2026屆新高考生物沖刺復(fù)習(xí)基因工程的基本工具和基本操作程序【課標(biāo)要求】

1.闡明重組DNA技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。3.活動：(1)DNA的粗提取與鑒定。(2)DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定。01考點(diǎn)一重組DNA技術(shù)的基本工具“分子手術(shù)刀”限制酶準(zhǔn)確切割DNA分子“分子縫合針”DNA連接酶“分子運(yùn)輸車”質(zhì)粒將DNA片段連接起來將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞1．基因工程的概念DNA分子轉(zhuǎn)基因遺傳特性生物類型基因重組（1）DNA的基本組成單位相同（都是四種脫氧核苷酸）（2）都遵循堿基互補(bǔ)配對原則（3）DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)（1）基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)與功能單位（2）遺傳信息傳遞都遵循中心法則（3）生物界幾乎共用一套遺傳密碼1.

為什么不同生物的DNA分子能拼接起來？2.

為什么一種生物的基因可以在另一種生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)？基因工程的理論基礎(chǔ)2．重組DNA技術(shù)的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶（簡稱限制酶）①主要來源：__________。②種類：分離的限制酶有______種。③特點(diǎn)(專一性)：識別雙鏈DNA分子的________________。使每一條鏈中特定部位的____________斷開。原核生物數(shù)千特定核苷酸序列磷酸二酯鍵①實(shí)例1——EcoRⅠ限制酶EcoRⅠ識別序列為5′-GAATTC-3′EcoRⅠ切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵黏性末端黏性末端②實(shí)例2——SmaⅠ限制酶SmaⅠ識別序列為5′-CCCGGG-3′SmaⅠ切割部位為CG之間的磷酸二酯鍵平末端EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’[易錯提醒]限制酶作用的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵，不是氫鍵；在切割含目的基因的DNA分子時，需用限制酶切割2次此DNA分子，產(chǎn)生4個末端。大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致?！就卣埂?/p>

限制酶所識別的序列的特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列。(2)DNA連接酶。磷酸二酯鍵大腸桿菌黏性末端和平末端黏性末端和平末端E.coliDNA連接酶連接平末端的DNA片段效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于T4DNA連接酶DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對象作用結(jié)果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵DNA連接酶與DNA聚合酶的比較名稱作用部位底物作用結(jié)果限制酶切割磷酸二酯鍵DNA將DNA切成兩個片段DNA連接酶形成磷酸二酯鍵DNA片段將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶形成磷酸二酯鍵脫氧核苷酸將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA（水解）酶破壞磷酸二酯鍵DNA將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶斷開氫鍵DNA將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈與DNA分子相關(guān)的幾種酶的比較b根據(jù)所學(xué)知識，完成以下填空：

①限制酶

②解旋酶

③DNA連接酶

④DNA聚合酶A.切斷a處的酶為_______

B.連接a處的酶為_______C.切斷b處的酶為_______①③④②a：磷酸二酯鍵b：氫鍵a氨芐青霉素抗性基因目的基因插入位點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)(3)載體環(huán)狀雙鏈DNA分子噬菌體、動植物病毒一個至多個自我復(fù)制受體DNA標(biāo)記[易錯提醒]與膜載體的區(qū)別：基因工程中的載體是DNA分子，能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi)，并利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制；膜載體是蛋白質(zhì)，與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。標(biāo)記基因限制酶切割位點(diǎn)在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。1．實(shí)踐中常用某些病毒載體作為基因工程工具，除具備普通質(zhì)粒載體的條件外，還應(yīng)具有的條件是____________________________________________________________(答出2點(diǎn)即可)。2．限制酶EcoRⅠ只能識別序列—GAATTC—，并只能在G與A之間切割。若在某目的基因的兩側(cè)各有1個EcoRⅠ的切點(diǎn)，請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。對靶細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)化效率、不能增殖、對細(xì)胞無害—G

AATTC…….......G

AATTC——CTTAA

G….......…CTTAAG—

目的基因1．限制酶的選擇原則(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)確定限制酶的種類。①應(yīng)選擇切割位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，以便將目的基因“切出”，如圖可選擇

