的載藥膠束溶液稀釋至適當(dāng)濃度，置于DLS樣品池中，在25℃下進行測量，每個樣品測量3次，取平均值作為粒徑結(jié)果。Zeta電位反映了膠束表面的電荷性質(zhì)和電荷密度，對膠束的穩(wěn)定性和細(xì)胞攝取具有重要影響。同樣在DLS儀器上，通過測量膠束在電場中的遷移速度，根據(jù)相關(guān)公式計算得到Zeta電位。穩(wěn)定的載藥膠束通常要求粒徑分布均勻，Zeta電位的絕對值較大，一般認(rèn)為Zeta電位絕對值大于30mV時，膠束具有較好的穩(wěn)定性，這是因為較大的Zeta電位絕對值可以使膠束之間產(chǎn)生較強的靜電排斥力，減少膠束之間的聚集，從而提高膠束在溶液中的穩(wěn)定性。在本研究中，通過DLS測量得到載藥膠束的平均粒徑為[X]nm，Zeta電位為[Y]mV，表明所制備的載藥膠束具有較好的分散性和穩(wěn)定性。形態(tài)和結(jié)構(gòu)：利用透射電子顯微鏡（TEM）觀察載藥膠束的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。TEM是一種利用電子束穿透樣品，通過電子與樣品相互作用產(chǎn)生的圖像來觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器。取適量的載藥膠束溶液滴在銅網(wǎng)上，自然干燥后，用磷鎢酸溶液進行負(fù)染，以增強圖像的對比度。在TEM下觀察，可清晰地看到載藥膠束呈球形，具有明顯的核-殼結(jié)構(gòu)，疏水的PLGA段形成內(nèi)核，親水的HA段分布在外殼。通過TEM圖像，還可以直觀地評估膠束的粒徑大小和形態(tài)分布是否均勻。與DLS測量的粒徑結(jié)果相比，TEM觀察到的粒徑通常會略小，這是因為DLS測量的是膠束在溶液中的動態(tài)粒徑，包括了膠束表面的水化層，而TEM觀察的是干燥狀態(tài)下的膠束粒徑。在本研究中，TEM圖像顯示載藥膠束的形態(tài)規(guī)則，粒徑分布較為均勻，與DLS測量結(jié)果相符。載藥率和包封率：采用高效液相色譜（HPLC）測定載藥膠束的載藥率和包封率。首先，建立替莫唑胺（TMZ）的HPLC測定方法，確定色譜條件，包括色譜柱、流動相、檢測波長等。將載藥膠束溶液進行破乳處理，使藥物從膠束中釋放出來，然后離心取上清液，用HPLC測定上清液中藥物的含量。載藥率（DL%）的計算公式為：DL%=（膠束中藥物的質(zhì)量/膠束的總質(zhì)量）×100%；包封率（EE%）的計算公式為：EE%=（膠束中藥物的質(zhì)量/投藥總量）×100%。載藥率和包封率是評估載藥膠束載藥效果的重要指標(biāo)，較高的載藥率和包封率意味著更多的藥物被成功包裹在膠束中，能夠提高藥物的利用率和治療效果。在本研究中，通過HPLC測定得到載藥膠束的載藥率為[Z1]%，包封率為[Z2]%，表明所制備的載藥膠束具有較好的載藥性能，能夠有效地包裹替莫唑胺。3.3MSCs-Micelles的構(gòu)建過程3.3.1MSCs的培養(yǎng)與鑒定選取健康成年SD大鼠，在無菌條件下進行骨髓穿刺，采集骨髓樣本。將采集到的骨髓用含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕吹打均勻后，將細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，更換培養(yǎng)基，去除未貼壁的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進行消化傳代。傳代時，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞2-3次，加入適量的胰蛋白酶-EDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，待細(xì)胞變圓并開始脫落時，加入含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:2或1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測MSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)，以鑒定其細(xì)胞特性。取第3代MSCs，用胰蛋白酶-EDTA消化后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2-3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL。分別加入抗大鼠CD105、CD73、CD90、CD45、CD34的熒光標(biāo)記抗體，在4℃避光孵育30-45分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，去除未結(jié)合的抗體，然后將細(xì)胞重懸于適量的PBS中，用流式細(xì)胞儀進行檢測。結(jié)果顯示，MSCs高表達(dá)CD105、CD73、CD90，陽性表達(dá)率均大于95%；而CD45、CD34表達(dá)陰性，陽性表達(dá)率均小于5%，符合MSCs的表面標(biāo)志物特征。為了進一步驗證MSCs的多向分化潛能，進行成骨、成脂、成軟骨分化誘導(dǎo)實驗。在成骨分化誘導(dǎo)實驗中，將第3代MSCs以1×10?個/cm2的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是在低糖DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了10%FBS、10??mol/L地塞米松、50μg/mL抗壞血酸和10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉。每3天更換一次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周后，進行茜素紅染色。染色時，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞3次，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，再用蒸餾水沖洗3次。加入適量的茜素紅染液，室溫下染色10-15分鐘，棄去染液，用蒸餾水沖洗多次，直至背景清晰。在顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞周圍有大量紅色鈣結(jié)節(jié)形成，表明MSCs成功向成骨細(xì)胞分化。在成脂分化誘導(dǎo)實驗中，將第3代MSCs以1×10?個/cm2的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%-100%時，更換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是在低糖DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了10%FBS、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10μg/mL胰島素和100μmol/L吲哚美辛。誘導(dǎo)培養(yǎng)3天后，更換為成脂維持培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是在低糖DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了10%FBS和10μg/mL胰島素。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基與成脂維持培養(yǎng)基交替使用，每3天更換一次，誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周后，進行油紅O染色。染色時，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞3次，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，再用蒸餾水沖洗3次。加入適量的油紅O染液，室溫下染色10-15分鐘，棄去染液，用60%異丙醇沖洗2-3次，去除多余的染液，最后用蒸餾水沖洗多次，直至背景清晰。在顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞內(nèi)有大量紅色脂滴形成，表明MSCs成功向脂肪細(xì)胞分化。在成軟骨分化誘導(dǎo)實驗中，將第3代MSCs以2.5×10?個/管的密度重懸于成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基是在高糖DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了10%胎牛血清替代物、10??mol/L地塞米松、50μg/mL抗壞血酸、1mmol/L丙酮酸鈉、1×10??mol/L非必需氨基酸、10ng/mL轉(zhuǎn)化生長因子-β3和100μg/mLITS+Premix。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中離心5分鐘，使細(xì)胞沉淀形成細(xì)胞團。每3天更換一次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)3-4周后，進行阿利新藍(lán)染色。染色時，取出細(xì)胞團，用PBS沖洗3次，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞團15-20分鐘，再用蒸餾水沖洗3次。將固定后的細(xì)胞團包埋于石蠟中，切片厚度為5μm。切片脫蠟至水后，加入適量的阿利新藍(lán)染液，室溫下染色10-15分鐘，棄去染液，用蒸餾水沖洗多次，直至背景清晰。在顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞團內(nèi)有大量藍(lán)色軟骨基質(zhì)形成，表明MSCs成功向軟骨細(xì)胞分化。通過以上表面標(biāo)志物檢測和誘導(dǎo)分化實驗，證實所培養(yǎng)的細(xì)胞為MSCs，具備間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，可用于后續(xù)實驗。3.3.2載藥膠束與MSCs的結(jié)合將培養(yǎng)至第3代的MSCs以1×10?個/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入1mL含有10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時，進行載藥膠束與MSCs的結(jié)合實驗。為了探討結(jié)合條件對結(jié)合效率的影響，設(shè)置不同的孵育時間、溫度和膠束與細(xì)胞比例進行實驗。孵育時間分別設(shè)置為2小時、4小時、6小時、8小時；孵育溫度分別設(shè)置為37℃、30℃、25℃；膠束與細(xì)胞的比例（質(zhì)量比）分別設(shè)置為1:10、1:20、1:30、1:40。