植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)操作手冊植物組織培養(yǎng)依托植物細(xì)胞全能性，通過無菌操作將離體器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)為完整植株，是遺傳轉(zhuǎn)化、種質(zhì)保存及種苗快繁的核心技術(shù)。本手冊圍繞實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、核心流程、問題解決展開，為科研與生產(chǎn)提供實(shí)用參考。一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段（一）儀器與設(shè)備準(zhǔn)備無菌操作類：超凈工作臺（提前30分鐘開紫外滅菌，使用前通風(fēng)15分鐘）、高壓蒸汽滅菌鍋（檢查水位與密封圈，確保壓力穩(wěn)定）、恒溫培養(yǎng)箱（校準(zhǔn)溫度，調(diào)控光照時長/強(qiáng)度）。輔助類：電子天平（精度0.001g）、pH計(jì)（校準(zhǔn)后測培養(yǎng)基酸堿度）、磁力攪拌器（溶解培養(yǎng)基）、解剖鏡（觀察外植體）、培養(yǎng)瓶/組培盒（提前滅菌備用）。（二）試劑與培養(yǎng)基制備1.基礎(chǔ)試劑消毒劑：75%乙醇（外植體表面消毒）、2%次氯酸鈉（加1-2滴吐溫-80增強(qiáng)滲透性，現(xiàn)配）、無菌水（高壓/過濾滅菌）。培養(yǎng)基成分：MS培養(yǎng)基干粉（或自行配制母液）、蔗糖（碳源）、瓊脂（固化劑）、植物激素（如6-BA、NAA，需過濾滅菌）。2.MS培養(yǎng)基母液配制（以1L為例）大量元素：NH?NO?16.5g、KNO?19g、CaCl?·2H?O4.4g、MgSO?·7H?O3.7g、KH?PO?1.7g，溶解定容，4℃保存。微量元素：MnSO?·4H?O22.3mg、ZnSO?·7H?O8.6mg等，溶解定容，4℃保存。鐵鹽：FeSO?·7H?O2.78g、Na?-EDTA·2H?O3.73g，混合加熱溶解，定容后4℃避光保存。有機(jī)成分：肌醇10g、煙酸0.05g等，溶解定容，4℃保存。3.培養(yǎng)基配制流程1.取400mL蒸餾水（配500mL培養(yǎng)基），加熱至60-70℃，加7-10g/L瓊脂，攪拌至融化。2.依次加入MS母液（大量元素10mL、微量元素1mL等）、30g/L蔗糖，攪拌溶解。3.加激素（如增殖培養(yǎng)基加2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA），調(diào)pH至5.8。4.分裝至培養(yǎng)瓶（每瓶30-40mL），封口膜封瓶，標(biāo)記配方與日期。4.培養(yǎng)基滅菌高壓滅菌：121℃，15-20分鐘（含激素培養(yǎng)基不超過20分鐘）。過濾滅菌：不耐高溫激素（如GA?），培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50-55℃，超凈臺內(nèi)用0.22μm濾膜過濾后加入。二、外植體處理與接種（一）外植體選擇與預(yù)處理選取健壯、無病蟲害植株，剪取莖段、葉片等（如煙草用莖段，菊花用葉片）。流水沖洗30分鐘，吸干水分備用。（二）無菌消毒流程1.酒精處理：外植體入75%乙醇浸泡30-60秒（嫩材料短，老材料長），無菌水沖1次。2.次氯酸鈉處理：轉(zhuǎn)入2%次氯酸鈉（加吐溫-80）浸泡5-15分鐘，期間晃動。3.無菌水沖洗：用無菌水沖3-5次，吸干水分，避免殘留消毒劑損傷材料。（三）接種操作工作臺消毒：超凈臺內(nèi)用75%乙醇擦臺面、工具，紫外線滅菌10分鐘。人員操作：戴無菌手套，乙醇消毒雙手，避免交談/大幅度動作。外植體切割與接種：無菌濾紙上，手術(shù)刀切外植體（莖段留1-2芽，葉片切0.5cm2塊），迅速接種至培養(yǎng)基（切口接觸/插入培養(yǎng)基）。接種密度：每瓶5-10個外植體，避免擁擠。三、培養(yǎng)與繼代管理（一）培養(yǎng)條件控制溫度：多數(shù)植物23-27℃（煙草25℃，蘭花22℃），晝夜溫差2-3℃。光照：2000-3000lux，12-16小時/天（暗培養(yǎng)用黑布遮光）。濕度：培養(yǎng)箱內(nèi)70%-80%，避免培養(yǎng)基失水/污染。（二）繼代培養(yǎng)組培苗長至3-5cm或叢生芽布滿瓶底時，超凈臺內(nèi)分苗（去除褐化/污染材料），接種至新鮮增殖培養(yǎng)基（激素配比可調(diào)整，如增殖過旺降細(xì)胞分裂素濃度）。（三）生根培養(yǎng)苗高2-3cm、莖稈健壯時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（如1/2MS+0.5mg/LNAA，蔗糖20g/L）。1-2周生根，3-4周根系發(fā)達(dá)后煉苗。四、煉苗與移栽（一）煉苗處理移栽前3-5天，打開培養(yǎng)瓶封口膜，溫室（20-25℃，60%-70%濕度）煉苗，適應(yīng)外界環(huán)境。（二）移栽基質(zhì)準(zhǔn)備基質(zhì)配方：蛭石:草炭:珍珠巖=1:1:1（多肉用蛭石:珍珠巖=2:1），基質(zhì)高壓滅菌/暴曬消毒。（三）移栽操作取出組培苗，洗凈根部培養(yǎng)基（避免傷根），移栽至基質(zhì)，澆透定根水（加50%MS營養(yǎng)液）。遮陰（70%遮光率）3-5天，保持基質(zhì)濕潤，后逐漸增光，1-2周后正常管理。五、常見問題與解決策略（一）污染問題真菌污染：培養(yǎng)基現(xiàn)白色/綠色菌絲，因外植體帶菌/環(huán)境滅菌差。解決：延長次氯酸鈉處理時間，定期換超凈臺濾膜，封瓶緊密。細(xì)菌污染：培養(yǎng)基現(xiàn)黏液狀菌落，因操作不規(guī)范/材料帶菌。解決：操作前嚴(yán)格消毒，換外植體來源，培養(yǎng)基加頭孢霉素（50-100mg/L）。（二）褐化問題外植體切口變褐、培養(yǎng)基加深，因酚類氧化。解決：消毒后泡0.1%維生素C，培養(yǎng)基加PVP（1-2g/L），縮短接種時間。（三）玻璃化問題組培苗莖稈透明、葉肉薄，因濕度大/激素失衡。解決：降細(xì)胞分裂素濃度，增瓊脂至10g/L，改善通風(fēng)，降培養(yǎng)濕度。六、實(shí)驗(yàn)記錄與優(yōu)化（一）詳細(xì)記錄記錄外植體來源、消毒時間、培養(yǎng)基配方、生長狀態(tài)（污染率、增殖系數(shù)等