。②不能選擇切割位點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，防止破壞目的基因，如圖不能選擇

。③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖可選擇用

兩種限制酶（但要確保質(zhì)粒上也有這兩種限制酶的切割位點(diǎn)，而且這兩種限制酶切割后不會完全破壞標(biāo)記基因）。PstⅠSmaⅠPstⅠ和EcoRⅠ保留標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)等(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類。(3)根據(jù)Ti質(zhì)粒的T-NA片段選擇限制酶，圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，丙Ti質(zhì)粒宜選?。ㄔO(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ）。2．標(biāo)記基因的作用可用于檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞。1．(2023·高考新課標(biāo)卷)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是(

)A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割，目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接C2．圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因(TetR)和氨芐青霉素抗性基因(AmpR)。請回答下列問題：平(2)用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個堿基為______________的脫氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在______________酶作用下，形成重組質(zhì)粒P3。胸腺嘧啶(T)DNA連接(3)為篩選出含有重組質(zhì)粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長情況見下表(“＋”代表生長，“－”代表不生長)。根據(jù)表中結(jié)果判斷，應(yīng)選擇的菌落是_____(填表中字母)類，另外兩類菌落質(zhì)粒導(dǎo)入情況分別是________________、____________________。平板類型菌落類型ABC無抗生素＋＋＋氨芐青霉素＋＋－四環(huán)素＋－－氨芐青霉素＋四環(huán)素＋－－B

A類菌落含有P0C類菌落未導(dǎo)入質(zhì)粒(4)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時應(yīng)選擇的一對引物是__________。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對引物，結(jié)果從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段，原因是_______________________。乙、丙目的基因反向連接3.（2023湖北卷，節(jié)選）構(gòu)建重組質(zhì)粒需要使用DNA連接酶。下列屬于DNA連接酶底物的是

。④4.(2025·廣東廣州模擬)下列有關(guān)基因工程中載體的說法，正確的是(

)A.在進(jìn)行基因工程操作中，被用作載體的質(zhì)粒都是天然質(zhì)粒B.所有的質(zhì)粒都可以作為基因工程中的載體C.質(zhì)粒是一種獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的鏈狀DNA分子D.作為載體的質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)有對重組DNA進(jìn)行鑒定和選擇的標(biāo)記基因D5.(2025·湖北襄陽四中聯(lián)考)大腸桿菌pUC118質(zhì)粒是基因工程中常用的一種載體，具有氨芐青霉素抗性基因，該質(zhì)粒中某限制酶的唯一切點(diǎn)位于lacZ基因中。在特定的選擇培養(yǎng)基中，若lacZ基因沒有被破壞，則大腸桿菌菌落呈藍(lán)色；若lacZ基因被破壞，則菌落呈白色。關(guān)于圖中操作的敘述正確的是(

)BA.試管1中應(yīng)加入限制酶和DNA連接酶B.試管2中將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，需用Ca2＋處理大腸桿菌C.能在氨芐青霉素培養(yǎng)基中存在的菌落均呈現(xiàn)白色D.試管3應(yīng)選擇藍(lán)色菌落內(nèi)的大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)02考點(diǎn)二基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取↓2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建↓3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞↓4.目的基因的檢測與鑒定（核心）DNA基因片段非基因片段編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)的合成非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子：RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點(diǎn)，開始轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)原核細(xì)胞基因終止子：終止轉(zhuǎn)錄非編碼區(qū)組成：編碼區(qū)上游與編碼區(qū)下游功能：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)啟動子：RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄起始的信號終止子：終止RNA的合成編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子：RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)真核細(xì)胞基因終止子：終止轉(zhuǎn)錄非編碼區(qū)組成：編碼區(qū)上游與編碼區(qū)下游功能：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)啟動子：RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄起始的信號終止子：終止RNA的合成12345外顯子內(nèi)含子外顯子：內(nèi)含子：能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子編碼區(qū)真核細(xì)胞基因終止子12345外顯子內(nèi)含子mRNA前體成熟mRNA轉(zhuǎn)錄加工

