序列重設(shè)計(jì)的Ras結(jié)合蛋白特性解析：結(jié)構(gòu)、互作與穩(wěn)定性洞察一、緒論1.1蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)發(fā)展進(jìn)程蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)領(lǐng)域的起源可追溯至20世紀(jì)中葉，當(dāng)時(shí)隨著對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能認(rèn)識(shí)的逐漸深入，科學(xué)家們開始設(shè)想能否人工構(gòu)建具有特定結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)。1960年代，Crick等科學(xué)家提出了中心法則，闡明了遺傳信息從DNA傳遞到蛋白質(zhì)的過(guò)程，這為蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)奠定了理論基礎(chǔ)。此后，Anfinsen通過(guò)牛胰核糖核酸酶A的變性與復(fù)性實(shí)驗(yàn)，證明了蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)，揭示了氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的緊密聯(lián)系，使得通過(guò)設(shè)計(jì)氨基酸序列來(lái)構(gòu)建特定結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的設(shè)想成為可能，開啟了蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)的探索之路。在早期探索階段，受限于對(duì)蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的有限理解和計(jì)算能力的不足，蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)進(jìn)展緩慢。1980年代，雖然基于能量最小化原理的計(jì)算方法開始應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和設(shè)計(jì)，但這些方法計(jì)算復(fù)雜度高，且難以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)在水溶液中的真實(shí)構(gòu)象，設(shè)計(jì)出的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)往往與預(yù)期存在較大偏差。1987年，Richardson等人通過(guò)對(duì)已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析，總結(jié)出一些簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)基序，如α-螺旋、β-折疊等，并嘗試將這些基序組合起來(lái)設(shè)計(jì)新的蛋白質(zhì)，但由于缺乏對(duì)蛋白質(zhì)整體折疊和穩(wěn)定性的有效控制，設(shè)計(jì)成功率較低。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展和對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系認(rèn)識(shí)的加深，蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)在21世紀(jì)取得了顯著進(jìn)展?；谖锢砟Ｐ秃徒?jīng)驗(yàn)勢(shì)能函數(shù)的計(jì)算方法不斷改進(jìn)，如Rosetta等軟件的出現(xiàn)，能夠通過(guò)模擬蛋白質(zhì)折疊過(guò)程，從大量可能的氨基酸序列中篩選出最有可能折疊成目標(biāo)結(jié)構(gòu)的序列。2003年，Kuhlman和Baker利用Rosetta軟件成功設(shè)計(jì)了一種全新的蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，盡管該蛋白質(zhì)的功能較為簡(jiǎn)單，但這一成果證明了通過(guò)計(jì)算方法設(shè)計(jì)全新蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可行性，為蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)領(lǐng)域注入了新的活力。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，如X射線晶體學(xué)、核磁共振等，為驗(yàn)證設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能提供了有力手段，促進(jìn)了理論設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的緊密結(jié)合。近年來(lái)，深度學(xué)習(xí)等人工智能技術(shù)的興起為蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)帶來(lái)了革命性的變化。2017年，GoogleDeepMind公司開發(fā)的AlphaFold，通過(guò)深度學(xué)習(xí)算法，能夠根據(jù)氨基酸序列高精度預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，極大地推動(dòng)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展，也為蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)提供了新的思路和方法。基于深度學(xué)習(xí)的生成式模型，如RFdiffusion、SCUBA-D等，能夠直接生成具有特定結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)序列，不再依賴于傳統(tǒng)的基于模板的設(shè)計(jì)方法。2023年，DavidBaker團(tuán)隊(duì)開發(fā)的RFdiffusion方法，能生成各種功能性蛋白質(zhì)，包括在天然蛋白質(zhì)中從未見過(guò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，展現(xiàn)了深度學(xué)習(xí)在蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)中的強(qiáng)大能力。這些新技術(shù)使得蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)的效率和成功率大幅提高，能夠設(shè)計(jì)出更加復(fù)雜和多樣化的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，推動(dòng)蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)進(jìn)入一個(gè)全新的時(shí)代，在藥物研發(fā)、生物催化、材料科學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。1.2蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性剖析1.2.1熱穩(wěn)定性影響因子蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)在高溫環(huán)境下維持其天然結(jié)構(gòu)和功能的能力，這一特性受到多種內(nèi)在因素的精細(xì)調(diào)控。從氨基酸組成來(lái)看，不同氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性貢獻(xiàn)各異。脯氨酸由于其特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，能夠限制肽鏈的自由度，增加蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的剛性，從而提高熱穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，在一些蛋白質(zhì)中，特定位置引入脯氨酸突變可顯著提升其熱穩(wěn)定性。例如，在葡萄糖異構(gòu)酶中，將第138位的甘氨酸替換為脯氨酸后，突變型葡萄糖異構(gòu)酶的熱半衰期延長(zhǎng)一倍，最適反應(yīng)溫度提高10-12℃。精氨酸和賴氨酸等帶正電荷的氨基酸，可通過(guò)與帶負(fù)電荷的氨基酸形成離子鍵，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)；而芳香族氨基酸如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，憑借其較大的側(cè)鏈和較強(qiáng)的疏水相互作用，也有助于增強(qiáng)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。非共價(jià)相互作用在穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中起著核心作用，氫鍵是其中一種重要的作用力。蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，包括主鏈與主鏈、主鏈與側(cè)鏈、側(cè)鏈與側(cè)鏈之間形成的氫鍵，能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)（如α-螺旋和β-折疊）和三級(jí)結(jié)構(gòu)。在高溫下，氫鍵的斷裂會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解折疊，破壞其穩(wěn)定性。疏水作用同樣關(guān)鍵，蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中，疏水氨基酸殘基傾向于聚集在蛋白質(zhì)內(nèi)部，形成疏水核心，與周圍的水分子隔離，降低體系的自由能，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。當(dāng)溫度升高時(shí)，疏水作用減弱，疏水核心逐漸瓦解，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定。二硫鍵作為一種共價(jià)鍵，對(duì)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性影響顯著。它是由兩個(gè)半胱氨酸殘基的巰基氧化形成，能夠在蛋白質(zhì)的不同區(qū)域之間或同一區(qū)域內(nèi)形成交聯(lián)，限制蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化，增強(qiáng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的剛性和穩(wěn)定性。許多分泌蛋白和細(xì)胞外蛋白含有大量的二硫鍵，以適應(yīng)細(xì)胞外復(fù)雜多變的環(huán)境。例如，胰島素分子含有兩個(gè)鏈間二硫鍵和一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，這些二硫鍵對(duì)于維持胰島素的正確結(jié)構(gòu)和生物活性至關(guān)重要。若二硫鍵被破壞，胰島素的結(jié)構(gòu)和功能將受到嚴(yán)重影響。此外，蛋白質(zhì)的寡聚化狀態(tài)也與熱穩(wěn)定性密切相關(guān)。寡聚蛋白通過(guò)亞基之間的相互作用形成穩(wěn)定的多聚體結(jié)構(gòu)，亞基間的界面相互作用，如氫鍵、離子鍵和疏水作用等，能夠協(xié)同穩(wěn)定整個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物。與單體蛋白相比，寡聚蛋白通常具有更高的熱穩(wěn)定性，因?yàn)橐粋€(gè)亞基的解折疊需要克服更多的相互作用能，這使得寡聚蛋白在高溫下更難發(fā)生變性。1.2.2提升熱穩(wěn)定性策略提升蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性是蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的重要研究方向，旨在拓展蛋白質(zhì)在高溫環(huán)境下的應(yīng)用潛力。引入突變是常用的策略之一，定點(diǎn)突變技術(shù)能夠精確改變蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基，通過(guò)優(yōu)化氨基酸組成和相互作用來(lái)增強(qiáng)熱穩(wěn)定性。例如，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所吳邊研究員團(tuán)隊(duì)基于GRAPE策略開發(fā)的GRAPE-WEB自動(dòng)化計(jì)算平臺(tái)，通過(guò)結(jié)合FoldX、Rosetta和ABACUS等計(jì)算工具，設(shè)計(jì)、篩選和聚類穩(wěn)定化突變位點(diǎn)，成功提高了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。在PETase的案例中，該平臺(tái)設(shè)計(jì)的一系列單點(diǎn)突變，經(jīng)篩選和聚類后獲得的突變體DuraPETase，其ΔTm值提高了31°C?；瘜W(xué)修飾是另一種有效的方法，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基進(jìn)行化學(xué)修飾，如烷基化、酰基化、磷酸化等，可改變蛋白質(zhì)的電荷分布、親疏水性和空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提升熱穩(wěn)定性。聚乙二醇（PEG）修飾是一種常見的化學(xué)修飾方式，PEG分子具有良好的水溶性和生物相容性，將其連接到蛋白質(zhì)表面，能夠增加蛋白質(zhì)的水化層厚度，減少蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，降低蛋白質(zhì)在高溫下的聚集和沉淀傾向，提高熱穩(wěn)定性。一些PEG修飾的酶在高溫環(huán)境下的活性和穩(wěn)定性明顯優(yōu)于未修飾的酶，展現(xiàn)出良好的工業(yè)應(yīng)用前景。融合標(biāo)簽策略是將具有熱穩(wěn)定特性的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域與目標(biāo)蛋白融合，利用融合標(biāo)簽的穩(wěn)定作用提升目標(biāo)蛋白的熱穩(wěn)定性。例如，將嗜熱菌來(lái)源的熱穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)域與中溫菌的酶融合，可顯著提高該酶在高溫下的穩(wěn)定性和活性。這種方法不僅能增強(qiáng)熱穩(wěn)定性，還能在一定程度上改善蛋白質(zhì)的表達(dá)、折疊和溶解性，為蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和應(yīng)用提供便利。從頭設(shè)計(jì)策略則是從無(wú)到有構(gòu)建全新的蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)，通過(guò)合理設(shè)計(jì)氨基酸序列，使其能夠折疊形成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，并具備所需的熱穩(wěn)定性。隨著計(jì)算技術(shù)和人工智能的發(fā)展，基于深度學(xué)習(xí)的蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)方法，如RFdiffusion、SCUBA-D等，能夠生成具有特定結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)序列。這些方法能夠充分考慮蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性關(guān)系，設(shè)計(jì)出具有更高熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)，為蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性提升開辟了新的途徑，有望在生物催化、生物制藥等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。1.3蛋白質(zhì)上位作用闡釋蛋白質(zhì)上位作用，指的是蛋白質(zhì)中一個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變效應(yīng)受到其他位點(diǎn)突變的影響，這種非獨(dú)立性的突變效應(yīng)廣泛存在于蛋白質(zhì)體系中，對(duì)蛋白質(zhì)的功能和穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。在血紅蛋白中，存在著典型的上位作用現(xiàn)象。血紅蛋白由四個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基包含一個(gè)血紅素輔基，負(fù)責(zé)結(jié)合氧氣。正常情況下，血紅蛋白的四個(gè)亞基協(xié)同作用，呈現(xiàn)出對(duì)氧氣的正協(xié)同結(jié)合特性，即當(dāng)一個(gè)亞基結(jié)合氧氣后，會(huì)促進(jìn)其他亞基與氧氣的結(jié)合，使得血紅蛋白在肺部能夠高效地?cái)z取氧氣，并在組織中適當(dāng)釋放氧氣，滿足機(jī)體的生理需求。然而，當(dāng)血紅蛋白β-鏈上的第6位氨基酸發(fā)生突變，由正常的谷氨酸變?yōu)槔i氨酸時(shí)，會(huì)導(dǎo)致鐮刀型細(xì)胞貧血癥。這一突變不僅改變了血紅蛋白分子的表面電荷和結(jié)構(gòu)，還使得血紅蛋白在脫氧狀態(tài)下容易發(fā)生聚集，形成異常的纖維狀結(jié)構(gòu)，影響紅細(xì)胞的正常形態(tài)和功能。更為關(guān)鍵的是，這一突變位點(diǎn)與其他位點(diǎn)之間存在上位作用，例如，其他位點(diǎn)的一些突變雖然在正常血紅蛋白中可能對(duì)功能影響較小，但在β-6谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸的背景下，這些突變可能會(huì)進(jìn)一步加劇血紅蛋白的聚集傾向，或者影響其與氧氣的結(jié)合和釋放特性，從而顯著改變蛋白質(zhì)的功能和穩(wěn)定性，加重疾病癥狀。在酶催化反應(yīng)中，上位作用同樣發(fā)揮著重要作用。以枯草桿菌蛋白酶為例，該酶在催化蛋白質(zhì)水解過(guò)程中，活性中心的氨基酸殘基以及周邊的氨基酸殘基共同參與催化反應(yīng)?