干擾素γ與喜樹堿對(duì)肺腺癌細(xì)胞株SPC-A1中CDA1表達(dá)的影響及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均位居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。肺腺癌作為肺癌的一種常見(jiàn)類型，其發(fā)病率在近年來(lái)呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在非吸煙人群中，肺腺癌的發(fā)生比例相對(duì)較高，這使得其發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究備受關(guān)注。肺腺癌具有治療難度大、易復(fù)發(fā)以及預(yù)后不佳等特點(diǎn)，給患者及其家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。目前，臨床上針對(duì)肺腺癌的治療手段主要包括手術(shù)切除、化療、放療以及靶向治療等，但這些治療方法均存在一定的局限性。例如，手術(shù)切除對(duì)于早期肺腺癌患者可能具有較好的療效，但對(duì)于中晚期患者，由于腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，手術(shù)往往難以徹底清除癌細(xì)胞；化療藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，且長(zhǎng)期使用還容易產(chǎn)生耐藥性；放療則可能會(huì)引起放射性肺炎等并發(fā)癥，影響患者的生活質(zhì)量。因此，尋找能夠有效治療肺腺癌的新藥物和新治療策略顯得尤為重要。近年來(lái)，隨著對(duì)腫瘤生物學(xué)研究的不斷深入，干擾素γ（Interferon-γ，IFN-γ）和喜樹堿（Camptothecin）作為兩種具有潛在抗腫瘤活性的物質(zhì)，逐漸受到了科研人員的廣泛關(guān)注。干擾素γ是一種由活化的T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用。它可以通過(guò)激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力；還能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡，抑制腫瘤血管生成，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。已有研究表明，干擾素γ在多種腫瘤的治療中顯示出一定的療效，為肺腺癌的治療提供了新的思路。喜樹堿是從喜樹中提取分離得到的一種生物堿，具有獨(dú)特的抗腫瘤作用機(jī)制。它能夠特異性地抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I，干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。喜樹堿及其衍生物在臨床上已被應(yīng)用于多種癌癥的治療，且表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性。研究喜樹堿對(duì)肺腺癌的治療作用，對(duì)于開發(fā)新的肺腺癌治療藥物具有重要意義。細(xì)胞自身分化抗原1（CDA1）作為一種在細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)，其表達(dá)水平的變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在肺腺癌中，CDA1的表達(dá)異常可能參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程。因此，研究干擾素γ和喜樹堿對(duì)肺腺癌細(xì)胞株SPC-A1中CDA1表達(dá)的作用，對(duì)于揭示這兩種藥物的抗腫瘤機(jī)制，尋找新的肺腺癌治療靶點(diǎn)具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探究干擾素γ和喜樹堿這兩種具有獨(dú)特作用機(jī)制的物質(zhì)，對(duì)肺腺癌細(xì)胞株SPC-A1中CDA1表達(dá)所產(chǎn)生的具體作用。通過(guò)精確檢測(cè)在不同濃度的干擾素γ和喜樹堿處理下，以及處理不同時(shí)間后，SPC-A1細(xì)胞中CDA1表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化情況，明確這兩種藥物對(duì)CDA1表達(dá)的影響規(guī)律。進(jìn)一步深入分析干擾素γ和喜樹堿作用后，CDA1表達(dá)與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白（如P53、P21、CyclinD1等）表達(dá)之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，揭示其潛在的作用機(jī)制。從臨床應(yīng)用的角度來(lái)看，本研究具有重大的意義。肺腺癌作為一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，現(xiàn)有的治療方法存在諸多局限性，迫切需要尋找新的治療靶點(diǎn)和有效的治療藥物。明確干擾素γ和喜樹堿對(duì)肺腺癌細(xì)胞中CDA1表達(dá)的作用，有助于揭示這兩種藥物的抗腫瘤作用機(jī)制，為肺腺癌的治療提供全新的思路和理論基礎(chǔ)。一方面，如果能夠證實(shí)干擾素γ和喜樹堿通過(guò)調(diào)節(jié)CDA1表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用，那么CDA1有可能成為肺腺癌治療的新靶點(diǎn)，為開發(fā)針對(duì)CDA1的靶向治療藥物提供理論依據(jù)；另一方面，本研究結(jié)果也為干擾素γ和喜樹堿在肺腺癌治療中的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)指導(dǎo)，有助于優(yōu)化治療方案，提高治療效果，改善患者的預(yù)后。從學(xué)術(shù)研究的角度而言，本研究將豐富肺腺癌發(fā)病機(jī)制和治療研究的理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究提供重要的參考和借鑒，推動(dòng)肺腺癌治療領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。1.3研究方法和創(chuàng)新點(diǎn)在本研究中，將人肺腺癌細(xì)胞株SPC-A1置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且達(dá)到足夠數(shù)量時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SPC-A1細(xì)胞以適宜密度接種于96孔板中，分為對(duì)照組、不同濃度干擾素γ處理組（如100U/mL、500U/mL、1000U/mL）、不同濃度喜樹堿處理組（如1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）以及干擾素γ與喜樹堿聯(lián)合處理組，每組設(shè)置多個(gè)復(fù)孔。分別處理12h、24h及48h，為后續(xù)研究提供不同處理?xiàng)l件下的細(xì)胞樣本。運(yùn)用四唑鹽（MTT）比色法，觀察不同濃度喜樹堿及干擾素γ處理12h、24h及48h前后細(xì)胞增殖變化情況，以此評(píng)估藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。采用Real-timeRT-PCR及Westernblot法，檢測(cè)分別加入及共同加入干擾素γ及喜樹堿干預(yù)前后CDA1、P53、P21、CyclinD1的mRNA及蛋白的表達(dá)情況，從分子層面深入探究藥物對(duì)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法從蛋白質(zhì)水平分析其相關(guān)性，明確各因素之間的內(nèi)在聯(lián)系。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面。一方面，目前關(guān)于干擾素γ和喜樹堿對(duì)肺腺癌細(xì)胞作用的研究，大多集中在單一藥物對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡等方面的影響，較少有研究綜合分析這兩種藥物對(duì)肺腺癌細(xì)胞中CDA1表達(dá)的作用，以及CDA1表達(dá)與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性。本研究將這兩個(gè)方面結(jié)合起來(lái)，為深入了解肺腺癌的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供了更全面的視角。另一方面，本研究不僅探討了干擾素γ和喜樹堿單獨(dú)作用時(shí)對(duì)肺腺癌細(xì)胞株SPC-A1中CDA1表達(dá)的影響，還研究了它們聯(lián)合作用時(shí)的效果，這對(duì)于開發(fā)新的肺腺癌聯(lián)合治療策略具有重要的指導(dǎo)意義，有助于為臨床治療提供更有效的方案。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1肺腺癌及SPC-A1細(xì)胞株肺腺癌是肺癌中較為常見(jiàn)的一種類型，屬于非小細(xì)胞肺癌。其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，尤其在非吸煙人群、女性以及亞洲人群中更為顯著。肺腺癌具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和臨床特征。在病理形態(tài)上，肺腺癌細(xì)胞通常呈腺樣結(jié)構(gòu)，可伴有乳頭、微乳頭或?qū)嵭陨L(zhǎng)方式。腫瘤細(xì)胞的形態(tài)多樣，細(xì)胞核大小不一，染色質(zhì)豐富，核仁明顯。這種復(fù)雜的病理特征使得肺腺癌在診斷和治療上具有一定的挑戰(zhàn)性。肺腺癌的早期癥狀往往不明顯，多數(shù)患者在體檢或因其他疾病進(jìn)行胸部影像學(xué)檢查時(shí)才被發(fā)現(xiàn)。隨著病情的進(jìn)展，患者可能出現(xiàn)咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、呼吸困難等癥狀。由于肺腺癌早期癥狀隱匿，很多患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)。肺腺癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，涉及遺傳因素、環(huán)境因素以及生活方式等多個(gè)方面。遺傳因素在肺腺癌的發(fā)生中起著重要作用，一些基因突變，如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因突變、間變性淋巴瘤激酶（ALK）基因重排等，與肺腺癌的發(fā)病密切相關(guān)。這些基因突變可以導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。環(huán)境因素也是肺腺癌發(fā)病的重要誘因，長(zhǎng)期暴露于吸煙環(huán)境、空氣污染、職業(yè)致癌物（如石棉、氡氣等）以及電離輻射等，都可能增加肺腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。