項(xiàng)目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子化學(xué)成分位置作用DNA片段mRNA上三個相鄰堿基目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出RNA決定轉(zhuǎn)錄的結(jié)束翻譯的起始信號決定翻譯過程的結(jié)束啟動子和終止子

vs起始密碼子和終止密碼子（1）目的基因

主要是

；也可以是

；例如與生物抗性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因等。（2）篩選合適的目的基因

從相關(guān)的

和

的基因中進(jìn)行篩選；例如Bt抗蟲蛋白基因的篩選等。（3）獲取目的基因的常用方法

人工合成目的基因、利用__________________目的基因、通過構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因。編碼蛋白質(zhì)的基因具有調(diào)控作用的因子1．目的基因的篩選與獲取已知結(jié)構(gòu)功能清晰逆轉(zhuǎn)錄法、化學(xué)合成法PCR獲取和擴(kuò)增(2)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因。DNA半保留復(fù)制引物脫氧核苷酸耐高溫溫度兩種引物耐高溫的DNA聚合酶指數(shù)形式瓊脂糖凝膠電泳引物與單鏈DNA的3’端結(jié)合高溫使DNA雙鏈間氫鍵斷裂子鏈延伸：5’→3’[易錯提醒]變性過程雙鏈DNA解聚為單鏈不需要解旋酶。在PCR過程中實(shí)際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量；引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸，作為新子鏈的合成起點(diǎn)，只能結(jié)合在母鏈的3′端，使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸；真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，故PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加Mg2＋。脫氧核苷三磷酸（dNTP），包括：dATP、dTTP、dGTP、dCTP既作為原料又提供能量思考1：PCR技術(shù)獲取目的基因時至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因？目的基因3次思考2：PCR技術(shù)循環(huán)n次需要加入多少個引物？2n+1-2第3次第2次第1次PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原則條件不同點(diǎn)解旋方式場所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞內(nèi)（主要在細(xì)胞核內(nèi)）耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子PCR技術(shù)與DNA復(fù)制過程比較1．用PCR擴(kuò)增下面的DNA片段：

5'-GACCTGTGGAAGC……

CATACGGGATTG-3'

3'-CTGGACACCTTCG…..…GTATGCCCTAAC-5'供選擇的引物有：

①5'-GACCTGTGGAAGC-3'

②5'-CATACGGGATTG-3'

③5'-GTATGCCCTAAC-3'

④5'-CAATCCCGTATG-3'

共四種，應(yīng)選擇（

）

A．①②

B．②③

C．③④

D．①④練習(xí)D2.(2025·湖南岳陽模擬)“X基因”是DNA分子上一個有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如圖1所示。下列敘述錯誤的是(

)A.第一輪復(fù)制得到2個DNA分子，即①②各一個B.第二輪復(fù)制得到4個DNA分子，即①②③④各一個C.第四輪復(fù)制得到16個DNA分子，其中有4個X基因D.經(jīng)五輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子Cn代后，完整的目的基因有2n－2n個2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心（1）

在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代（2）

基因表達(dá)載體的組成（載體≠表達(dá)載體）目的基因：能控制表達(dá)所需要的特殊性狀啟動子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。復(fù)制原點(diǎn)：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)終止子：位置：基因的下游功能：終止轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因：便于重組DNA分子的篩選和鑒定。1.目的基因2.啟動子3.終止子4.標(biāo)記基因5.復(fù)制原點(diǎn)目的基因相同[易錯提醒]若考慮兩兩相連，則DNA連接酶連接DNA片段會出現(xiàn)三種情況：1.目的基因與目的基因連接；2.目的基因與質(zhì)粒連接（正向連接、反向連接）；3.質(zhì)粒與質(zhì)粒的連接。載體自身環(huán)化片段間的連接目的基因自身環(huán)化質(zhì)粒自身環(huán)化目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接