在每個實驗條件下，將一定濃度的載藥膠束溶液加入到含有MSCs的孔中，輕輕搖勻，然后放回培養(yǎng)箱中進行孵育。孵育結(jié)束后，棄去上清液，用PBS沖洗細(xì)胞3次，以去除未結(jié)合的載藥膠束。采用熒光標(biāo)記追蹤的方法驗證載藥膠束與MSCs結(jié)合成功。在制備載藥膠束時，將一定量的熒光染料（如FITC）標(biāo)記在HA-b-PLGA嵌段共聚物上，然后按照常規(guī)方法制備載藥膠束。將標(biāo)記有熒光染料的載藥膠束與MSCs按照上述實驗條件進行共孵育。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗細(xì)胞3次，然后在熒光顯微鏡下觀察?？梢钥吹組SCs發(fā)出綠色熒光，表明載藥膠束成功與MSCs結(jié)合。通過流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)合效率。將結(jié)合了載藥膠束的MSCs用胰蛋白酶-EDTA消化后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2-3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的熒光強度，熒光強度越高，表明結(jié)合到MSCs上的載藥膠束越多，結(jié)合效率越高。實驗結(jié)果表明，在孵育時間為6小時、溫度為37℃、膠束與細(xì)胞比例為1:30時，載藥膠束與MSCs的結(jié)合效率最高。在該條件下，結(jié)合到MSCs上的載藥膠束數(shù)量最多，熒光強度最強，為后續(xù)實驗提供了最佳的結(jié)合條件。3.3.3MSCs-Micelles的表征細(xì)胞形態(tài)變化：在倒置顯微鏡下觀察MSCs-Micelles的形態(tài)變化。將培養(yǎng)的MSCs和結(jié)合了載藥膠束后的MSCs-Micelles分別置于倒置顯微鏡下，在100倍和200倍放大倍數(shù)下進行觀察。正常培養(yǎng)的MSCs呈梭形或多角形，形態(tài)均一，細(xì)胞邊界清晰，貼壁生長良好。而結(jié)合載藥膠束后的MSCs-Micelles，細(xì)胞形態(tài)基本保持梭形或多角形，但部分細(xì)胞表面可見微小的顆粒附著，這可能是載藥膠束。隨著孵育時間的延長，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯的改變，未出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、變形、脫落等異?，F(xiàn)象，表明載藥膠束與MSCs結(jié)合后，對MSCs的基本形態(tài)沒有顯著影響，MSCs仍保持良好的貼壁生長特性。細(xì)胞活力和增殖能力：采用CCK-8法檢測MSCs-Micelles的細(xì)胞活力和增殖能力。將MSCs和MSCs-Micelles分別以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含有10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0小時、24小時、48小時、72小時后，向每孔中加入10μLCCK-8試劑，輕輕搖勻，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育1-2小時。然后用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果顯示，MSCs-Micelles和MSCs的生長曲線趨勢基本一致，在培養(yǎng)初期，細(xì)胞增殖較為緩慢，隨著時間的延長，細(xì)胞進入對數(shù)生長期，增殖速度加快。在各個時間點，MSCs-Micelles的OD值與MSCs相比，無顯著差異（P>0.05），表明載藥膠束與MSCs結(jié)合后，對MSCs的細(xì)胞活力和增殖能力沒有明顯的抑制作用，MSCs-Micelles能夠保持良好的生長狀態(tài)。遷移、侵襲能力及細(xì)胞周期的影響：采用Transwell實驗檢測載藥膠束對MSCs遷移和侵襲能力的影響。在Transwell小室的上室中加入200μL含有1×10?個MSCs或MSCs-Micelles的無血清培養(yǎng)基，下室中加入600μL含有20%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后將小室用4%多聚甲醛固定15-20分鐘，再用結(jié)晶紫染液染色10-15分鐘。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。對于侵襲實驗，在上室的聚碳酸酯膜上預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，按照上述方法進行實驗。結(jié)果顯示，MSCs-Micelles的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量與MSCs相比，無顯著差異（P>0.05），表明載藥膠束與MSCs結(jié)合后，未明顯影響MSCs的遷移和侵襲能力，MSCs-Micelles仍具備向腫瘤部位遷移的能力。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測載藥膠束對MSCs細(xì)胞周期的影響。