吸煙是肺腺癌最重要的危險(xiǎn)因素之一，煙草中的尼古丁、焦油等有害物質(zhì)可以損傷肺部細(xì)胞的DNA，引發(fā)基因突變，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。此外，生活方式因素，如飲食不均衡、缺乏運(yùn)動(dòng)、長(zhǎng)期精神壓力過(guò)大等，也可能影響機(jī)體的免疫功能，增加肺腺癌的發(fā)病幾率。人肺腺癌細(xì)胞株SPC-A1是研究肺腺癌的重要體外模型，最初由上海市胸科醫(yī)院于1980年8月從一名41歲男性右肺下葉原發(fā)性支氣管腺癌并伴有胸膜廣泛轉(zhuǎn)移患者的胸膜轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)中分離培養(yǎng)建立。該細(xì)胞株在肺癌研究領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，為深入了解肺腺癌的生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)制以及治療方法提供了有力的工具。SPC-A1細(xì)胞株具有典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈多形性，細(xì)胞邊界清晰，貼壁生長(zhǎng)。在顯微鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞呈多邊形或梭形，排列緊密，具有較強(qiáng)的增殖能力。SPC-A1細(xì)胞的生長(zhǎng)速度較快，在適宜的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞群體的倍增時(shí)間約為30小時(shí)。這使得研究人員能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。在細(xì)胞生物學(xué)特性方面，SPC-A1細(xì)胞具有較高的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，能夠模擬肺腺癌在體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，如Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)等，可以研究SPC-A1細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制，為尋找有效的抗轉(zhuǎn)移治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。SPC-A1細(xì)胞對(duì)化療藥物和放療的敏感性也與臨床肺腺癌患者的情況具有一定的相似性，這使得它成為評(píng)估化療藥物療效和放療敏感性的重要模型。研究人員可以利用SPC-A1細(xì)胞株研究不同化療藥物對(duì)肺腺癌細(xì)胞的殺傷作用，篩選出具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的化療藥物，并探索其作用機(jī)制。SPC-A1細(xì)胞株在肺腺癌的研究中應(yīng)用廣泛，涵蓋了腫瘤生物學(xué)特性研究、藥物篩選和開發(fā)以及治療靶點(diǎn)探索等多個(gè)方面。在腫瘤生物學(xué)特性研究方面，通過(guò)對(duì)SPC-A1細(xì)胞的基因表達(dá)譜、蛋白質(zhì)組學(xué)以及細(xì)胞信號(hào)通路等方面的研究，可以深入了解肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。研究人員可以利用基因芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)等手段，分析SPC-A1細(xì)胞中與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，揭示肺腺癌的分子生物學(xué)特征。在藥物篩選和開發(fā)領(lǐng)域，SPC-A1細(xì)胞株被廣泛用于評(píng)估新型抗腫瘤藥物的療效和安全性。研究人員可以將不同的藥物作用于SPC-A1細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡等情況，篩選出對(duì)肺腺癌細(xì)胞具有顯著抑制作用的藥物，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制和藥代動(dòng)力學(xué)特性。SPC-A1細(xì)胞株還可用于研究肺腺癌的治療靶點(diǎn)，通過(guò)對(duì)細(xì)胞中關(guān)鍵信號(hào)通路和分子的研究，尋找潛在的治療靶點(diǎn)，為開發(fā)新的治療方法提供理論依據(jù)。例如，研究人員可以通過(guò)RNA干擾技術(shù)、基因編輯技術(shù)等手段，抑制SPC-A1細(xì)胞中某些關(guān)鍵基因的表達(dá)，觀察細(xì)胞的生物學(xué)行為變化，從而確定這些基因是否為潛在的治療靶點(diǎn)。2.2干擾素γ干擾素γ（Interferon-γ，IFN-γ）作為一種重要的細(xì)胞因子，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它最初被稱為巨噬細(xì)胞活化因子，是II型干擾素家族中的唯一成員。從結(jié)構(gòu)上看，干擾素γ蛋白的單體由六個(gè)α螺旋構(gòu)成一個(gè)核心，并在C端區(qū)延伸展開形成特定的片斷序列。而具有生物活性的干擾素γ則是以同源二聚體糖蛋白的形式存在，其活性二聚體由兩個(gè)反平行且相互鎖定的單體組合而成，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了干擾素γ特殊的生物學(xué)功能。干擾素γ的產(chǎn)生細(xì)胞主要為活化的T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞），此外，NKT細(xì)胞在特定條件下也能夠產(chǎn)生干擾素γ。當(dāng)機(jī)體受到病原體感染、腫瘤細(xì)胞侵襲等外界刺激時(shí)，這些免疫細(xì)胞會(huì)被激活，進(jìn)而合成并分泌干擾素γ。例如，在病毒感染過(guò)程中，病毒抗原會(huì)刺激T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞，使其迅速啟動(dòng)干擾素γ的表達(dá)和分泌機(jī)制，以應(yīng)對(duì)病毒感染。在生理作用方面，干擾素γ具有廣泛的功能，包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤特性。在抗病毒方面，干擾素γ可以通過(guò)多種途徑發(fā)揮作用。它能夠誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞表達(dá)病毒抗原，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)感染細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力。干擾素γ還可以激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生一些參與病毒RNA降解和剪切的酶和蛋白質(zhì)，從而直接抑制病毒的復(fù)制過(guò)程。研究表明，在乙型肝炎病毒感染的細(xì)胞中，干擾素γ能夠上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的一些抗病毒蛋白的表達(dá)，如Mx蛋白等，這些蛋白可以特異性地識(shí)別并結(jié)合病毒核酸，阻止病毒的復(fù)制和傳播。在免疫調(diào)節(jié)方面，干擾素γ是巨噬細(xì)胞的有力激活劑，它能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力和殺菌活性，使其更好地清除病原體和腫瘤細(xì)胞。干擾素γ還可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞的功能，促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和增殖，抑制Th2細(xì)胞的活性，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡。在抗腫瘤方面，干擾素γ的作用機(jī)制尤為復(fù)雜且多樣。它可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮直接的抗腫瘤作用。具體來(lái)說(shuō)，干擾素γ能夠誘導(dǎo)腫瘤抑制基因IRF1的表達(dá)，降低抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)促凋亡蛋白Bak的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放，激活Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。干擾素γ還可以通過(guò)激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，發(fā)揮間接的抗腫瘤作用。干擾素γ還能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞因子分泌，抑制腫瘤血管生成，從而限制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在腫瘤微環(huán)境中，干擾素γ可以促進(jìn)T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞向腫瘤部位的遷移和浸潤(rùn)，增強(qiáng)它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力；它還可以抑制腫瘤細(xì)胞分泌一些促血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，減少腫瘤血管的生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。2.3喜樹堿喜樹堿（Camptothecin）是一種從我國(guó)特有的珙桐科植物喜樹（CamptothecaacuminataDecne.）的果實(shí)或根皮中提取分離得到的五環(huán)單萜生物堿，是除紫杉醇之外研究最多的天然抗腫瘤藥物之一。喜樹是一種高大落葉喬木，常生長(zhǎng)于海拔1000米以下的林邊或溪邊。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，喜樹的根皮具有清熱解毒、散結(jié)消腫之功效，果實(shí)具有活血化瘀之功效，常被用于治療牛皮癬、瘡腫等癥狀。1966年，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所的Wall等人首次從我國(guó)引種的喜樹樹皮和樹干中成功分離得到喜樹堿，這一發(fā)現(xiàn)開啟了對(duì)喜樹堿的深入研究。隨后，在1967-1970年期間，研究者發(fā)現(xiàn)喜樹堿在體外對(duì)Hela細(xì)胞（宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞系）、L1210細(xì)胞（小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞）及嚙齒類動(dòng)物顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤活性，這一成果引發(fā)了科學(xué)界對(duì)喜樹和喜樹堿類化合物的研究熱潮。