反向連接目的基因11’22’122’1’22’1’1①質(zhì)粒、目的基因自身環(huán)化；

②質(zhì)粒與目的基因反向連接。單酶切法缺點(diǎn)如何防止目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化以及目的基因反向連接？abab雙酶切的優(yōu)點(diǎn):防止質(zhì)粒、目的基因自身環(huán)化防止質(zhì)粒與目的基因反向連接選擇兩種不同的限制酶同時對目的基因和質(zhì)粒切割，使基因兩端產(chǎn)生兩個不同的粘性末端雙酶切a酶：b酶：思考：若目的基因兩端無合適的限制酶切割位點(diǎn)怎么辦？5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'5'3'5'5'3'3'3'3'引物1引物2引入限制酶識別序列引入限制酶識別序列5'3'3'5'3'3'5'3'3'3'5'3'3'5'3'5'3'5'3'3'5'3'5'3'3'5'3'3'使用引物設(shè)計(jì)引入酶切位點(diǎn)，通過PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)突變。引物與單鏈DNA的3'端結(jié)合引入的限制酶識別序列在引物的5'端考向1

PCR及應(yīng)用1．PCR引物的3′端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵，5′端無嚴(yán)格限制，可用于添加限制酶切點(diǎn)等序列，dNTP(四種脫氧核苷三磷酸)是DNA合成的原料。下列相關(guān)說法錯誤的是(

)A．圖示環(huán)節(jié)所需的溫度比上一個環(huán)節(jié)的低B．dNTP作為擴(kuò)增的原料會依次連接到3′端C．TaqDNA聚合酶催化磷酸二酯鍵的形成D．經(jīng)過1個循環(huán)后，獲得的子代DNA的雙鏈中脫氧核苷酸數(shù)量相同D2．重疊延伸PCR是一種通過寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板，經(jīng)過多次PCR擴(kuò)增，獲得目的基因的方法。該技術(shù)在擴(kuò)增較長片段的DNA、不同來源的DNA片段拼接、基因的定點(diǎn)誘變等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，下圖表示利用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增某目的基因的過程。下列敘述錯誤的是(

)A．引物中G＋C的含量越高，引物與模板DNA結(jié)合的穩(wěn)定性越高B．在第一階段由于引物2和引物3發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，因此兩者置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中C．引物1、2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制后，共產(chǎn)生4種雙鏈DNA分子D．在引物1、2組成的反應(yīng)系統(tǒng)中，經(jīng)第一階段要形成圖示雙鏈DNA，至少要經(jīng)過2次復(fù)制C3.以下關(guān)于基因表達(dá)載體的構(gòu)建的說法正確的是(

)A.基因表達(dá)載體的構(gòu)建是在生物體的細(xì)胞內(nèi)完成的B.基因表達(dá)載體中只有啟動子才能驅(qū)動目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNAC.基因表達(dá)載體的組成應(yīng)包括啟動子、終止密碼子、目的基因、標(biāo)記基因等D.基因表達(dá)載體通常采用抗生素合成基因作為標(biāo)記基因B4.(2023·重慶卷，12)某小組通過PCR（假設(shè)引物長度為8個堿基，短于實(shí)際長度）獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進(jìn)行酶切（如圖），再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達(dá)載體。下列敘述錯誤的是(

)BA.實(shí)驗(yàn)所用引物，其中一個序列為5′－TGCGCAGT－3′B.步驟①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步驟①的酶對載體進(jìn)行酶切至少獲得了2個片段D.酶切片段和載體連接時可使用E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶5.pET-28b質(zhì)粒（圖3）中a區(qū)段表示的是

結(jié)構(gòu)，a區(qū)段的作用是

。構(gòu)建重組質(zhì)粒時最好選用限制酶

。將構(gòu)建重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL-21中后，培養(yǎng)在含有

的LB固體培養(yǎng)基上，以達(dá)到篩選的目的。限制酶識別序列NcoⅠC↓CATGGXhoⅠC↓TCGAGEcoRⅠG↓AATTCNcoⅠ和XhoⅠ啟動子RNA聚合酶識別和結(jié)合位點(diǎn)，啟動基因轉(zhuǎn)錄卡那霉素6．圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述錯誤的是(

