一、試驗背景與目的直接抗人球蛋白試驗（DirectAntiglobulinTest，DAT）是檢測紅細胞膜表面結合的不完全抗體（如IgG）或補體成分（如C3d）的核心技術，廣泛應用于自身免疫性溶血性貧血、新生兒溶血病、藥物性溶血性貧血及輸血不良反應的診斷。本流程通過規(guī)范操作環(huán)節(jié)，確保試驗結果的準確性與可重復性，為臨床診療提供可靠依據(jù)。二、試驗原理紅細胞表面若結合有不完全抗體（如IgG類抗體，無法在鹽水介質(zhì)中直接凝集紅細胞）或補體片段（如C3d），常規(guī)鹽水凝集試驗呈陰性。抗人球蛋白試劑（Coombs試劑）含有的抗IgG或抗補體抗體，可與紅細胞表面的相應抗原特異性結合，通過“橋聯(lián)作用”使致敏紅細胞發(fā)生肉眼可見的凝集，從而判斷紅細胞是否被不完全抗體/補體致敏。三、試劑與器材（一）試劑1.抗人球蛋白血清：多特異性（含抗IgG、抗C3d等）或單特異性（如抗IgG、抗C3d），按說明書要求保存（通常2-8℃，避免反復凍融）。2.0.9%生理鹽水：新鮮配制，無細菌污染（建議24小時內(nèi)使用）。3.質(zhì)控紅細胞：陽性對照：含已知IgG致敏的紅細胞（用于驗證試劑活性）；陰性對照：未致敏的正常紅細胞（用于排除非特異性凝集）。（二）器材一次性試管（10×75mm）、微量移液器（10-100μL）；離心機（轉速≥1000×g，可調(diào)節(jié)時間）；光學顯微鏡、試管架、記號筆等。四、樣本要求1.采集：靜脈血，使用EDTA-K?抗凝管（避免肝素干擾，防止體外補體激活），采集后4小時內(nèi)處理；若需延遲，2-8℃保存不超過24小時（避免紅細胞形態(tài)改變）。2.質(zhì)量：樣本無明顯溶血、脂血或細菌污染；若患者近期輸血，需注明輸血史（避免供者紅細胞干擾）。五、操作步驟（一）紅細胞洗滌取抗凝全血2-3mL，加入等體積生理鹽水，輕輕顛倒混勻后，以1000×g離心3分鐘，棄上清（保留壓積紅細胞）。重復洗滌3次，末次洗滌后棄盡上清，制備約5%紅細胞懸液（或壓積紅細胞，依試劑要求）。（二）加樣與反應1.標記試管：取3支潔凈試管，分別標記“待檢”“陰性對照”“陽性對照”（若僅做基礎試驗，可省略陽性對照，但需定期驗證試劑）。2.加樣：待檢管：加洗滌后紅細胞懸液50μL+抗人球蛋白試劑50μL；陰性對照管：加紅細胞懸液50μL+生理鹽水50μL；陽性對照管：加陽性對照紅細胞50μL+抗人球蛋白試劑50μL。（三）離心與觀察將試管置于離心機，按試劑推薦參數(shù)（通常1000-1500×g離心15-30秒）離心后，立即取出試管，輕輕晃動（或用竹簽輕挑），觀察凝集情況：肉眼可見凝集：直接判讀；肉眼無凝集：轉移至載玻片，顯微鏡下觀察細微凝集（需排除假陰性）。六、結果判讀（一）陰性結果待檢管與陰性對照管均無凝集（顯微鏡下紅細胞散在，無典型凝集塊）；陽性對照管凝集明顯（試劑活性驗證合格）。（二）陽性結果待檢管出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，顯微鏡下紅細胞聚集呈網(wǎng)狀/塊狀?？筛鶕?jù)凝集強度分級（如+：細沙狀凝集；++：中等凝集塊；+++：粗大凝集塊，液體澄清），結合臨床進一步分析。（三）結果驗證若待檢管凝集、陰性對照管不凝集、陽性對照管凝集，結果可靠；若陰性對照管凝集，需重新洗滌紅細胞或更換試劑，排除非特異性干擾。七、質(zhì)量控制（一）試劑質(zhì)控每批試驗前，用陽性/陰性對照紅細胞驗證試劑：陽性對照應凝集，陰性對照應無凝集。若質(zhì)控失敗，禁止使用該試劑。（二）操作質(zhì)控紅細胞洗滌充分（至少3次），棄盡上清（避免血漿蛋白殘留導致假陽性）；離心參數(shù)嚴格按要求（避免離心不足/過度導致假陰/陽性）；加樣量準確（使用校準移液器）。（三）結果質(zhì)控結合患者臨床信息（如溶血癥狀、膽紅素水平）驗證結果合理性，必要時重復試驗或換用單特異性試劑（如抗IgG、抗C3d）分析。八、注意事項1.樣本處理：采集后盡快分離紅細胞，避免體外補體激活；洗滌用生理鹽水需新鮮、pH中性，防止紅細胞形態(tài)破壞。2.試劑使用：抗人球蛋白試劑需按說明書保存，使用前平衡至室溫，避免反復凍融。3.結果解釋：DAT陽性僅提示紅細胞致敏，需結合臨床（如貧血、黃疸）、間接抗人球蛋白試驗（IAT）等綜合判斷病因。4.安全防護：操作時戴手套、口罩，廢棄樣本按生物安全要求處理。九、