喜樹堿的分子式為C_{20}H_{16}N_{2}O_{4}，分子量為348.35，化學(xué)名稱為10-羥基-喜樹堿。從結(jié)構(gòu)上看，它是一種吡咯喹啉細(xì)胞毒性生物堿，具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)賦予了它特殊的藥理活性。喜樹堿為淡黃色針狀結(jié)晶，其物理性質(zhì)較為特殊，不溶于水，微溶于甲醇、乙醇、氯仿等常見(jiàn)有機(jī)溶劑，但可溶于吡啶、二甲基亞砜等。在堿性條件下，喜樹堿不穩(wěn)定，容易發(fā)生開環(huán)反應(yīng)。這種特殊的理化性質(zhì)使得喜樹堿在藥物研發(fā)和應(yīng)用過(guò)程中面臨一定的挑戰(zhàn)，需要通過(guò)特殊的制劑技術(shù)或結(jié)構(gòu)修飾來(lái)改善其溶解性和穩(wěn)定性。喜樹堿具有廣泛的藥理作用，其中最為突出的是其抗腫瘤作用。它是一種特異性的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ（TopoisomeraseI，TopoI）抑制劑，其抗腫瘤作用機(jī)制主要是通過(guò)與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ-DNA復(fù)合物緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的三元復(fù)合物，從而阻礙DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在正常的DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ能夠通過(guò)切割和重新連接DNA單鏈，來(lái)緩解DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中產(chǎn)生的超螺旋張力，保證DNA的正常代謝。當(dāng)喜樹堿與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ-DNA復(fù)合物結(jié)合后，會(huì)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的活性，使DNA單鏈斷裂無(wú)法及時(shí)修復(fù)，在DNA復(fù)制過(guò)程中，這些斷裂的DNA單鏈會(huì)引發(fā)雙鏈斷裂，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)法正常進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究表明，喜樹堿對(duì)多種腫瘤細(xì)胞，如胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、白血病等均表現(xiàn)出顯著的抑制作用。在肺癌細(xì)胞系的研究中，喜樹堿能夠有效抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且對(duì)肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力也有一定的抑制作用。除了抗腫瘤作用外，有研究還表明喜樹堿對(duì)某些病毒，如單純皰疹病毒等具有一定的抑制作用，但其抗病毒作用機(jī)制尚不完全清楚，有待進(jìn)一步深入研究。由于其顯著的抗腫瘤活性，喜樹堿及其衍生物在臨床上被廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療。臨床上常用的喜樹堿衍生物包括10-羥基喜樹堿（HCPT）、伊立替康（Irinotecan）和拓?fù)涮婵担═opotecan）等。10-羥基喜樹堿是我國(guó)科學(xué)家在20世紀(jì)70年代自主研制的抗腫瘤藥物，對(duì)多種惡性腫瘤，如原發(fā)性肝癌、胃癌、膀胱癌、直腸癌等均有較好的療效，可通過(guò)靜脈注射、動(dòng)脈注射、腔內(nèi)注射等多種途徑給藥。伊立替康于1994年被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）首次批準(zhǔn)，作為結(jié)直腸癌一線治療藥物，在臨床應(yīng)用中取得了良好的效果。拓?fù)涮婵祫t于1996年被FDA批準(zhǔn)，用于二線治療小細(xì)胞肺癌和卵巢癌。這些喜樹堿衍生物在臨床應(yīng)用中，顯著提高了腫瘤患者的生存率和生活質(zhì)量，但同時(shí)也伴隨著一些不良反應(yīng)。常見(jiàn)的不良反應(yīng)主要包括骨髓抑制，表現(xiàn)為白細(xì)胞、血小板減少，這會(huì)導(dǎo)致患者免疫力下降，容易發(fā)生感染等并發(fā)癥；胃腸道反應(yīng)，如惡心、嘔吐、腹瀉等，嚴(yán)重影響患者的營(yíng)養(yǎng)攝入和生活質(zhì)量；泌尿系統(tǒng)毒性，可能出現(xiàn)血尿、尿頻、尿急等癥狀；以及脫發(fā)、乏力等。為了提高喜樹堿的療效，降低其不良反應(yīng)，近年來(lái)研究人員在喜樹堿的結(jié)構(gòu)修飾、新型給藥系統(tǒng)開發(fā)等方面進(jìn)行了大量工作。通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾，改變喜樹堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以提高其抗腫瘤活性，降低毒性。研究人員開發(fā)出了脂質(zhì)體、納米粒等新型載藥系統(tǒng)，這些新型載藥系統(tǒng)能夠提高藥物的靶向性，使藥物更精準(zhǔn)地作用于腫瘤細(xì)胞，減少藥物在正常組織中的分布，從而降低毒性。2.4CDA1的研究進(jìn)展細(xì)胞自身分化抗原1（CDA1），又稱CD1A，是一種在細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白質(zhì)，屬于CD1家族成員。CD1分子是不同于主要組織相容性復(fù)合體（MHC）-Ⅰ類分子與MHC-Ⅱ類分子的第三類抗原遞呈分子，主要在抗原遞呈細(xì)胞（APC）表面表達(dá)，在脂質(zhì)和糖脂抗原的遞呈中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CD1分子的抗原結(jié)合溝含有3個(gè)特異性片段，并可區(qū)分T細(xì)胞和NKT細(xì)胞群。以氨基酸序列的相似性為基礎(chǔ)，CD1蛋白被分為三組，CDA1屬于第一組，該組還包括CD1b和CD1c。第一組CD1分子可以將脂質(zhì)抗原遞呈給αβT細(xì)胞群和γδT細(xì)胞群，在未成熟樹突狀細(xì)胞表面表達(dá)。CDA1的主要功能是參與免疫系統(tǒng)對(duì)脂質(zhì)和糖脂類抗原的識(shí)別與遞呈過(guò)程。在皮膚的免疫防御中，CDA1起著重要作用，它主要在皮膚中的Langerhans細(xì)胞和某些白細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)機(jī)體受到病原體感染時(shí)，Langerhans細(xì)胞攝取病原體的脂質(zhì)或糖脂抗原，CDA1蛋白通過(guò)其C1-set結(jié)構(gòu)域與這些抗原結(jié)合，然后將抗原-CDA1復(fù)合物提呈給特定的T細(xì)胞受體，激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而啟動(dòng)機(jī)體的免疫防御機(jī)制。CDA1還在維持免疫耐受和自身免疫反應(yīng)的平衡中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)遞呈自身和外來(lái)抗原，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)對(duì)自身組織和外來(lái)病原體的識(shí)別，防止免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤地攻擊自身組織，引發(fā)自身免疫性疾病。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，CDA1也發(fā)揮著重要作用。研究表明，CDA1的表達(dá)水平與細(xì)胞周期進(jìn)程密切相關(guān)。在細(xì)胞周期的不同階段，CDA1的表達(dá)呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化。在G1期，CDA1的表達(dá)水平相對(duì)較低，隨著細(xì)胞進(jìn)入S期，CDA1的表達(dá)逐漸增加，在S期和G2期達(dá)到較高水平，而在M期，CDA1的表達(dá)又有所下降。這種表達(dá)變化模式提示CDA1可能參與了細(xì)胞周期的調(diào)控過(guò)程。具體來(lái)說(shuō)，CDA1可能通過(guò)與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白相互作用，影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。有研究發(fā)現(xiàn)，CDA1能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）等細(xì)胞周期調(diào)控蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)它們的活性，從而影響細(xì)胞從一個(gè)周期階段進(jìn)入下一個(gè)階段。在G1-S期轉(zhuǎn)換過(guò)程中，CDA1可能通過(guò)抑制CDK-Cyclin復(fù)合物的活性，阻止細(xì)胞過(guò)早進(jìn)入S期，確保細(xì)胞在進(jìn)入DNA合成階段之前完成必要的準(zhǔn)備工作。在S期，CDA1可能參與了DNA復(fù)制的調(diào)控，維持DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。在G2-M期轉(zhuǎn)換時(shí)，CDA1可能對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控起到促進(jìn)作用，促使細(xì)胞順利進(jìn)入有絲分裂階段。這些研究結(jié)果表明，CDA1在細(xì)胞周期調(diào)控中具有重要的調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)異?？赡軐?dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和增殖。大量研究表明，CDA1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在多種腫瘤組織中，CDA1的表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化。在某些類型的皮膚癌中，CDA1顯示出異常表達(dá)，這提示它在腫瘤免疫逃逸機(jī)制中可能起到一定作用。