「翹客」技術(shù)手冊：血管平滑肌細(xì)胞GSN/α-SMA免疫熒光雙標(biāo)染色實驗方案研究背景凝溶膠蛋白（Gelsolin,GSN）是一種重要的肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白，在血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）功能調(diào)控中發(fā)揮多重作用：1）作為Ca2?依賴的肌動蛋白切割蛋白，GSN通過切割和封端F-actin微絲，動態(tài)調(diào)控VSMCs內(nèi)α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）微絲骨架的重塑，該過程對維持血管張力、收縮功能及細(xì)胞遷移至關(guān)重要。2）參與血管收縮的負(fù)向調(diào)控，在血管收縮信號觸發(fā)導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2?濃度升高時，激活的GSN快速解聚F-actin微絲網(wǎng)絡(luò)，削弱α-SMA聚合體穩(wěn)定性，從而降低VSMCs收縮效率，此機制可有效防止血管過度收縮（如高血壓病理狀態(tài)）。3）通過阻斷RhoA/ROCK信號通路，GSN可抑制VSMCs異常增殖和遷移，減少細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積，進(jìn)而延緩動脈粥樣硬化、血管再狹窄等病變進(jìn)程。已有研究證實GSN敲除小鼠在血管損傷后，新生內(nèi)膜增厚加劇。4）在氧化應(yīng)激（如ROS累積）或炎癥因子（TNF-α、IL-6）刺激下，GSN表達(dá)上調(diào)以維持細(xì)胞骨架完整性，阻止VSMCs凋亡并保護血管內(nèi)皮屏障功能。綜上，GSN是血管疾病研究的關(guān)鍵靶蛋白，α-SMA是平滑肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。選擇高品質(zhì)抗體進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色實驗，原位分析GSN在VSMCs中的表達(dá)模式及與α-SMA的共定位關(guān)系，對深入理解血管結(jié)構(gòu)重塑機制具有重要的科學(xué)價值。一、實驗前準(zhǔn)備試劑名稱一抗Anti-SMAMouseMab(義翹神州

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IHC068)Anti-GSNRabbitPolyclonal(義翹神州

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207845-T08)熒光二抗抗小鼠IgG-FITC（綠色）抗兔IgG-Cy3（紅色）固定劑4%多聚甲醛（PFA）通透劑0.1%TritonX-100（PBS配制）封閉液5%BSA+0.1%Tween-20（PBS）封片劑含DAPI的抗淬滅封片劑洗滌緩沖液PBST（含0.05%Tween-20）二、實驗步驟1.樣本固定（1）細(xì)胞爬片/切片：從血管組織中分離原代血管平滑肌細(xì)胞，接種于蓋玻片或包埋組織切片上，37℃、5%

CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞融合度達(dá)到50%-80%。（2）在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的爬片用PBST浸洗3次，每次3min，輕輕晃動，避免將細(xì)胞沖掉。（3）用4%

PFA室溫固定15min，隨后用PBST漂洗3次，每次5min。2.通透處理（4）用0.1%TritonX-100室溫通透10min，再用PBST漂洗3次，每次5min，以去除殘余的去污劑。3.封閉（5）滴加5%

BSA封閉液，室溫孵育1h，可有效減少非特異性抗體結(jié)合。4.一抗孵育（6）配制雙抗體混合液：用封閉液稀釋Anti-GSNRabbitpAb：建議1:500Anti-α-SMAMousemAb：建議1:200注：抗體濃度需參考說明書起始濃度，根據(jù)預(yù)實驗進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。（7）吸棄封閉液，根據(jù)爬片大小加入稀釋好的一抗混合液，一般每片加100-200μl，確保一抗均勻覆蓋細(xì)胞表面。避免氣泡。（8）將爬片放入濕盒中，4°C孵育過夜（16h，可增強特異性結(jié)合，降低背景）。有的實驗采用快速孵育方案，37℃孵育1-2小時。（9）一抗孵育結(jié)束后，吸棄一抗溶液，用PBST漂洗3次，每次10min。充分去除未結(jié)合的一抗，減少非特異性熒光背景。5.熒光二抗孵育（10）避光環(huán)境下配制二抗混合液：用封閉液稀釋抗小鼠IgG-FITC：1:1000抗兔IgG-Cy3：1:1000（11）避光環(huán)境下加入稀釋好的熒光二抗溶液（每片100-200μL），均勻覆蓋爬片。（12）室溫避光孵育1h。（13）吸棄二抗溶液，用PBST漂洗3次，每次10min。全程避光操作。6.封片與結(jié)果觀察（14）取干凈載玻片，在其中央位置滴加1-2滴抗熒光淬滅的封片劑。避免過多或過少，過多容易導(dǎo)致爬片移位。過少容易產(chǎn)生氣泡。（15）用無菌鑷子小心取出爬片，使細(xì)胞面朝下。緩慢覆蓋在封片劑上，避免產(chǎn)生氣泡。若產(chǎn)生氣泡，可輕輕推動爬片排出，或用針尖挑破（16）用濾紙吸去載玻片邊緣多余的封片劑，室溫避光固化24h，使封片劑固化。（17）熒光顯微鏡觀察：根據(jù)二抗熒光素類型選擇相應(yīng)的激發(fā)波長，如FITC用488nm，Cy3用552nm。三、結(jié)果判讀靶蛋白熒光標(biāo)記預(yù)期定位共定位區(qū)域GSNCy3紅色胞質(zhì)彌散/點狀黃色信號（與α-SMA重疊區(qū)）α-SMAFITC綠色胞質(zhì)纖維狀結(jié)構(gòu)黃色信號（與SMA重疊區(qū)）偽色調(diào)整提示：若共聚焦軟件中黃色信號過強，可降低Cy3通道增益（Cy3量子產(chǎn)率高于FITC）。四、實驗結(jié)果GSN與α-SMA在血管平滑肌細(xì)胞中的共定位分析從圖中可以看出，GSN在胞質(zhì)均勻分布或與肌動蛋白共定位（調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架），α-SMA主要在胞質(zhì)中呈纖維狀分布（肌動蛋白絲）。Merge圖片中黃色信號提示α-SMA與GSN存在相互作用或共定位區(qū)域。五、結(jié)果討論本研究采用免疫熒光雙標(biāo)染色技術(shù)，系統(tǒng)揭示了GSN與α-SMA在VSMCs內(nèi)的共定位特征，為闡明二者在血管功能調(diào)控中的協(xié)同機制提供了關(guān)鍵線索。在生理狀態(tài)下，GSN通過動態(tài)解聚α-SMA構(gòu)成的微絲骨架，維持VSMCs適度收縮的可塑性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使其能夠靈活響應(yīng)生理信號。而在動脈粥樣硬化、高血壓等病理條件下，GSN的表達(dá)顯著下降，協(xié)同作用遭到破壞，導(dǎo)致α-SMA微絲過度聚合，穩(wěn)定性異常升高，進(jìn)而驅(qū)動VSMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化。這一轉(zhuǎn)化過程伴隨細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，最終加