ICS62.020.30CCSB4354IDB54/T0579—2026 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4要求 5凍精制作 26檢查 27標識、貯存、運輸 5DB54/T0579—2026本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由西藏農(nóng)牧大學提出。本文件由西藏自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村標準化技術(shù)委員會歸口。本文件起草單位：西藏農(nóng)牧大學、河南農(nóng)業(yè)大學、華南農(nóng)業(yè)大學、中國農(nóng)業(yè)大學、西藏健陽生態(tài)農(nóng)業(yè)有限責任公司、西藏神鷹農(nóng)牧科技有限公司。本文件主要起草人：段夢琪、商鵬、強巴央宗、王克君、李文婷、張博、張浩、張輝、張紅亮、葉幼榮、常振宇、張健、韋明邦、李英、嚴飛飛、敬冬、徐二東。1藏豬冷凍精液僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。年~3年，保證無遺傳病史，體質(zhì)健康，無二類疫病中的任何一類。精液應(yīng)為乳白色或淡乳白色。精子活力≥70%,精子密度≥2億個/mL,精子畸形率≤10%。DB54/T0579—202624.5.1精子活力活力≥35%。4.5.2精子畸形率精子畸形率≤20%。5凍精制作藏豬冷凍精液的制作應(yīng)按照以下步驟進行。a）將采集的鮮精液先用精液質(zhì)量分析系統(tǒng)檢測原精密度、重量、活率等指標，對符合檢測要求的原精用豬凍精專用試劑在37℃等溫稀釋1倍，將稀釋后的鮮精于室溫（25℃)靜置1h，轉(zhuǎn)入17℃恒溫冰箱，平衡2h~3h。b）取新鮮雞蛋，去蛋清，將完整蛋黃置于滅菌無絨吸水紙上，將剩余蛋清吸凈，用注射器抽取蛋黃100mL，加入到配好的凍精專用基礎(chǔ)液中，充分混勻，形成Ⅰ液。c）待鮮精充分平衡后，搖勻，防止精子假死，17℃條件下800g~900g離心10min~15min，去掉上清。再用17℃的Ⅰ液重懸浮精子，使精子密度達到20億/mL，并置于盛有17℃水的燒杯中，于4℃冰箱或低溫操作柜中降溫平衡，使精液在2.5h~3h緩慢降溫至4℃~5℃,并平衡0.5h~1h。d）待4℃平衡后，加入配好的精液冷凍劑再稀釋1倍，混勻后立即在低溫操作柜中進行0.5mL細管灌裝操作，并在細管托架上碼好。e）灌裝完畢后，迅速將碼好的細管放入冷凍儀中，啟動冷凍程序，待程序跑完后取出細管裝入紗布袋中侵入液氮中長期保存。6檢查檢查分類、項目及判定主要分為常規(guī)檢查和抽樣檢查，常規(guī)檢查是對細管冷凍精液的出入庫的外觀等進行檢查。抽樣檢查是對細管解凍后精子活力、前進運動精子數(shù)、精子畸形率進行的隨機抽樣檢查，其中任何一項不達標準都判斷不合格。檢查方案、項目及方法6.2.1細管檢查用眼觀法直接觀測細管外觀。結(jié)果參照4.3所規(guī)定。6.2.2劑量檢查6.2.2.1主要材料離心管、剪刀、移液槍。6.2.2.2檢查方法3取三支細管冷凍精液，分別兩端剪開，加入離心管內(nèi)，用移液槍吸取冷凍精液，于精液分析系統(tǒng)顯微鏡下測定精子數(shù)。6.2.2.3計算方法精液劑量計算按式(1)計算：x-劑量值，單位mL;n?-第一支劑量，單位為mL;n?-第二支劑量，單位為mL;n?-第三支劑量，單位為mL。6.3精子活力、直線運動檢查6.3.1主要材料恒溫顯微鏡、恒溫水浴鍋、2mL離心管、載玻片(25.4mm×76.2mm)、蓋玻片(18mm×18mm)、移液槍。6.3.2檢查方法取三支細管冷凍精液，在38℃恒溫水浴鍋中解凍，用移液槍取解凍后精液1μL滴于載玻片并加上蓋玻片，立即置于38℃恒溫載物臺上用50倍鏡觀測活力，每個樣片選取三個視野進行觀測。6.3.3計算方法精液活力計算按式(2)計算：.....y-活力值，單位%;n?-第一支活力值，單位為%;n?-第二支活力值，單位為%;n?-第三支活力值，單位為%。6.4每劑量前進運動精子數(shù)檢查6.4.1主要材料血細胞計數(shù)板、吸管、小試管、計數(shù)器、顯微鏡或電視顯微裝置、精液稀釋液。6.4.2檢查方法用吸管準確吸取10μL解凍后精液，注入盛有0.99mL精液稀釋液的試管內(nèi)，混勻。將備好的血細胞計數(shù)板用蓋玻片將計數(shù)室蓋好，用吸管吸取10μL稀釋精液于蓋玻片邊緣，使精液自行流入計數(shù)室，均DB54/T0579—20264勻充滿，不應(yīng)有氣泡，然后在顯微鏡下觀察計數(shù)。每樣品觀察上下兩個計數(shù)室，取平均值，如兩個計數(shù)室計數(shù)結(jié)果誤差超過5%，則應(yīng)重檢。6.4.3每劑量前進運動精子數(shù)計算每劑量中精子數(shù)按式（3）計算：S=n×500×Q.....................................(3)式中：S—每劑量中精子數(shù)，單位為個；n—5個中方格精子數(shù)，單位為個；Q—細管劑量值,單位為ml。每劑量中前進運動精子數(shù)按式(4)計算：C=s×m........................................(4)式中：C—每劑量中前進運動精子數(shù)，單位為個；s—每劑量中精子數(shù)，單位為個；m—活力，單位為%。精子畸形率的檢查6.5.1主要材料顯微鏡、載玻片、移液槍、蒸餾水、姬姆薩染料、中性福爾馬林。6.5.2主要方法6.5.2.1精液準備精液解凍，同時檢查精液活力，選取合格冷凍精液進行后續(xù)處理6.5.2.2涂片取解凍后的精液滴于載玻片一端，用另一載玻片與有樣品的載玻片呈∠35°均勻的拖動，自然風干制作抹片，同一樣品制作3個。6.5.2.3固定在已風干的抹片上滴加1mL~2mL中性福爾馬林，固定15min后用清水緩緩沖洗，自然風干。6.5.2.4染色將固定好的抹片反扣在帶有平槽的玻璃面上，將姬姆薩染液滴于槽和抹片之間，染色1.5h后用清水沖去染液，晾干。6.5.2.5鏡檢將制作好的抹片在顯微鏡下觀察，每個抹片上觀察