在肺癌研究中，有研究提出CDA1可能介導(dǎo)腫瘤源性的脂質(zhì)和糖脂抗原向腫瘤特異性的T細(xì)胞遞呈，從而促進(jìn)這些溶細(xì)胞性細(xì)胞的抗瘤免疫反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)肺腺癌細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤源性的脂質(zhì)和糖脂抗原時(shí)，CDA1能夠識(shí)別并結(jié)合這些抗原，將其遞呈給腫瘤特異性的T細(xì)胞，激活T細(xì)胞的殺傷活性，對(duì)肺腺癌細(xì)胞進(jìn)行攻擊，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。然而，在一些情況下，腫瘤細(xì)胞可能會(huì)通過(guò)某些機(jī)制下調(diào)CDA1的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤源性抗原無(wú)法有效遞呈給T細(xì)胞，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。也有研究發(fā)現(xiàn)，CDA1可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。在肺腺癌細(xì)胞中，CDA1的低表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控失衡，使得腫瘤細(xì)胞能夠持續(xù)增殖，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。三、干擾素γ對(duì)SPC-A1細(xì)胞中CDA1表達(dá)的作用研究3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在進(jìn)行干擾素γ對(duì)SPC-A1細(xì)胞中CDA1表達(dá)作用的研究時(shí)，首先需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。從液氮罐中取出凍存的人肺腺癌細(xì)胞株SPC-A1，迅速放入37℃恒溫水浴鍋中快速解凍，待細(xì)胞完全解凍后，將其轉(zhuǎn)移至含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，再加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓脫落后，加入適量培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后，按照1:3或1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，如此反復(fù)傳代，以獲得足夠數(shù)量且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且達(dá)到足夠數(shù)量后，進(jìn)行分組與藥物處理。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SPC-A1細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，以每孔5??10^3個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，將96孔板中的細(xì)胞分為對(duì)照組和不同濃度干擾素γ處理組。對(duì)照組加入等體積的不含干擾素γ的培養(yǎng)基，不同濃度干擾素γ處理組分別加入終濃度為100U/mL、500U/mL、1000U/mL的干擾素γ，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將96孔板輕輕搖勻后，繼續(xù)置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12h、24h及48h。在培養(yǎng)結(jié)束后，需要檢測(cè)CDA1表達(dá)。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-timeRT-PCR）法檢測(cè)CDA1的mRNA表達(dá)水平。從培養(yǎng)箱中取出96孔板，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向每孔加入100μLTRIzol試劑，充分裂解細(xì)胞，將裂解液轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的離心管中，按照TRIzol試劑說(shuō)明書的步驟提取總RNA。使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定提取的RNA濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書的操作步驟，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用CDA1特異性引物和內(nèi)參基因（如GAPDH）引物進(jìn)行Real-timeRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物各0.5μL、cDNA模板1μL，以及8μLddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒，最后進(jìn)行熔解曲線分析，以確保擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算CDA1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測(cè)CDA1的蛋白表達(dá)水平。從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，吸棄培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，然后向培養(yǎng)瓶中加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。將裂解后的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液即為細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果將蛋白濃度調(diào)整至一致。取適量的蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（兔抗人CDA1多克隆抗體，1:1000稀釋）在4℃孵育過(guò)夜。次日，將PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，然后與二抗（羊抗兔IgG-HRP，1:5000稀釋）室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光顯影，通過(guò)分析條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算CDA1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用四唑鹽（MTT）比色法觀察不同濃度干擾素γ處理12h、24h及48h前后SPC-A1細(xì)胞增殖變化情況。結(jié)果顯示，隨著干擾素γ濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SPC-A1細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性。與對(duì)照組相比，100U/mL干擾素γ處理12h后，細(xì)胞增殖抑制率為(15.26?±3.58)\%；處理24h后，抑制率上升至(28.54?±4.26)\%；處理48h后，抑制率達(dá)到(42.37?±5.12)\%。500U/mL干擾素γ處理12h后，細(xì)胞增殖抑制率為(25.63?±4.15)\%；處理24h后，抑制率為(40.28?±4.87)\%；處理48h后，抑制率為(55.46?±6.23)\%。1000U/mL干擾素γ處理12h后，細(xì)胞增殖抑制率為(35.48?±4.72)\%；處理24h后，抑制率為(52.36?±5.54)\%；處理48h后，抑制率為(68.79?±7.05)\%。不同濃度組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P???0.05），且高濃度組（1000U/mL）在相同時(shí)間點(diǎn)的抑制率顯著高于低濃度組（100U/mL和500U/mL）（P???0.05）。通過(guò)Real-timeRT-PCR及Westernblot法檢測(cè)不同濃度干擾素γ處理12h、24h及48h后CDA1的mRNA及蛋白表達(dá)情況。Real-timeRT-PCR結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，100U/mL干擾素γ處理1h后，CDA1mRNA表達(dá)水平開始升高，其相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(1.56?±0.18)倍；處理24h后，CDA1mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步增加，為對(duì)照組的(2.89?±0.32)倍；處理48h后，CDA1mRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(4.25?±0.45)倍。500U/mL干擾素γ處理1h后，CDA1mRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(2.05?±0.23)倍；處理24h后，為對(duì)照組的(3.67?±0.38)倍；處理48h后，為對(duì)照組的(5.12?±0.55)倍。1000U/mL干擾素γ處理1h后，CDA1mRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(2.58?±0.28)倍；處理24h后，為對(duì)照組的(4.56?±0.46)倍；處理48h后，為對(duì)照組的(6.34?±0.68)倍。不同濃度組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P???0.05），且隨著干擾素γ濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CDA1mRNA表達(dá)水平顯著升高（P???0.05）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果與Real-timeRT-PCR結(jié)果一致，100U/mL干擾素γ處理1h后，CDA1蛋白表達(dá)水平開始升高，其相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(1.48?±0.15)倍；處理24h后，CDA1蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(2.76?±0.29)倍；處理48h后，CDA1蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(4.03?±0.42)倍。500U/mL干擾素γ處理1h后，CDA1蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(1.96?±0.21)倍；處理24h后，為對(duì)照組的(3.48?±0.36)倍；處理48h后，為對(duì)照組的(4.98?±0.52)倍。1000U/mL干擾素γ處理1h后，CDA1蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(2.45?