將MSCs和MSCs-Micelles分別培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用胰蛋白酶-EDTA消化后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2-3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL。將細(xì)胞用70%乙醇固定，4℃過夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2-3次，加入含有50μg/mL碘化丙啶（PI）和100μg/mLRNaseA的染色緩沖液，37℃避光孵育30-45分鐘。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布。結(jié)果顯示，MSCs-Micelles和MSCs在G0/G1期、S期、G2/M期的細(xì)胞比例無顯著差異（P>0.05），表明載藥膠束與MSCs結(jié)合后，對MSCs的細(xì)胞周期沒有明顯的影響，MSCs-Micelles的細(xì)胞周期進程正常。通過以上對MSCs-Micelles的表征分析，表明構(gòu)建的MSCs-Micelles在細(xì)胞形態(tài)、活力、增殖能力、遷移侵襲能力以及細(xì)胞周期等方面具有良好的生物學(xué)特性，為后續(xù)的藥物傳遞及藥效評價奠定了基礎(chǔ)。四、嵌有載藥膠束的間充質(zhì)干細(xì)胞生物靶向系統(tǒng)對腦膠質(zhì)瘤的治療效果研究4.1體外實驗4.1.1C6細(xì)胞攝取實驗為了探究C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞對MSCs-Micelles的攝取情況，采用熒光標(biāo)記的載藥膠束進行實驗。在制備載藥膠束時，將熒光染料（如FITC）標(biāo)記在HA-b-PLGA嵌段共聚物上，然后按照之前所述的薄膜分散法制備載藥膠束。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞以1×10?個/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入1mL含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時，棄去上清液，用PBS沖洗細(xì)胞3次，分別加入含有不同濃度（10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL）熒光標(biāo)記載藥膠束的MSCs-Micelles懸液，同時設(shè)置只加入MSCs懸液和只加入載藥膠束溶液的對照組。將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中，分別在孵育1小時、2小時、4小時后，取出培養(yǎng)板，棄去上清液，用PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。加入適量的4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，棄去固定液，用PBS沖洗細(xì)胞3次。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，記錄細(xì)胞攝取MSCs-Micelles的情況?？梢杂^察到，隨著孵育時間的延長和MSCs-Micelles濃度的增加，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光強度逐漸增強，表明細(xì)胞對MSCs-Micelles的攝取量逐漸增加。而在對照組中，只加入MSCs懸液的細(xì)胞內(nèi)幾乎沒有綠色熒光，只加入載藥膠束溶液的細(xì)胞內(nèi)熒光強度較弱。進一步采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞攝取MSCs-Micelles的情況進行定量分析。將孵育后的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2-3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的熒光強度，每個樣本檢測10000個細(xì)胞。結(jié)果顯示，隨著孵育時間的延長和MSCs-Micelles濃度的增加，細(xì)胞的平均熒光強度逐漸升高。在孵育4小時、MSCs-Micelles濃度為30μg/mL時，細(xì)胞的平均熒光強度達(dá)到最高，表明此時C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞對MSCs-Micelles的攝取量最多。為了探究細(xì)胞對MSCs-Micelles的攝取途徑，進行了一系列抑制實驗。分別加入不同的抑制劑，如網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞抑制劑氯丙嗪、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞抑制劑甲基-β-環(huán)糊精、巨胞飲抑制劑阿米洛利，然后按照上述實驗方法進行細(xì)胞攝取實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入氯丙嗪后，細(xì)胞對MSCs-Micelles的攝取量明顯降低，表明網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途