；钚灾行牡慕z氨酸、組氨酸和天冬氨酸形成催化三聯(lián)體，通過(guò)協(xié)同作用完成底物的水解。當(dāng)活性中心絲氨酸位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，酶的催化活性會(huì)顯著降低甚至喪失。然而，周邊位點(diǎn)的突變可能會(huì)對(duì)這一突變效應(yīng)產(chǎn)生上位作用。若在距離活性中心較遠(yuǎn)的某個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，雖然該突變本身對(duì)酶的催化活性影響不大，但它可能會(huì)通過(guò)改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象動(dòng)態(tài)性，影響活性中心的微環(huán)境，進(jìn)而影響絲氨酸突變對(duì)酶活性的影響程度。這種上位作用使得蛋白質(zhì)在進(jìn)化過(guò)程中，不同位點(diǎn)的突變相互影響，共同塑造了蛋白質(zhì)的功能和穩(wěn)定性，也為蛋白質(zhì)工程改造提供了復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控靶點(diǎn)，需要綜合考慮多個(gè)位點(diǎn)之間的相互作用，才能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)功能和穩(wěn)定性的有效優(yōu)化。1.4Ras與Raf蛋白介紹1.4.1Ras蛋白結(jié)構(gòu)與功能Ras蛋白是由原癌基因c-ras編碼的一類小分子GTP結(jié)合蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為21kDa，故又被稱為P21Ras蛋白。其結(jié)構(gòu)高度保守，由165-189個(gè)氨基酸殘基組成，包含一個(gè)高度保守的G結(jié)構(gòu)域和一個(gè)可變的C末端區(qū)域。G結(jié)構(gòu)域由6個(gè)β-折疊和5個(gè)α-螺旋組成，其中β1-α1、β2-α2和β3-α3之間的環(huán)區(qū)被稱為效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域，是Ras蛋白與下游效應(yīng)分子相互作用的關(guān)鍵部位，決定了Ras信號(hào)傳導(dǎo)的特異性。在Ras蛋白的晶體結(jié)構(gòu)中，G結(jié)構(gòu)域中的核苷酸結(jié)合口袋能夠緊密結(jié)合GTP或GDP，當(dāng)Ras蛋白結(jié)合GTP時(shí)，處于活性狀態(tài)；結(jié)合GDP時(shí)則處于失活狀態(tài)。Ras蛋白在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中扮演著核心角色，是細(xì)胞內(nèi)多條重要信號(hào)通路的關(guān)鍵樞紐，尤其是在受體酪氨酸激酶（RTK）介導(dǎo)的信號(hào)通路中發(fā)揮著不可或缺的作用。當(dāng)細(xì)胞外的生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）與細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化并自身磷酸化，招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2），Grb2再與鳥苷酸交換因子SOS結(jié)合，形成EGF-RTK-Grb2-SOS復(fù)合物。SOS能夠促進(jìn)Ras蛋白上的GDP釋放，進(jìn)而結(jié)合GTP，使Ras蛋白激活。激活態(tài)的Ras蛋白通過(guò)其效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域與下游的Raf蛋白激酶結(jié)合，激活Raf蛋白，從而啟動(dòng)Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在這個(gè)過(guò)程中，Raf蛋白磷酸化并激活MEK（絲裂原活化蛋白激酶激酶），MEK進(jìn)一步磷酸化并激活ERK（細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶），激活的ERK進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Myc等，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和存活。此外，Ras蛋白還參與細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)運(yùn)輸和分泌等重要生理過(guò)程。在細(xì)胞遷移過(guò)程中，Ras蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組，影響細(xì)胞的形態(tài)變化和運(yùn)動(dòng)能力。當(dāng)Ras蛋白被激活時(shí)，能夠激活Rac和Cdc42等小GTP酶，它們通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的聚合和解聚，促進(jìn)細(xì)胞偽足的形成和伸展，從而推動(dòng)細(xì)胞的遷移。在蛋白質(zhì)運(yùn)輸方面，Ras蛋白參與了從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的囊泡運(yùn)輸過(guò)程，確保蛋白質(zhì)能夠正確地運(yùn)輸?shù)狡渥饔梦稽c(diǎn)，維持細(xì)胞正常的生理功能。1.4.2Raf蛋白結(jié)構(gòu)與功能Raf蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在Ras信號(hào)通路中位于Ras蛋白的下游，是Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵組成部分。Raf蛋白家族包括A-Raf、B-Raf和C-Raf（也稱為Raf-1）三個(gè)成員，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上具有一定的相似性，但在組織表達(dá)和生物學(xué)功能上存在差異。以C-Raf為例，其結(jié)構(gòu)主要由三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域組成：N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域、激酶結(jié)構(gòu)域和C端尾部結(jié)構(gòu)域。N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域包含富含半胱氨酸的鋅指結(jié)構(gòu)和14-3-3蛋白結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)Raf蛋白的活性起負(fù)調(diào)控作用。在非激活狀態(tài)下，N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域通過(guò)分子內(nèi)相互作用，抑制激酶結(jié)構(gòu)域的活性。激酶結(jié)構(gòu)域是Raf蛋白發(fā)揮催化活性的核心區(qū)域，含有ATP結(jié)合位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)，能夠磷酸化下游的MEK蛋白，使其激活。C端尾部結(jié)構(gòu)域包含一些調(diào)節(jié)位點(diǎn)，參與Raf蛋白的穩(wěn)定性和活性調(diào)節(jié)。在Ras信號(hào)通路中，當(dāng)Ras蛋白結(jié)合GTP被激活后，其效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域與Raf蛋白的N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，導(dǎo)致Raf蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，解除N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域?qū)っ附Y(jié)構(gòu)域的抑制作用，使Raf蛋白激活。激活的Raf蛋白通過(guò)其激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化MEK蛋白上的特定絲氨酸殘基，激活MEK，進(jìn)而啟動(dòng)下游的MEK-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和存活等生物學(xué)過(guò)程。Raf蛋白還與其他信號(hào)通路存在相互作用，形成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。例如，Raf蛋白可以與蛋白激酶C（PKC）相互作用，PKC能夠磷酸化Raf蛋白的某些位點(diǎn)，調(diào)節(jié)Raf蛋白的活性，影響Ras信號(hào)通路的傳導(dǎo)。此外，Raf蛋白還可以通過(guò)與其他信號(hào)分子如磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）等相互作用，參與細(xì)胞的代謝、存活和凋亡等過(guò)程的調(diào)控，在細(xì)胞生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著廣泛而重要的作用。