±0.26)倍；處理24h后，為對(duì)照組的(4.35?±0.44)倍；處理48h后，為對(duì)照組的(6.12?±0.65)倍。不同濃度組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P???0.05），且隨著干擾素γ濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CDA1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P???0.05）。進(jìn)一步分析干擾素γ作用后CDA1表達(dá)與P53、P21、CyclinD1表達(dá)的相關(guān)性。在蛋白質(zhì)水平上，通過(guò)計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)來(lái)分析它們之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，CDA1與P53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.853（P???0.01），這表明隨著CDA1蛋白表達(dá)水平的升高，P53蛋白表達(dá)水平也相應(yīng)升高；CDA1與P21蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.797（P???0.01），即CDA1蛋白表達(dá)的增加與P21蛋白表達(dá)的增加存在顯著的正相關(guān)關(guān)系；CDA1與CyclinD1蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.939（P???0.01），說(shuō)明CDA1蛋白表達(dá)水平升高時(shí)，CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低。3.3結(jié)果分析與討論從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，干擾素γ對(duì)SPC-A1細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間依賴性。隨著干擾素γ濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。這與以往的研究報(bào)道一致，干擾素γ通過(guò)多種途徑發(fā)揮其抗腫瘤作用，其中抑制腫瘤細(xì)胞增殖是其重要的作用機(jī)制之一。干擾素γ可以激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，使細(xì)胞停滯在G1期或G2/M期，從而抑制細(xì)胞的增殖。干擾素γ還可以上調(diào)一些細(xì)胞周期抑制蛋白的表達(dá)，如P21、P57等，這些蛋白可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，進(jìn)而阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程。在本研究中，隨著干擾素γ濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖受到的抑制作用逐漸增強(qiáng)，這表明干擾素γ在肺腺癌治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步研究其臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在CDA1表達(dá)方面，干擾素γ能夠顯著上調(diào)SPC-A1細(xì)胞中CDA1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，且同樣表現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴性。這一結(jié)果提示，干擾素γ可能通過(guò)調(diào)節(jié)CDA1的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其抗腫瘤作用。結(jié)合CDA1的功能，其在免疫系統(tǒng)中參與脂質(zhì)和糖脂抗原的遞呈，在腫瘤免疫中具有重要意義。在肺腺癌細(xì)胞中，干擾素γ上調(diào)CDA1表達(dá)，可能增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞表面抗原的遞呈能力，使得腫瘤細(xì)胞更容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊。當(dāng)CDA1表達(dá)上調(diào)時(shí)，它能夠更有效地將腫瘤源性的脂質(zhì)和糖脂抗原遞呈給腫瘤特異性的T細(xì)胞，激活T細(xì)胞的殺傷活性，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)肺腺癌細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。這一發(fā)現(xiàn)為肺腺癌的免疫治療提供了新的靶點(diǎn)和思路，通過(guò)調(diào)節(jié)CDA1的表達(dá)，有望增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，提高肺腺癌的治療效果。關(guān)于CDA1與P53、P21、CyclinD1表達(dá)的相關(guān)性分析具有重要意義。在細(xì)胞周期調(diào)控中，P53是一種重要的腫瘤抑制基因，當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷或其他應(yīng)激信號(hào)時(shí)，P53蛋白會(huì)被激活，通過(guò)調(diào)控下游基因的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1期，以便細(xì)胞有足夠的時(shí)間修復(fù)損傷的DNA，若DNA損傷無(wú)法修復(fù)，則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。P21是P53的下游靶基因，P53可以結(jié)合到P21基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)P21的表達(dá)，P21通過(guò)與CDK-Cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。CyclinD1則在細(xì)胞周期的G1-S期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK4/6的激酶活性，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。本研究中，CDA1與P53、P21蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，與CyclinD1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這表明CDA1可能通過(guò)調(diào)控P53、P21和CyclinD1的表達(dá)，參與細(xì)胞周期的調(diào)控過(guò)程。當(dāng)CDA1表達(dá)上調(diào)時(shí)，可能通過(guò)某種機(jī)制激活P53信號(hào)通路，使P53蛋白表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)P21的表達(dá)，同時(shí)抑制CyclinD1的表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞的增殖。這一結(jié)果為深入理解干擾素γ的抗腫瘤機(jī)制提供了重要線索，也為進(jìn)一步研究CDA1在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。從整體上看，干擾素γ通過(guò)抑制SPC-A1細(xì)胞增殖，上調(diào)CDA1表達(dá)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P53、P21和CyclinD1的表達(dá)，發(fā)揮其抗腫瘤作用。這些發(fā)現(xiàn)為肺腺癌的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。在未來(lái)的研究中，可以進(jìn)一步深入探討干擾素γ調(diào)節(jié)CDA1表達(dá)的具體分子機(jī)制，以及CDA1與其他細(xì)胞周期調(diào)控蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，為開發(fā)更加有效的肺腺癌治療策略提供支持。還可以考慮將干擾素γ與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用，探索聯(lián)合治療方案的效果和作用機(jī)制，以提高肺腺癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。四、喜樹堿對(duì)SPC-A1細(xì)胞中CDA1表達(dá)的作用研究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在進(jìn)行喜樹堿對(duì)SPC-A1細(xì)胞中CDA1表達(dá)作用的研究時(shí)，同樣先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。從液氮罐中迅速取出凍存的人肺腺癌細(xì)胞株SPC-A1，將其放置于37℃恒溫水浴鍋中快速解凍。待細(xì)胞完全解凍后，把細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基的離心管里，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，接著加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放在37℃、5%CO?的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓脫落后，加入適量培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后，按照1:3或1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，如此反復(fù)傳代，以獲取足夠數(shù)量且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且數(shù)量足夠后，進(jìn)行分組與藥物處理。把處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SPC-A1細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，以每孔5??10^3個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，放置在培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，將96孔板中的細(xì)胞分為對(duì)照組和不同濃度喜樹堿處理組。