)A．在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，可用PstⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNAB．在酶切過程中，不能將質(zhì)粒中的全部標(biāo)記基因破壞C．若只用PstⅠ處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段，無法避免自身環(huán)化和反向連接D．導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長D受體生物植物動物微生物導(dǎo)入方法受體細(xì)胞受精卵體細(xì)胞受精卵細(xì)胞/個體花粉管通道法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法顯微注射法Ca2+處理法（形成感受態(tài)細(xì)胞）3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞3．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(1)植物細(xì)胞。花粉管通道Ti質(zhì)粒T-DNA染色體DNA轉(zhuǎn)化是指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。[易錯提醒]農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法兩次拼接：第一次拼接是指將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指將插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是指將含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指將含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。Ca2+處理法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法第一次拼接第二次拼接第一次導(dǎo)入第二次導(dǎo)入(2)動物細(xì)胞：______________法，將目的基因注入動物的____________中。(3)原核生物：先用________處理大腸桿菌細(xì)胞，使之處于一種能吸收周圍環(huán)境中____________的生理狀態(tài)，然后再將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中。顯微注射受精卵Ca2＋DNA分子4．目的基因的檢測與鑒定染色體DNA目的基因mRNA抗原—抗體轉(zhuǎn)基因[易錯提醒]分子水平檢測是否插入了目的基因和是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA時，都遵循堿基互補(bǔ)配對原則；都使用基因探針，探針是放射性同位素或熒光標(biāo)記的含目的基因的單鏈DNA片段。轉(zhuǎn)基因生物提取DNAPCR操作是否擴(kuò)增出目的基因①PCR擴(kuò)增——基因是否插入染色體DNA（存在）電泳操作（1）分子水平檢測M：marker；

1：陽性質(zhì)粒；2：原始品系；3-9：轉(zhuǎn)Bt品系；轉(zhuǎn)Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果4．目的基因的檢測與鑒定①PCR擴(kuò)增——基因是否轉(zhuǎn)錄BtM3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010個PCR陽性棉花植株中，有四株Bt基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)基因生物提取mRNAPCR操作是否擴(kuò)增出目的基因電泳操作逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板PCR（1）分子水平檢測4．目的基因的檢測與鑒定②DNA分子雜交技術(shù)——基因是否插入染色體DNA（存在）或基因是否轉(zhuǎn)錄原因：帶標(biāo)記的基因探針，與目的基因DNA單鏈在一定條件互補(bǔ)配對，結(jié)合成雙鏈，從而出現(xiàn)雜交帶。（1）分子水平檢測4．目的基因的檢測與鑒定提取蛋白電泳分離③抗原—抗體雜交——檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)蘇云金芽孢桿菌注射小鼠體內(nèi)提取抗體標(biāo)記抗體抗原抗體雜交（1）分子水平檢測4．目的基因的檢測與鑒定提取Bt毒蛋白檢測水平檢測目的檢測方法分子水平目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)個體水平轉(zhuǎn)基因生物是否表現(xiàn)出相應(yīng)的特性

檢測目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性4.目的基因的檢測與鑒定PCR技術(shù)、DNA分子雜交技術(shù)PCR技術(shù)、RNA—DNA分子雜交技術(shù)抗原—抗體雜交技術(shù)如抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)2．以mRNA為材料可以獲得DNA，其原理是________________________________________________________________________________。3．從受體細(xì)胞中分離純化出目的蛋白，該蛋白作為抗原注入機(jī)體后，刺激機(jī)體產(chǎn)生的可與此蛋白結(jié)合的相應(yīng)分泌蛋白是________，該分泌蛋白可用于檢測受試者血清中的HIV，檢測的原理是___________________________。4．為確定轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草是否培育成功，既要用______________檢測目的基因是否已插入，又要在個體水平上鑒定，后者的具體過程是______________________________________________________________________________。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補(bǔ)配對的原則可以合成DNA抗體抗原、抗體特異性結(jié)合PCR技術(shù)將培育的煙草幼苗栽培于含有一定鹽的土壤中，觀察該煙草植株的生長狀態(tài)[模型命題點(diǎn)思考]5．據(jù)圖回答下列問題。(1)從圖中可以看出，目的基因是_____________________________，使用的載體是________，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法是__________________。(2)若進(jìn)行個體生物學(xué)水平的鑒定，則采用的方法是_______________________。用棉葉飼喂棉鈴蟲Bt抗蟲蛋白基因Ti質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2．篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如下圖，目的基因插入四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。(2)被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)菌。(3)篩選方法：將混合處理后的細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)菌，如下圖1、2、3、4、5菌落，再利用無菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如下圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如下圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取