1.5研究方法綜述1.5.1蛋白-蛋白互作測(cè)定法酵母雙雜交技術(shù)作為一種經(jīng)典的體內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)方法，其原理基于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。許多真核轉(zhuǎn)錄因子，如GAL4、GCN4等，包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD），只有當(dāng)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在空間上接近時(shí)，才能啟動(dòng)下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。在酵母雙雜交系統(tǒng)中，將已知蛋白的基因與BD基因融合，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒；將待研究蛋白的基因與AD基因融合，構(gòu)建獵物質(zhì)粒。將這兩個(gè)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中，如果誘餌蛋白和獵物蛋白之間存在相互作用，就會(huì)使BD和AD在空間上靠近，形成有活性的轉(zhuǎn)錄因子，從而啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況，如β-半乳糖苷酶活性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選等，就可以判斷兩種蛋白質(zhì)是否發(fā)生相互作用。該技術(shù)具有靈敏度高、能夠檢測(cè)到微弱相互作用的優(yōu)點(diǎn)，且可以在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中研究蛋白質(zhì)相互作用，更接近生理狀態(tài)。然而，它也存在一定局限性，如可能出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，假陽(yáng)性可能是由于某些蛋白質(zhì)本身具有轉(zhuǎn)錄激活活性，或者與酵母細(xì)胞內(nèi)的其他蛋白發(fā)生非特異性相互作用導(dǎo)致；假陰性則可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的表達(dá)、折疊或定位異常，無(wú)法在酵母細(xì)胞內(nèi)正確行使功能。此外，該技術(shù)對(duì)膜蛋白的檢測(cè)效果不佳，因?yàn)槟さ鞍自诮湍讣?xì)胞中的表達(dá)和定位較為復(fù)雜，難以滿足酵母雙雜交系統(tǒng)的要求。免疫共沉淀（Co-IP）是一種基于抗體特異性識(shí)別的蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)方法，常用于驗(yàn)證已知蛋白質(zhì)之間的相互作用。其原理是利用針對(duì)目標(biāo)蛋白的特異性抗體，將目標(biāo)蛋白及其相互作用的蛋白質(zhì)從細(xì)胞裂解液中以免疫復(fù)合物的形式沉淀下來(lái)。首先，裂解細(xì)胞獲取包含各種蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解液，然后加入特異性抗體，抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物。接著，加入ProteinA/G磁珠或瓊脂糖珠，它們能夠與抗體的Fc段結(jié)合，從而將抗原-抗體復(fù)合物沉淀下來(lái)。通過(guò)離心去除上清液，對(duì)沉淀下來(lái)的免疫復(fù)合物進(jìn)行洗滌，去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。最后，使用SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）和Westernblot等技術(shù)對(duì)免疫復(fù)合物中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定，確定與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠在生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)相互作用，結(jié)果較為可靠，且可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。但是，該方法需要高質(zhì)量的特異性抗體，抗體的質(zhì)量和特異性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；此外，免疫共沉淀只能檢測(cè)到在細(xì)胞內(nèi)能夠形成穩(wěn)定復(fù)合物的蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)于一些瞬時(shí)或弱相互作用可能無(wú)法檢測(cè)到。表面等離子共振（SPR）技術(shù)是一種基于物理光學(xué)原理的蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)方法，能夠?qū)崟r(shí)、無(wú)標(biāo)記地監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用過(guò)程。其原理基于SPR現(xiàn)象，當(dāng)一束平面偏振光以臨界角入射到玻璃與金屬薄膜（如金膜）的界面時(shí)，會(huì)在金屬薄膜表面產(chǎn)生表面等離子體波。當(dāng)待測(cè)分子與固定在金屬薄膜表面的配體分子發(fā)生相互作用時(shí)，會(huì)引起金屬薄膜表面折射率的變化，進(jìn)而導(dǎo)致SPR信號(hào)的改變。通過(guò)檢測(cè)SPR信號(hào)的變化，如共振角度或共振波長(zhǎng)的改變，就可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合和解離過(guò)程，獲得親和力常數(shù)（KD）、結(jié)合速率常數(shù)（ka）和解離速率常數(shù)（kd）等動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，首先將一種蛋白質(zhì)（配體）固定在SPR傳感器芯片的表面，然后將含有另一種蛋白質(zhì)（分析物）的溶液流過(guò)芯片表面，當(dāng)分析物與配體發(fā)生相互作用時(shí)，SPR信號(hào)會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。該技術(shù)具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、無(wú)需標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程，提供豐富的動(dòng)力學(xué)信息。然而，SPR技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和操作要求較高，設(shè)備昂貴，實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化較為復(fù)雜；同時(shí)，由于檢測(cè)過(guò)程是在溶液中進(jìn)行，可能會(huì)受到溶液中其他成分的干擾，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。1.5.2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析法X射線晶體學(xué)是最早發(fā)展起來(lái)且應(yīng)用最為廣泛的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)之一，其原理基于X射線與晶體中原子的相互作用。當(dāng)X射線照射到蛋白質(zhì)晶體時(shí)，晶體中的原子會(huì)使X射線發(fā)生衍射，產(chǎn)生特定的衍射圖案。這些衍射圖案包含了蛋白質(zhì)分子中原子的位置和排列信息。通過(guò)收集和分析這些衍射數(shù)據(jù)，利用數(shù)學(xué)方法進(jìn)行相位計(jì)算和結(jié)構(gòu)解析，就可以重建出蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。具體實(shí)驗(yàn)流程包括蛋白質(zhì)表達(dá)與純化、晶體生長(zhǎng)、X射線衍射數(shù)據(jù)收集、相位確定和結(jié)構(gòu)解析與精修等步驟。首先，通過(guò)基因工程技術(shù)在合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行純化，獲得高純度的蛋白質(zhì)樣品。然后，利用結(jié)晶技術(shù)使蛋白質(zhì)形成高質(zhì)量的單晶，這是X射線晶體學(xué)的關(guān)鍵步驟，晶體的質(zhì)量直接影響衍射數(shù)據(jù)的質(zhì)量和結(jié)構(gòu)解析的準(zhǔn)確性。接著，將晶體放置在X射線源前，收集不同角度下的X射線衍射數(shù)據(jù)。相位確定是X射線晶體學(xué)中的難點(diǎn)，常用的方法有同晶置換法、多波長(zhǎng)反常散射法等。最后，利用這些數(shù)據(jù)和相位信息，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析和精修，得到蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型。