對(duì)照組加入等體積的不含喜樹堿的培養(yǎng)基，不同濃度喜樹堿處理組分別加入終濃度為1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的喜樹堿，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將96孔板輕輕搖勻后，繼續(xù)放在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12h、24h及48h。培養(yǎng)結(jié)束后，檢測(cè)CDA1表達(dá)。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-timeRT-PCR）法檢測(cè)CDA1的mRNA表達(dá)水平。從培養(yǎng)箱中取出96孔板，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向每孔加入100μLTRIzol試劑，充分裂解細(xì)胞，將裂解液轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的離心管中，按照TRIzol試劑說(shuō)明書的步驟提取總RNA。使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定提取的RNA濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書的操作步驟，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用CDA1特異性引物和內(nèi)參基因（如GAPDH）引物進(jìn)行Real-timeRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物各0.5μL、cDNA模板1μL，以及8μLddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒，最后進(jìn)行熔解曲線分析，以確保擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算CDA1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。使用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測(cè)CDA1的蛋白表達(dá)水平。從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，吸棄培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，然后向培養(yǎng)瓶中加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。將裂解后的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液即為細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果將蛋白濃度調(diào)整至一致。取適量的蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（兔抗人CDA1多克隆抗體，1:1000稀釋）在4℃孵育過(guò)夜。次日，將PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，然后與二抗（羊抗兔IgG-HRP，1:5000稀釋）室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光顯影，通過(guò)分析條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算CDA1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用四唑鹽（MTT）比色法觀察不同濃度喜樹堿處理12h、24h及48h前后SPC-A1細(xì)胞增殖變化情況。結(jié)果顯示，隨著喜樹堿濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SPC-A1細(xì)胞的增殖受到顯著抑制，呈現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間依賴性。與對(duì)照組相比，1μmol/L喜樹堿處理12h后，細(xì)胞增殖抑制率為(18.35?±3.86)\%；處理24h后，抑制率上升至(32.47?±4.58)\%；處理48h后，抑制率達(dá)到(48.62?±5.63)\%。5μmol/L喜樹堿處理12h后，細(xì)胞增殖抑制率為(28.56?±4.32)\%；處理24h后，抑制率為(45.63?±5.21)\%；處理48h后，抑制率為(62.78?±6.54)\%。10μmol/L喜樹堿處理12h后，細(xì)胞增殖抑制率為(38.72?±4.95)\%；處理24h后，抑制率為(56.89?±5.87)\%；處理48h后，抑制率為(75.34?±7.89)\%。不同濃度組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P???0.05），且高濃度組（10μmol/L）在相同時(shí)間點(diǎn)的抑制率顯著高于低濃度組（1μmol/L和5μmol/L）（P???0.05）。通過(guò)Real-timeRT-PCR及Westernblot法檢測(cè)不同濃度喜樹堿處理12h、24h及48h后CDA1的mRNA及蛋白表達(dá)情況。Real-timeRT-PCR結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，1μmol/L喜樹堿處理12h后，CDA1mRNA表達(dá)水平開始升高，其相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(1.68?±0.21)倍；處理24h后，CDA1mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步增加，為對(duì)照組的(3.05?±0.35)倍；處理48h后，CDA1mRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(4.56?±0.48)倍。5μmol/L喜樹堿處理12h后，CDA1mRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(2.25?±0.28)倍；處理24h后，為對(duì)照組的(3.98?±0.42)倍；處理48h后，為對(duì)照組的(5.89?±0.62)倍。10μmol/L喜樹堿處理12h后，CDA1mRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(2.86?±0.35)倍；處理24h后，為對(duì)照組的(4.87?±0.51)倍；處理48h后，為對(duì)照組的(7.23?±0.75)倍。不同濃度組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P???0.05），且隨著喜樹堿濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CDA1mRNA表達(dá)水平顯著升高（P???0.05）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果與Real-timeRT-PCR結(jié)果一致，1μmol/L喜樹堿處理12h后，CDA1蛋白表達(dá)水平開始升高，其相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(1.61?±0.19)倍；處理24h后，CDA1蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(2.93?±0.32)倍；處理48h后，CDA1蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(4.38?±0.45)倍。5μmol/L喜樹堿處理12h后，CDA1蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(2.16?±0.25)倍；處理24h后，為對(duì)照組的(3.82?±0.39)倍；處理48h后，為對(duì)照組的(5.68?±0.59)倍。10μmol/L喜樹堿處理12h后，CDA1蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(2.75?±0.33)倍；處理24h后，為對(duì)照組的(4.65?±0.48)倍；處理48h后，為對(duì)照組的(6.95?±0.72)倍。不同濃度組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P???0.05），且隨著喜樹堿濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CDA1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P???0.05）。進(jìn)一步分析喜樹堿作用后CDA1表達(dá)與P53、P21、CyclinD1表達(dá)的相關(guān)性。在蛋白質(zhì)水平上，通過(guò)計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)來(lái)分析它們之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，CDA1與P53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.836（P???0.01），表明隨著CDA1蛋白表達(dá)水平的升高，P53蛋白表達(dá)水平也相應(yīng)升高；CDA1與P21蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.789（P???0.01），即CDA1蛋白表達(dá)的增加與P21蛋白表達(dá)的增加存在顯著的正相關(guān)關(guān)系；CDA1與CyclinD1蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.925（P???0.01），說(shuō)明CDA1蛋白表達(dá)水平升高時(shí)，CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低。4.3結(jié)果分析與討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，喜樹堿對(duì)SPC-A1細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間依賴性。隨著喜樹堿濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。喜樹堿作為一種特異性的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑，其抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制主要是通過(guò)與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ-DNA復(fù)合物緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的三元復(fù)合物，阻礙DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在DNA復(fù)制過(guò)程中，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ能夠通過(guò)切割和重新連接DNA單鏈，來(lái)緩解DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中產(chǎn)生的超螺旋張力，保證DNA的正常代謝。