水和沉積物中孔雀石綠及其代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質譜法2019-02-15實施2019-02-15實施天津市市場監(jiān)督管理委員會發(fā)布I本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由天津市漁業(yè)發(fā)展服務中心提出并歸口。本標準起草單位：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗測試中心(天津)。本標準主要起草人：陳永平、李春青、時文博、高麗娜、李寶華。1水和沉積物中孔雀石綠及其代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質本標準規(guī)定了水質及沉積物中孔雀石綠和無色孔雀石綠殘留凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法沉積物中孔雀石綠(MalachiteGreenMG)及其代謝物無色孔雀石綠(LeucomalachiteGreen殘留提取，利用N,N,N’,N'-四甲基對苯二胺(2,3,5,6-tetramethy1-1,4-phenylenediamineTMPD)4.1孔雀石綠及無色孔雀石綠標準品：孔雀石綠純度>98%,無色孔雀石綠純度>98%。4.2乙腈：色譜純。4.62.0mmoL·L1乙酸銨緩沖溶液：稱取0.077g無水乙酸銨溶解于適量水中，再加入0.5mL甲酸，4.7TMPD溶液(1.0mgmL?1):稱取50mgN,N,N’,N'-四甲基對苯二胺(TMPD)溶于50mL甲醇4.8孔雀石綠(MG)、無色孔雀石綠(LMG)標準儲備液(100μgmL1):準確稱取適量的孔雀石綠、無色孔雀石綠標準品，分別用乙腈溶解并定容，于-18℃避光保存，可使用1年。取適量的氘代孔雀石綠和氘代無色孔雀石綠標準品，分別用乙腈溶解并定容，用1年。4.10混合外標標準中間液(1.0μgmL?1):分別準確吸取1.0mL孔雀石綠和無色孔雀石綠的標準儲備液(4.7)于100mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，于-18℃避光保存，可使用6個月。24.11混合內(nèi)標標準中間液(1.0μgmL?1):分別準確吸取1.0mL氘代孔雀石綠和氘代無色孔雀石綠標準儲備液(4.8)于100mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，于-18℃避光保存，可使用6個月。4.12混合外標標準使用液(0.10μgmL1):準確吸取1.00mL混合外標標準中間液(4.9)于10.0mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，于-18℃避光保存，可使用1個月。4.13混合內(nèi)標標準使用液(0.10μgmL1):準確吸取1.00mL混合內(nèi)標標準中間液(4.10)于10.0mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，于-18℃避光保存，可使用1個月。4.14混合標準工作液：臨用時準確吸取相應體積的混合外標標準使用液(4.11),再加入混合內(nèi)標標準使用液(4.12)20μL,用乙腈和2.0mmoL·L1乙酸銨緩沖溶液(1:1,V/V)稀釋定容至1mL,標準曲線系列濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20ng·mL?1,現(xiàn)用現(xiàn)配。5.1液相色譜-串聯(lián)質譜儀：配有電噴霧(ESI)離子源。5.2電子天平：感量1.0mg和0.01mg。5.3高速冷凍離心機：可制冷到4℃(最大轉速高于10000r/min)。5.9冰箱：具有4℃冷藏箱和達到-18℃以下冷凍箱。6.1.1水：將采集水樣過0.45μm濾膜，收集水樣體積1L,于4℃冰箱保存，6d內(nèi)測定。6.1.2沉積物：將沉積物置于陰涼處風干，研磨過篩(150目),收集沉積物質量20g,于4℃冰箱保存，6d內(nèi)測定。