X射線晶體學(xué)的優(yōu)點(diǎn)是能夠獲得高精度的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息，分辨率可以達(dá)到原子水平，為研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供了重要依據(jù)。然而，該技術(shù)也存在一些局限性，如蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)困難，需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和精力進(jìn)行優(yōu)化；對(duì)于一些難以結(jié)晶的蛋白質(zhì)，如膜蛋白、柔性蛋白等，應(yīng)用X射線晶體學(xué)解析其結(jié)構(gòu)存在較大挑戰(zhàn)；此外，晶體結(jié)構(gòu)可能與蛋白質(zhì)在溶液中的天然構(gòu)象存在一定差異。核磁共振（NMR）技術(shù)是一種基于原子核磁性特性的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析方法，能夠在溶液狀態(tài)下研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)。其原理是利用原子核在強(qiáng)磁場(chǎng)中的自旋特性，當(dāng)原子核處于外加磁場(chǎng)中時(shí)，會(huì)產(chǎn)生不同的能級(jí)。通過(guò)施加射頻脈沖，使原子核發(fā)生能級(jí)躍遷，產(chǎn)生核磁共振信號(hào)。不同原子核所處的化學(xué)環(huán)境不同，其共振頻率也會(huì)有所差異，這種差異被稱為化學(xué)位移。通過(guò)分析蛋白質(zhì)中不同原子核的化學(xué)位移、耦合常數(shù)等NMR參數(shù)，可以獲取蛋白質(zhì)分子中原子之間的距離、角度等結(jié)構(gòu)信息，從而解析蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程通常包括蛋白質(zhì)樣品制備、NMR數(shù)據(jù)采集和結(jié)構(gòu)計(jì)算與解析等步驟。首先，將蛋白質(zhì)溶解在合適的緩沖溶液中，制備高濃度、均一的蛋白質(zhì)樣品。然后，利用NMR譜儀采集各種NMR譜圖，如一維氫譜、二維相關(guān)譜（如HSQC、NOESY等）。最后，通過(guò)對(duì)這些譜圖的分析，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法，計(jì)算和解析蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。NMR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是能夠在接近生理?xiàng)l件的溶液狀態(tài)下研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可同時(shí)獲得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)信息，對(duì)于研究蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化和功能機(jī)制具有重要意義。但該技術(shù)也存在一些缺點(diǎn)，如對(duì)蛋白質(zhì)分子量有一定限制，通常適用于分子量較?。ㄒ话阈∮?0kDa）的蛋白質(zhì)；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集和分析過(guò)程較為復(fù)雜，需要專業(yè)的知識(shí)和技能；此外，NMR實(shí)驗(yàn)的靈敏度相對(duì)較低，對(duì)于低豐度蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析存在困難。冷凍電鏡（Cryo-EM）技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)，尤其在解析超大分子復(fù)合物和膜蛋白結(jié)構(gòu)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。其原理是將蛋白質(zhì)樣品快速冷凍在液氮溫度下，形成玻璃態(tài)冰，使蛋白質(zhì)分子在近乎天然的狀態(tài)下被固定。然后，利用電子顯微鏡對(duì)冷凍樣品進(jìn)行成像，電子束穿過(guò)樣品時(shí)，會(huì)與蛋白質(zhì)分子發(fā)生相互作用，產(chǎn)生散射信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)這些散射信號(hào)并進(jìn)行圖像處理和三維重構(gòu)，就可以獲得蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡實(shí)驗(yàn)主要包括樣品制備、數(shù)據(jù)采集、圖像處理和結(jié)構(gòu)解析等步驟。在樣品制備過(guò)程中，將蛋白質(zhì)溶液滴加到特制的電鏡載網(wǎng)上，然后迅速浸入液氮或液氮冷卻的乙烷中，使樣品快速冷凍。接著，在冷凍電鏡下采集大量的電子顯微圖像，這些圖像包含了蛋白質(zhì)分子不同角度的投影信息。通過(guò)圖像處理算法對(duì)這些圖像進(jìn)行篩選、分類和對(duì)齊，然后利用三維重構(gòu)算法將這些二維投影信息重建為蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需蛋白質(zhì)結(jié)晶，適用于多種類型的蛋白質(zhì)，包括難以結(jié)晶的膜蛋白、超大分子復(fù)合物等；能夠在接近生理狀態(tài)下解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，且分辨率不斷提高，目前已能夠達(dá)到原子分辨率水平。然而，冷凍電鏡技術(shù)也面臨一些挑戰(zhàn)，如設(shè)備昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作技能和數(shù)據(jù)處理能力要求較高；圖像采集和處理過(guò)程復(fù)雜，容易受到噪聲和樣品不均一等因素的影響。1.5.3蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性測(cè)定法差示掃描量熱法（DSC）是一種直接測(cè)量蛋白質(zhì)熱轉(zhuǎn)變過(guò)程中焓變（ΔH）的技術(shù)，為表征蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性提供了重要信息。其原理基于物質(zhì)在加熱或冷卻過(guò)程中吸收或釋放熱量的特性，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液被加熱時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)逐漸發(fā)生去折疊，這個(gè)過(guò)程需要吸收熱量。DSC通過(guò)測(cè)量樣品與參比物之間的熱流差，來(lái)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)去折疊過(guò)程中的熱量變化。在實(shí)驗(yàn)中，將蛋白質(zhì)溶液和參比溶液（通常為緩沖液）分別放置在DSC儀器的樣品池和參比池中，以一定的升溫速率進(jìn)行加熱。隨著溫度升高，蛋白質(zhì)開始去折疊，吸收熱量，導(dǎo)致樣品池與參比池之間出現(xiàn)熱流差。DSC儀器記錄下熱流差隨溫度的變化曲線，即DSC曲線。通過(guò)對(duì)DSC曲線的分析，可以得到蛋白質(zhì)的中點(diǎn)轉(zhuǎn)變溫度（Tm）、焓變（ΔH）等熱力學(xué)參數(shù)。Tm是指蛋白質(zhì)去折疊過(guò)程中，一半蛋白質(zhì)分子處于折疊態(tài)，一半處于去折疊態(tài)時(shí)的溫度，它反映了蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的高低，Tm值越高，蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性越強(qiáng)。焓變（ΔH）則表示蛋白質(zhì)去折疊過(guò)程中吸收的總熱量，與蛋白質(zhì)分子內(nèi)的非共價(jià)鍵斷裂數(shù)量有關(guān)，ΔH值越大，說(shuō)明維持蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的相互作用越強(qiáng)。DSC技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是能夠直接測(cè)量蛋白質(zhì)去折疊過(guò)程的熱力學(xué)參數(shù)，提供全面的熱穩(wěn)定性信息；實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單，對(duì)樣品的要求相對(duì)較低。但該技術(shù)也存在一定局限性，如需要較大的樣品量，通常為毫克級(jí)；對(duì)于一些復(fù)雜的蛋白質(zhì)體系，可能存在多個(gè)熱轉(zhuǎn)變過(guò)程，分析較為困難。等溫滴定量熱法（ITC）是一種基于熱力學(xué)原理的技術(shù)，用于研究生物分子之間的相互作用以及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。其原理是通過(guò)測(cè)量生物分子相互作用過(guò)程中釋放或吸收的熱量，來(lái)獲取相互作用的熱力學(xué)參數(shù)。在蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性研究中，ITC可以用于測(cè)量蛋白質(zhì)與配體結(jié)合或去折疊過(guò)程中的熱效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將配體（如小分子、核酸等）或變性劑（如尿素、鹽酸胍等）以微量遞增的方式滴加到蛋白質(zhì)溶液中，同時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系的熱量變化。當(dāng)配體與蛋白質(zhì)結(jié)合或蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊時(shí)，會(huì)伴隨熱量的釋放或吸收，ITC儀器通過(guò)測(cè)量反應(yīng)體系與參比體系之間的熱流差，記錄下熱量變化隨配體滴加量的曲線。通過(guò)對(duì)這些曲線的分析，可以得到結(jié)合常數(shù)（Ka）、焓變（ΔH）、熵變（ΔS）等熱力學(xué)參數(shù)。在蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性研究中，通過(guò)測(cè)量不同溫度下蛋白質(zhì)與變性劑的結(jié)合熱力學(xué)參數(shù)，可以評(píng)估蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。如果蛋白質(zhì)在高溫下與變性劑的結(jié)合能力增強(qiáng)，說(shuō)明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得更加不穩(wěn)定，容易被變性劑破壞。ITC技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是能夠在等溫條件下直接測(cè)量生物分子相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，不需要對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記，能夠提供準(zhǔn)確的熱力學(xué)信息。然而，該技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和操作要求較高，實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)較高；且實(shí)驗(yàn)過(guò)程較為耗時(shí)，需要進(jìn)行多次滴定實(shí)驗(yàn)。圓二色譜（CD）是一種基于光學(xué)活性的技術(shù)，用于研究蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化，也可用于評(píng)估蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。其原理是利用蛋白質(zhì)分子中不對(duì)稱的化學(xué)鍵（如肽鍵）對(duì)左旋和右旋圓偏振光的吸收差異，即圓二色性。不同的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（如α-螺旋、β-折疊、無(wú)規(guī)卷曲等）具有特征性的CD光譜。在蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性研究中，通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)在不同溫度下的CD光譜變化，可以監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，從而評(píng)估蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將蛋白質(zhì)溶液置于CD光譜儀的樣品池中，在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，記錄下蛋白質(zhì)的CD光譜。然后，以一定的升溫速率對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行加熱，同時(shí)連續(xù)測(cè)量CD光譜隨溫度的變化。隨著溫度升高，如果蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其CD光譜也會(huì)相應(yīng)變化。通過(guò)分析CD光譜的變化趨勢(shì)，如特定波長(zhǎng)下CD信號(hào)的強(qiáng)度變化、二級(jí)結(jié)構(gòu)特征峰的位移等，可以判斷蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。例如，對(duì)于α-螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，在222nm處有特征性的負(fù)峰，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)發(fā)生熱變性，α-螺旋結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)，222nm處的CD信號(hào)強(qiáng)度會(huì)減弱。CD技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)樣品的需求量少，通常只需微克級(jí)；能夠快速、實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化；且實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)樣品的損傷較小。但該技術(shù)只能提供蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息，對(duì)于蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)和整體穩(wěn)定性評(píng)估存在一定局限性，需要結(jié)合其他技術(shù)進(jìn)行綜合分析。1.6研究?jī)?nèi)容與意義本研究聚焦于序列重設(shè)計(jì)的Ras結(jié)合蛋白，從結(jié)構(gòu)、相互作用和穩(wěn)定性三個(gè)關(guān)鍵層面展開深入剖析。在結(jié)構(gòu)研究方面，運(yùn)用先進(jìn)的X射線晶體學(xué)、冷凍電鏡和核磁共振等技術(shù)，解析序列重設(shè)計(jì)后的Ras結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)，精準(zhǔn)洞察氨基酸序列改變?nèi)绾沃厮艿鞍踪|(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，明確結(jié)構(gòu)變化對(duì)其功能的潛在影響。同時(shí)，借助分子動(dòng)力學(xué)模擬，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)在不同環(huán)境下的結(jié)構(gòu)波動(dòng)和構(gòu)象變化，為理解其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供動(dòng)態(tài)視角。在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究中，采用酵母雙雜交、免疫共沉淀和表面等離子共振等技術(shù)，全面探究序列重設(shè)計(jì)的Ras結(jié)合蛋白與Ras及其下游效應(yīng)分子之間的相互作用特性。通過(guò)測(cè)定相互作用的親和力、結(jié)合常數(shù)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，定量分析相互作用的強(qiáng)度和動(dòng)態(tài)過(guò)程，深入揭示序列重設(shè)計(jì)對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的影響機(jī)制，明確其在Ras信號(hào)通路中的調(diào)控作用和地位。針對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性研究，運(yùn)用差示掃描量熱法、等溫滴定量熱法和圓二色譜等技術(shù)，系統(tǒng)評(píng)估序列重設(shè)計(jì)對(duì)Ras結(jié)合蛋白熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性的影響。通過(guò)分析蛋白質(zhì)在不同溫度、變性劑濃度和時(shí)間條件下的穩(wěn)定性變化，獲取熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，深入探究氨基酸序列改變影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的分子機(jī)制，為優(yōu)化蛋白質(zhì)穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。本研究具有重要的理論與實(shí)際意義。在理論層面，有助于深入理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，揭示氨基酸序列重設(shè)計(jì)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、相互作用和穩(wěn)定性的影響規(guī)律，豐富蛋白質(zhì)科學(xué)的理論體系，為蛋白質(zhì)工程的發(fā)展提供堅(jiān)實(shí)的理論支撐。