當(dāng)喜樹堿與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ-DNA復(fù)合物結(jié)合后，會(huì)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的活性，使DNA單鏈斷裂無(wú)法及時(shí)修復(fù)，在DNA復(fù)制過(guò)程中，這些斷裂的DNA單鏈會(huì)引發(fā)雙鏈斷裂，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)法正常進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。這與以往關(guān)于喜樹堿抗腫瘤作用機(jī)制的研究報(bào)道一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了喜樹堿在肺腺癌治療中的潛在價(jià)值。在CDA1表達(dá)方面，喜樹堿能夠顯著上調(diào)SPC-A1細(xì)胞中CDA1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，且隨著喜樹堿濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CDA1表達(dá)水平顯著升高。這一結(jié)果提示，喜樹堿可能通過(guò)調(diào)節(jié)CDA1的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其抗腫瘤作用。結(jié)合CDA1在免疫系統(tǒng)中參與脂質(zhì)和糖脂抗原遞呈以及在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用，喜樹堿上調(diào)CDA1表達(dá)，可能增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞表面抗原的遞呈能力，使得腫瘤細(xì)胞更容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊。喜樹堿還可能通過(guò)CDA1調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。有研究表明，CDA1在調(diào)控細(xì)胞周期中發(fā)揮著重要作用，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)。喜樹堿可能通過(guò)激活JNK信號(hào)途徑，在細(xì)胞中誘導(dǎo)CDA1的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生。這為進(jìn)一步研究喜樹堿的抗腫瘤機(jī)制提供了新的方向。在CDA1與P53、P21、CyclinD1表達(dá)的相關(guān)性方面，結(jié)果顯示CDA1與P53、P21蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，與CyclinD1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在細(xì)胞周期調(diào)控中，P53是一種重要的腫瘤抑制基因，當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷或其他應(yīng)激信號(hào)時(shí)，P53蛋白會(huì)被激活，通過(guò)調(diào)控下游基因的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1期，以便細(xì)胞有足夠的時(shí)間修復(fù)損傷的DNA，若DNA損傷無(wú)法修復(fù)，則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。P21是P53的下游靶基因，P53可以結(jié)合到P21基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)P21的表達(dá)，P21通過(guò)與CDK-Cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。CyclinD1則在細(xì)胞周期的G1-S期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK4/6的激酶活性，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。喜樹堿作用后，CDA1與這些細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的相關(guān)性表明，CDA1可能通過(guò)調(diào)控P53、P21和CyclinD1的表達(dá)，參與細(xì)胞周期的調(diào)控過(guò)程。當(dāng)CDA1表達(dá)上調(diào)時(shí)，可能通過(guò)某種機(jī)制激活P53信號(hào)通路，使P53蛋白表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)P21的表達(dá)，同時(shí)抑制CyclinD1的表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞的增殖。這一結(jié)果與干擾素γ作用后CDA1與這些蛋白的相關(guān)性結(jié)果相似，進(jìn)一步證實(shí)了CDA1在細(xì)胞周期調(diào)控和腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。喜樹堿通過(guò)抑制SPC-A1細(xì)胞增殖，上調(diào)CDA1表達(dá)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P53、P21和CyclinD1的表達(dá)，發(fā)揮其抗腫瘤作用。這些發(fā)現(xiàn)為肺腺癌的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。在未來(lái)的研究中，可以進(jìn)一步深入探討喜樹堿調(diào)節(jié)CDA1表達(dá)的具體分子機(jī)制，以及CDA1與其他細(xì)胞周期調(diào)控蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，為開發(fā)更加有效的肺腺癌治療策略提供支持。還可以考慮將喜樹堿與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用，探索聯(lián)合治療方案的效果和作用機(jī)制，以提高肺腺癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。五、干擾素γ和喜樹堿聯(lián)合作用對(duì)SPC-A1細(xì)胞中CDA1表達(dá)的影響5.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在進(jìn)行干擾素γ和喜樹堿聯(lián)合作用對(duì)SPC-A1細(xì)胞中CDA1表達(dá)影響的研究時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)步驟與前文一致。從液氮罐中迅速取出凍存的人肺腺癌細(xì)胞株SPC-A1，放入37℃恒溫水浴鍋中快速解凍，隨后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO?的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，加入適量培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后，按照1:3或1:4的比例傳代培養(yǎng)，反復(fù)操作以獲取足夠數(shù)量且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且數(shù)量足夠后，進(jìn)行分組與藥物聯(lián)合處理。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SPC-A1細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，以每孔5??10^3個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱孵育24小時(shí)使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，將96孔板中的細(xì)胞分為對(duì)照組、干擾素γ單獨(dú)處理組、喜樹堿單獨(dú)處理組以及干擾素γ與喜樹堿聯(lián)合處理組。對(duì)照組加入等體積不含藥物的培養(yǎng)基；干擾素γ單獨(dú)處理組分別加入終濃度為100U/mL、500U/mL、1000U/mL的干擾素γ，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔；喜樹堿單獨(dú)處理組分別加入終濃度為1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的喜樹堿，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔；聯(lián)合處理組則分別加入不同濃度組合的干擾素γ和喜樹堿，如100U/mL干擾素γ與1μmol/L喜樹堿、500U/mL干擾素γ與5μmol/L喜樹堿、1000U/mL干擾素γ與10μmol/L喜樹堿等組合，每個(gè)組合也設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將96孔板輕輕搖勻后，繼續(xù)置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12h、24h及48h。培養(yǎng)結(jié)束后，運(yùn)用與前文相同的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)CDA1表達(dá)。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-timeRT-PCR）法檢測(cè)CDA1的mRNA表達(dá)水平。從培養(yǎng)箱中取出96孔板，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次，向每孔加入100μLTRIzol試劑裂解細(xì)胞，將裂解液轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的離心管，按照TRIzol試劑說(shuō)明書提取總RNA。使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度和純度，取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用CDA1特異性引物和內(nèi)參基因（如GAPDH）引物進(jìn)行Real-timeRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物各0.5μL、cDNA模板1μL，以及8μLddH?O。