6.2.1水：量取水樣500mL,置于分液漏斗中，加入40μL混合內(nèi)標標準使用液(4.12),再加入30mL的二氯甲烷，振搖5min,靜置30min,取下層二氯甲烷于錐形瓶中，再加入30mL二氯甲烷重復一次，若分層不明顯，取其下層液于50mL離心管中，冷凍離心機6000r/min離心3min,再取下層液，合并于錐形瓶中，旋轉蒸發(fā)溫度30℃,旋轉蒸發(fā)濃縮至近干，殘留物加入2.0mL的乙腈-2mmoL·L1乙酸銨溶液(1:1,V/)(4.5),渦旋振蕩1min,超聲波振蕩2min,過0.22μm有機相濾6.2.2沉積物：稱取粉末狀沉積物樣品(5.0±0.01)g于50mL聚乙烯離心管中，先加入200μLTMPD溶液(4.6),再加入40μL混合內(nèi)標標準使用液(4.12),加入20mL二氯甲烷，渦旋2min,超聲波震蕩25min,6000r/min離心5min,取上層液于錐形瓶中，再向離心管中加入20mL二氯甲烷，重復上述操作，合并上清液錐形瓶中，旋轉蒸發(fā)溫度30℃,旋轉蒸發(fā)濃縮至近干，殘留物加入2.0mL3的乙腈-2mmoL·L1乙酸銨溶液(1:1,V/)(4.5),渦旋振蕩1min,超聲波振蕩2min,過0.22μm有機相濾膜后，上機測定。6.3標準工作曲線制作分別準確移取100ngmL1混合外標標準使用液(4.11),乙腈稀釋至0.50ngmL1、1.0ngmL?1、液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。6.4測定6.4.1色譜條件色譜柱：C?柱，2.2μm,75mm×2.1mm(內(nèi)徑),或相當。柱溫：35℃。樣品室溫度：15℃。流動相A:含0.1%甲酸的2.0mmoL·L?1的乙酸銨水溶液；流動相B:0.1%甲酸-乙腈溶液；進樣體積：流速：0.25mL·min?1。表1流動相梯度洗脫程序時間(min)272926.4.2質譜條件離子化模式：電噴霧離子源(ESI),正離子模式。離子源溫度：600℃。氣簾氣：25;碰撞氣：中；噴霧電壓：5000v;輔氣1:60;輔氣2:40。掃描模式：多反應監(jiān)測(MRM,反應監(jiān)測母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量見表2。表2目標化合物質譜條件目標化合物母離子(m/z)子離子(m/z)去簇電壓(V)碰撞能量(ev)46.5定性依據(jù)表3基峰與次強碎片離子豐度比要求次強碎片離子相對豐度(%)允許相對偏差(%)6.6定量測定6.7空白試驗7計算7.1用儀器自帶工作站按內(nèi)標法進行自動計算，以化合物上機響應的峰面積與內(nèi)標物峰面積比值為縱7.2水樣品中孔雀石綠及其代謝物殘留量按式(1)計算。計算結果須扣除空白值。X——試樣中目標物含量，單位為微克每升(μg·L?1);C——試樣溶液中目標物含量，單位為納克每毫升(ng·mL?1);V——試樣體積，單位為毫升(mL);7.3沉積物樣品中孔雀石綠及其代謝物殘留量按式(2)計算。計算結果須扣除空白值。C——試樣溶液中目標物含量，單位為納克每毫升(ng·mL?1);m——試樣質量，單位為克(g);58.1水質中孔雀石綠及其代謝物(無色孔雀石綠)的定量限均為4ng·L?1。8.2沉積物中孔雀石綠及其代謝物(無色孔雀石綠)的定量限均為0.4μg·kg?1。9.1水質中添加濃度為4ng·L1~100ng·L?1時回收率為70%～110%。9.2沉積物中添加濃度為0.4μg·kg?1~10μg·kg1時回收率為70%～110%。本方法的批內(nèi)相對標準偏差小于10%,批間相對標準偏差小于15%。(資料性附錄)空白沉積物特征離子色譜圖孔雀石綠及其代謝物混合標準特征離子色譜圖(10ngmL1)(資料性附錄)沉積物加標特征離子色譜圖(2.0μg-kg?1)XICXICof+MRM(6pairs):329.300/313.100Da■XICof+MRM(6pairs):334.300/318.200DaID:MXICof+MRM(6pairs):331.3000.51.01.52.02.53.0354.04.55.05.59(資料性附錄)■XICof+MRM(6pais):329.300/313.100DaID:MG-313fromSample23■XICof+MRM(6pairs):334.300/318.200DaID:MG-Dfr(資料性附錄)空白水質加標特征離子色譜圖(20ng·L1)