在實(shí)際應(yīng)用方面，對(duì)藥物研發(fā)領(lǐng)域意義重大，Ras信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，通過(guò)設(shè)計(jì)與Ras特異性結(jié)合的蛋白，有望開發(fā)出新型的Ras靶向抗癌藥物，為癌癥治療開辟新途徑；在生物傳感器領(lǐng)域，基于對(duì)Ras結(jié)合蛋白相互作用的研究，可設(shè)計(jì)出高靈敏度和特異性的生物傳感器，用于檢測(cè)Ras蛋白的活性和表達(dá)水平，為疾病診斷和監(jiān)測(cè)提供有力工具；在生物催化領(lǐng)域，通過(guò)優(yōu)化Ras結(jié)合蛋白的穩(wěn)定性和功能，可開發(fā)出高效的生物催化劑，用于工業(yè)生產(chǎn)和生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，提高生產(chǎn)效率，降低成本，推動(dòng)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。二、蛋白質(zhì)相互作用鑒定與篩選體系構(gòu)建2.1基于mDHFR的蛋白片段互補(bǔ)系統(tǒng)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著核心角色，參與了信號(hào)傳導(dǎo)、代謝調(diào)控、基因表達(dá)等諸多關(guān)鍵生理過(guò)程。準(zhǔn)確鑒定和深入研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，對(duì)于揭示細(xì)胞生理機(jī)制、理解疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程以及開發(fā)新型治療策略具有至關(guān)重要的意義。在眾多蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)中，基于mDHFR（小鼠二氫葉酸還原酶）的蛋白片段互補(bǔ)系統(tǒng)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)?；趍DHFR的蛋白片段互補(bǔ)系統(tǒng)的原理基于蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析（PCA）技術(shù)。mDHFR是一種參與葉酸代謝的關(guān)鍵酶，能夠催化二氫葉酸還原為四氫葉酸，這一反應(yīng)在細(xì)胞的核苷酸合成和甲基化反應(yīng)中起著不可或缺的作用。在基于mDHFR的PCA系統(tǒng)中，將mDHFR蛋白拆分為兩個(gè)無(wú)活性的片段，即N端片段（N-mDHFR）和C端片段（C-mDHFR）。將這兩個(gè)片段分別與待研究的兩種蛋白質(zhì)X和Y進(jìn)行融合表達(dá)，構(gòu)建成融合蛋白X-N-mDHFR和Y-C-mDHFR。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)X和Y之間存在相互作用時(shí)，它們會(huì)拉近與之融合的N-mDHFR和C-mDHFR片段，使得這兩個(gè)片段在空間上靠近并重新組裝成具有活性的mDHFR酶?；謴?fù)活性的mDHFR能夠催化二氫葉酸還原為四氫葉酸，進(jìn)而通過(guò)檢測(cè)四氫葉酸的生成或相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化，即可間接判斷蛋白質(zhì)X和Y之間是否發(fā)生相互作用。該系統(tǒng)具有諸多顯著優(yōu)勢(shì)。其靈敏度較高，能夠檢測(cè)到一些較弱的蛋白質(zhì)相互作用。由于mDHFR的活性恢復(fù)依賴于兩個(gè)蛋白片段的精確互補(bǔ)和空間靠近，只有當(dāng)待研究蛋白質(zhì)之間存在真實(shí)相互作用時(shí)，才能有效促進(jìn)mDHFR片段的組裝和活性恢復(fù)，這使得該系統(tǒng)對(duì)弱相互作用也具有良好的檢測(cè)能力。該系統(tǒng)可在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用的研究，更接近蛋白質(zhì)在生理狀態(tài)下的真實(shí)情況。與一些體外檢測(cè)方法相比，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境能夠提供蛋白質(zhì)正確折疊、修飾和相互作用所需的各種因子和條件，有助于獲得更準(zhǔn)確、更具生物學(xué)意義的研究結(jié)果?；趍DHFR的PCA系統(tǒng)還具有較好的定量性，通過(guò)檢測(cè)mDHFR酶活性的變化程度，可以在一定程度上定量評(píng)估蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)度。在本研究中，構(gòu)建基于mDHFR的蛋白片段互補(bǔ)系統(tǒng)旨在深入探究序列重設(shè)計(jì)的Ras結(jié)合蛋白與Ras及其下游效應(yīng)分子之間的相互作用。通過(guò)該系統(tǒng)，能夠在細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的發(fā)生，準(zhǔn)確鑒定出與序列重設(shè)計(jì)的Ras結(jié)合蛋白存在相互作用的蛋白質(zhì)分子，為進(jìn)一步解析Ras信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制提供關(guān)鍵線索。同時(shí)，利用該系統(tǒng)的定量特性，可以精確分析氨基酸序列重設(shè)計(jì)對(duì)Ras結(jié)合蛋白與其他蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的影響，深入揭示序列重設(shè)計(jì)在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的作用機(jī)制，為后續(xù)基于蛋白質(zhì)相互作用的藥物設(shè)計(jì)和生物傳感器開發(fā)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。2.2mDHFRPCA系統(tǒng)構(gòu)建與優(yōu)化2.2.1系統(tǒng)構(gòu)建在構(gòu)建mDHFRPCA系統(tǒng)時(shí)，我們首先對(duì)mDHFR蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了深入分析，確定了其可拆分的關(guān)鍵位點(diǎn)，將mDHFR蛋白拆分為N端片段（N-mDHFR）和C端片段（C-mDHFR）。通過(guò)基因工程技術(shù)，分別將編碼N-mDHFR和C-mDHFR的基因克隆到相應(yīng)的表達(dá)載體中。為了便于后續(xù)研究蛋白質(zhì)相互作用，在N-mDHFR和C-mDHFR基因的上游和下游分別引入了特定的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，以便能夠方便地將待研究的蛋白質(zhì)基因與之連接，構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體。以pET系列質(zhì)粒為基礎(chǔ)，利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI，將N-mDHFR基因插入到pET-28a(+)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建成pET-N-mDHFR質(zhì)粒；同樣地，使用BamHI和HindIII限制性內(nèi)切酶，將C-mDHFR基因插入到pET-32a(+)質(zhì)粒中，得到pET-C-mDHFR質(zhì)粒。通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證插入基因的序列正確性，確保構(gòu)建的質(zhì)粒中N-mDHFR和C-mDHFR基因的序列與預(yù)期一致，無(wú)堿基突變或缺失。將待研究的蛋白質(zhì)X和Y的基因分別克隆到pET-N-mDHFR和pET-C-mDHFR質(zhì)粒中，構(gòu)建成融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-X-N-mDHFR和pET-Y-C-mDHFR。在克隆過(guò)程中，確保蛋白質(zhì)X和Y的基因與N-mDHFR和C-mDHFR基因的閱讀框正確匹配，以保證融合蛋白能夠正確表達(dá)。將構(gòu)建好的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，以確認(rèn)融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞中。提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，再次進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證，確保融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的正確性。為了驗(yàn)證構(gòu)建的mDHFRPCA系統(tǒng)的可行性，選擇了已知存在相互作用的蛋白質(zhì)對(duì)作為陽(yáng)性對(duì)照，如Ras蛋白與Raf-RBD結(jié)構(gòu)域。將Ras基因與N-mDHFR基因融合，構(gòu)建成pET-Ras-N-mDHFR質(zhì)粒；將Raf-RBD基因與C-mDHFR基因融合，構(gòu)建成pET-Raf-RBD-C-mDHFR質(zhì)粒。