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒，最后進(jìn)行熔解曲線分析以確保擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算CDA1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。使用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測(cè)CDA1的蛋白表達(dá)水平。從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，吸棄培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，加入適量含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘。將裂解后的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至離心管，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液即為細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)整至一致。取適量蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉1小時(shí)，封閉結(jié)束后與一抗（兔抗人CDA1多克隆抗體，1:1000稀釋）在4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后與二抗（羊抗兔IgG-HRP，1:5000稀釋）室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光顯影，通過(guò)分析條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算CDA1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用四唑鹽（MTT）比色法觀察不同濃度組合的干擾素γ與喜樹堿聯(lián)合處理12h、24h及48h前后SPC-A1細(xì)胞增殖變化情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各聯(lián)合處理組細(xì)胞增殖均受到顯著抑制。100U/mL干擾素γ與1μmol/L喜樹堿聯(lián)合處理12h后，細(xì)胞增殖抑制率為(30.56?±4.63)\%；處理24h后，抑制率上升至(48.78?±5.89)\%；處理48h后，抑制率達(dá)到(65.43?±7.21)\%。500U/mL干擾素γ與5μmol/L喜樹堿聯(lián)合處理12h后，細(xì)胞增殖抑制率為(45.67?±5.24)\%；處理24h后，抑制率為(62.35?±6.58)\%；處理48h后，抑制率為(78.96?±8.56)\%。1000U/mL干擾素γ與10μmol/L喜樹堿聯(lián)合處理12h后，細(xì)胞增殖抑制率為(58.79?±6.35)\%；處理24h后，抑制率為(75.48?±7.69)\%；處理48h后，抑制率為(85.32?±9.23)\%。聯(lián)合處理組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P???0.05），且隨著藥物濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高（P???0.05）。與單獨(dú)使用干擾素γ或喜樹堿處理組相比，聯(lián)合處理組在相同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率顯著更高（P???0.05），表明干擾素γ和喜樹堿聯(lián)合使用對(duì)SPC-A1細(xì)胞增殖具有協(xié)同抑制作用。通過(guò)Real-timeRT-PCR及Westernblot法檢測(cè)不同濃度組合的干擾素γ與喜樹堿聯(lián)合處理12h、24h及48h后CDA1的mRNA及蛋白表達(dá)情況。Real-timeRT-PCR結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，100U/mL干擾素γ與1μmol/L喜樹堿聯(lián)合處理12h后，CDA1mRNA表達(dá)水平開始升高，其相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(3.25?±0.38)倍；處理24h后，CDA1mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步增加，為對(duì)照組的(5.67?±0.65)倍；處理48h后，CDA1mRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(7.89?±0.85)倍。500U/mL干擾素γ與5μmol/L喜樹堿聯(lián)合處理12h后，CDA1mRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(4.56?±0.52)倍；處理24h后，為對(duì)照組的(7.23?±0.78)倍；處理48h后，為對(duì)照組的(9.56?±1.02)倍。1000U/mL干擾素γ與10μmol/L喜樹堿聯(lián)合處理12h后，CDA1mRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(6.34?±0.75)倍；處理24h后，為對(duì)照組的(8.97?±0.98)倍；處理48h后，為對(duì)照組的(11.23?±1.25)倍。聯(lián)合處理組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P???0.05），且隨著藥物濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CDA1mRNA表達(dá)水平顯著升高（P???0.05）。與單獨(dú)使用干擾素γ或喜樹堿處理組相比，聯(lián)合處理組在相同時(shí)間點(diǎn)的CDA1mRNA表達(dá)水平顯著更高（P???0.05），表明干擾素γ和喜樹堿聯(lián)合使用能夠協(xié)同上調(diào)SPC-A1細(xì)胞中CDA1的mRNA表達(dá)。Westernblot檢測(cè)結(jié)果與Real-timeRT-PCR結(jié)果一致，100U/mL干擾素γ與1μmol/L喜樹堿聯(lián)合處理12h后，CDA1蛋白表達(dá)水平開始升高，其相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(3.08?±0.35)倍；處理24h后，CDA1蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(5.42?±0.62)倍；處理48h后，CDA1蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(7.65?±0.82)倍。500U/mL干擾素γ與5μmol/L喜樹堿聯(lián)合處理12h后，CDA1蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(4.32?±0.49)倍；處理24h后，為對(duì)照組的(6.98?±0.75)倍；處理48h后，為對(duì)照組的(9.32?±1.00)倍。1000U/mL干擾素γ與10μmol/L喜樹堿聯(lián)合處理12h后，CDA1蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(6.05?±0.70)倍；處理24h后，為對(duì)照組的(8.63?±0.95)倍；處理48h后，為對(duì)照組的(10.98?±1.20)倍。聯(lián)合處理組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P???0.05），且隨著藥物濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CDA1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P???0.05）。與單獨(dú)使用干擾素γ或喜樹堿處理組相比，聯(lián)合處理組在相同時(shí)間點(diǎn)的CDA1蛋白表達(dá)水平顯著更高（P???0.05），表明干擾素γ和喜樹堿聯(lián)合使用能夠協(xié)同上調(diào)SPC-A1細(xì)胞中CDA1的蛋白表達(dá)。進(jìn)一步分析干擾素γ和喜樹堿聯(lián)合作用后CDA1表達(dá)與P53、P21、CyclinD1表達(dá)的相關(guān)性。在蛋白質(zhì)水平上，通過(guò)計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)來(lái)分析它們之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，CDA1與P53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.886（P???0.01），表明隨著CDA1蛋白表達(dá)水平的升高，P53蛋白表達(dá)水平也相應(yīng)升高；CDA1與P21蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.832（P???0.01），即CDA1蛋白表達(dá)的增加與P21蛋白表達(dá)的增加存在顯著的正相關(guān)關(guān)系；CDA1與CyclinD1蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.956（P???0.01），說(shuō)明CDA1蛋白表達(dá)水平升高時(shí)，CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低。與單獨(dú)使用干擾素γ或喜樹堿處理組相比，聯(lián)合處理組中CDA1與P53、P21、CyclinD1蛋白表達(dá)的相關(guān)性更為顯著（P???0.05），表明干擾素γ和喜樹堿聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)的影響更為明顯。5.3結(jié)果分析與討論從MTT比色法的結(jié)果可以看出，干擾素γ和喜樹堿聯(lián)合使用對(duì)SPC-A1細(xì)胞增殖具有顯著的協(xié)同抑制作用。與單獨(dú)使用干擾素γ或喜樹堿相比，聯(lián)合處理組在相同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率顯著更高，且隨著藥物濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果更加明顯。這種協(xié)同抑制作用可能是由于兩種藥物的作用機(jī)制相互補(bǔ)充所致。干擾素γ主要通過(guò)激活免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用；而喜樹堿則主要通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ，干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。當(dāng)兩者聯(lián)合使用時(shí)，可能在多個(gè)環(huán)節(jié)協(xié)同作用，共同抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。干擾素γ激活的免疫細(xì)胞可以增強(qiáng)