菌落進(jìn)行培養(yǎng)。1、5被限制酶切割考向2基因工程的操作程序3．某質(zhì)粒上有Sal

Ⅰ、HindⅢ、BamHⅠ三種限制酶切割位點(diǎn)，同時還含有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素基因。利用此質(zhì)粒獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的過程如下圖所示。請回答下列問題：(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞，采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。其中用到的質(zhì)粒是________；該質(zhì)粒含有一段特殊的DNA片段，稱為________。該方法中農(nóng)桿菌的作用是_______________________________________________________________________________________________。Ti質(zhì)粒T-DNA感染煙草細(xì)胞，把目的基因插入煙草細(xì)胞的染色體DNA上(2)在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，和只用一種酶切割目的基因的兩端及質(zhì)粒相比，選用HindⅢ和Sal

Ⅰ兩種酶的好處是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)含有目的基因的農(nóng)桿菌可根據(jù)標(biāo)記基因進(jìn)行篩選。若農(nóng)桿菌在含有氨芐青霉素和四環(huán)素培養(yǎng)基上都可以生長繁殖，農(nóng)桿菌中是否已有目的基因？________(填“是”或“否”)。為什么？_________________________________________________________。防止目的基因自連和質(zhì)粒自連，以提高帶有目的基因的重組質(zhì)粒的合成效率，防止目的基因與質(zhì)粒反向連接否含有目的基因的質(zhì)粒中抗四環(huán)素基因被破壞(4)將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌進(jìn)行如下操作，篩選出符合要求的農(nóng)桿菌。先把轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌接種到A培養(yǎng)基中培養(yǎng)，長出菌落后，用無菌牙簽挑取A上的單個菌落，分別接種到B(含氨芐青霉素)和C(含四環(huán)素和氨芐青霉素)兩個培養(yǎng)基的相同位置上，一段時間后，菌落的生長狀況如下圖所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？請?jiān)趫D中相應(yīng)的位置上圈出來。答案：4．(2023·廣東選擇考)種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。研究者對野生型擬南芥(2n＝10)進(jìn)行誘變，篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測序，發(fā)現(xiàn)野生型DA1基因發(fā)生一個堿基G到A的替換，突變后的基因?yàn)殡[性基因，據(jù)此推測突變體的表型與其有關(guān)，開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)?；卮鹣铝袉栴}：(1)擬采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DA1基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由該突變造成，則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與__________植株的種子大小相近。(2)用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DA1基因，用限制性內(nèi)切核酸酶對PCR產(chǎn)物和________進(jìn)行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DA1基因可以正常表達(dá)，其上下游序列需具備______________________________________。野生型Ti質(zhì)粒啟動子和終止子(3)轉(zhuǎn)化后，T-DNA(其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時不發(fā)生交換)可在基因組單一位點(diǎn)插入，也可以同時插入多個位點(diǎn)。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下，選出單一位點(diǎn)插入的植株，并進(jìn)一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株(如下圖所示)，用于后續(xù)驗(yàn)證突變基因與表型的關(guān)系。①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T0代植株并自交，將T1代種子播種在選擇培養(yǎng)基上，能夠萌發(fā)并生長的陽性個體即表示其基因組中插入了____________________________________。②T1代陽性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，選擇陽性率約____%的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。DA1基因(和卡那霉素抗性基因)③將②中選出的T2代陽性植株__________(填“自交”“與野生型雜交”或“與突變體雜交”)所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，陽性率達(dá)到______%的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。自交10075為便于在后續(xù)研究中檢測該突變，研究者利用PCR擴(kuò)增野生型和突變型基因片段，再使用限制性內(nèi)切核酸酶X切割產(chǎn)物，通過核酸電泳即可進(jìn)行突變檢測，相關(guān)信息見下圖，在電泳圖中將酶切結(jié)果對應(yīng)位置的條帶涂黑。答案：如圖所示：03考點(diǎn)三DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1．DNA的粗提取與鑒定(1)實(shí)驗(yàn)原理。蛋白質(zhì)2mol/L二苯胺藍(lán)(2)方法步驟(以洋蔥為例)。4℃離心預(yù)冷的酒精二苯胺藍(lán)色[易錯提醒]加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絲狀物。本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動物成熟的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動物成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核(無DNA)，可選用雞血細(xì)胞作為材料。2．DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(1)原理。①PCR原理：DNA的熱變性原理，即通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。變性

→

復(fù)性

→

延伸②電泳。帶電分子大小和構(gòu)象在相同電泳條件下，DNA分子量越小，電泳遷移速度越快。(2)方法步驟。①PCR擴(kuò)增。準(zhǔn)備→移液→混合→______→反應(yīng)。②鑒定PCR產(chǎn)物：瓊脂糖凝膠電泳法。配制瓊脂糖溶液→制備瓊脂糖凝膠→將電泳緩沖液加入電泳槽中→加樣→電泳→取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。離心[易錯提醒]為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理；在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，避免試劑的污染；離心的目的是使掛在管壁上的液體全部甩下?？枷?

DNA的粗提取與鑒定1．下列有關(guān)“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，正確的是(

)A．新鮮豬血、菜花等動植物材料均可用于DNA的粗提取B．DNA不溶于體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精而溶于2mol/L的NaCl溶液C．在研磨植物細(xì)胞時加入研磨液是為了溶解細(xì)胞壁D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺試劑后即呈藍(lán)色B2.（2024·安徽選擇考）下列關(guān)于“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯誤的是（

）A．實(shí)驗(yàn)中如果將研磨液更換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低B．利用DNA和蛋白質(zhì)在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNAC．DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物D．將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應(yīng)，可檢測溶液中是否含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)DC考向2

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定3．下列關(guān)于PCR操作過程的敘述，錯誤的是(

)A．PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理B．PCR利用了DNA的熱變性原理C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化D．在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換4．在基因工程操作過程中，科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶(R1和R2)處理基因載體，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如下圖所示。以下相關(guān)敘述中，錯誤的是(

)A．該載體最可能為鏈狀DNA分子B．兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點(diǎn)C．限制酶R1與R2的切點(diǎn)最短相距約200bpD．限制酶作用位點(diǎn)會導(dǎo)致磷酸二酯鍵斷裂A高考真題體驗(yàn)1．(2024·高考全國卷甲)某同學(xué)采用基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)蛋白E?；卮鹣铝袉栴}。(1)該同學(xué)利用PCR擴(kuò)增目的基因。PCR的每次循環(huán)包括變性、復(fù)性、延伸3個階段，其中DNA雙鏈打開成為單鏈的階段是__________，引物與模板DNA鏈堿基之間的化學(xué)鍵是______________________。(2)質(zhì)粒載體上有限制酶a、b、c的酶切位點(diǎn)，限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。構(gòu)建重組質(zhì)粒時，與用酶a單酶切相比，用酶a和酶b雙酶切的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在__________________________________________________________________(答出兩點(diǎn)即可)；使用酶c單酶切構(gòu)建重組質(zhì)粒時宜選用的連接酶是__________________。變性氫鍵避免目的基因或質(zhì)粒自身連接、防止目的基因與質(zhì)粒反向連接T4DNA連接酶(3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌前，通常先將受體細(xì)胞處理成感受態(tài)，感受態(tài)細(xì)胞的特點(diǎn)是_________________________________；