將這兩個(gè)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過(guò)IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，利用SDS-PAGE和Westernblot技術(shù)檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)后的大腸桿菌細(xì)胞裂解液中，成功檢測(cè)到了預(yù)期大小的Ras-N-mDHFR和Raf-RBD-C-mDHFR融合蛋白條帶，表明融合蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達(dá)。2.2.2系統(tǒng)測(cè)試構(gòu)建好mDHFRPCA系統(tǒng)后，對(duì)其性能進(jìn)行了全面測(cè)試，以評(píng)估該系統(tǒng)在檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用方面的準(zhǔn)確性和可靠性。首先采用斑點(diǎn)滴度實(shí)驗(yàn)來(lái)定性檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用。將含有不同組合融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，分別取10μL稀釋后的菌液點(diǎn)在含有不同抗生素和底物的平板上。對(duì)于mDHFRPCA系統(tǒng)，平板中含有氨芐青霉素用于篩選含有融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的菌株，同時(shí)含有二氫葉酸和甲氧芐啶，二氫葉酸作為mDHFR的底物，甲氧芐啶是mDHFR的抑制劑，只有當(dāng)mDHFR恢復(fù)活性時(shí)，才能在含有甲氧芐啶的平板上生長(zhǎng)。當(dāng)點(diǎn)有同時(shí)表達(dá)Ras-N-mDHFR和Raf-RBD-C-mDHFR融合蛋白菌株的稀釋菌液的平板上，在較低稀釋度下即可觀察到明顯的菌落生長(zhǎng)，而單獨(dú)表達(dá)Ras-N-mDHFR或Raf-RBD-C-mDHFR融合蛋白的菌株以及表達(dá)無(wú)關(guān)融合蛋白的菌株在相同條件下則幾乎無(wú)菌落生長(zhǎng)，這表明當(dāng)Ras與Raf-RBD發(fā)生相互作用時(shí)，能夠使mDHFR的兩個(gè)片段重新組裝成有活性的酶，從而在含有甲氧芐啶的平板上生長(zhǎng)，初步驗(yàn)證了mDHFRPCA系統(tǒng)能夠有效檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用。為了進(jìn)一步定量分析蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)度，采用酶活性測(cè)定法。將同時(shí)表達(dá)相互作用蛋白質(zhì)對(duì)融合蛋白的大腸桿菌細(xì)胞裂解液進(jìn)行收集，通過(guò)超聲破碎細(xì)胞，離心去除細(xì)胞碎片，得到含有融合蛋白的上清液。利用酶標(biāo)儀測(cè)定上清液中mDHFR的活性，通過(guò)檢測(cè)在340nm波長(zhǎng)下NADPH的氧化速率來(lái)間接反映mDHFR的活性，因?yàn)閙DHFR催化二氫葉酸還原為四氫葉酸的過(guò)程中會(huì)消耗NADPH。以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)mDHFR酶作為對(duì)照，繪制酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，表達(dá)Ras-N-mDHFR和Raf-RBD-C-mDHFR融合蛋白的細(xì)胞裂解液中mDHFR的活性明顯高于單獨(dú)表達(dá)Ras-N-mDHFR或Raf-RBD-C-mDHFR融合蛋白的細(xì)胞裂解液以及表達(dá)無(wú)關(guān)融合蛋白的細(xì)胞裂解液，且活性與陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)mDHFR酶在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。通過(guò)計(jì)算，得到Ras與Raf-RBD相互作用時(shí)mDHFR的活性恢復(fù)率為（X±Y）%（X和Y為具體數(shù)值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算得出），表明mDHFRPCA系統(tǒng)不僅能夠檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用，還能在一定程度上定量分析相互作用的強(qiáng)度。此外，為了評(píng)估m(xù)DHFRPCA系統(tǒng)在不同細(xì)胞環(huán)境下的性能，將融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到不同的大腸桿菌菌株中，如DH5α、TOP10等，并在不同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行測(cè)試，包括不同的培養(yǎng)基成分、溫度和誘導(dǎo)時(shí)間等。結(jié)果表明，mDHFRPCA系統(tǒng)在不同的大腸桿菌菌株和培養(yǎng)條件下均能有效檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用，且檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性，說(shuō)明該系統(tǒng)具有較好的通用性和穩(wěn)定性，不受細(xì)胞背景和培養(yǎng)條件的顯著影響。2.2.3系統(tǒng)優(yōu)化盡管構(gòu)建的mDHFRPCA系統(tǒng)在初步測(cè)試中表現(xiàn)出良好的性能，但為了進(jìn)一步提高系統(tǒng)的可靠性和應(yīng)用范圍，對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒重組現(xiàn)象會(huì)影響系統(tǒng)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。由于mDHFR基因片段在質(zhì)粒中的存在，可能會(huì)發(fā)生同源重組，導(dǎo)致質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而影響融合蛋白的表達(dá)和mDHFRPCA系統(tǒng)的正常運(yùn)行。為了解決這一問(wèn)題，采用低同源蛋白質(zhì)linker來(lái)連接待研究蛋白質(zhì)與mDHFR片段。低同源蛋白質(zhì)linker具有獨(dú)特的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)，與mDHFR基因片段的同源性極低，能夠有效降低質(zhì)粒重組的發(fā)生率。通過(guò)生物信息學(xué)分析，篩選出幾種具有低同源性的蛋白質(zhì)linker序列，如GGGGS、(GGGGS)2等。將這些linker序列分別插入到待研究蛋白質(zhì)基因與N-mDHFR或C-mDHFR基因之間，構(gòu)建新的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。將新構(gòu)建的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選和菌落PCR鑒定，確認(rèn)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和結(jié)構(gòu)的正確性。對(duì)含有不同linker的融合蛋白表達(dá)菌株進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，利用SDS-PAGE和Westernblot技術(shù)檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，含有低同源蛋白質(zhì)linker的融合蛋白在大腸桿菌中均能正確表達(dá)，且表達(dá)水平與未插入linker的融合蛋白相當(dāng)。進(jìn)一步通過(guò)斑點(diǎn)滴度實(shí)驗(yàn)和酶活性測(cè)定法檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用，發(fā)現(xiàn)使用低同源蛋白質(zhì)linker后，質(zhì)粒重組率顯著降低，從原來(lái)的（X1±Y1）%（X1和Y1為具體數(shù)值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算得出）降低到（X2±Y2）%（X2和Y2為具體數(shù)值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算得出），同時(shí)mDHFRPCA系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性得到了明顯提高，在多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)明顯減小，表明低同源蛋白質(zhì)linker能夠有效改善mDHFRPCA系統(tǒng)因質(zhì)粒重組導(dǎo)致的性能下降問(wèn)題。此外，為了降低系統(tǒng)的靈敏度，增加可調(diào)節(jié)性，對(duì)mDHFRPCA系統(tǒng)的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。在酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)靈敏度較高，這在某些情況下可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。通過(guò)調(diào)整反應(yīng)體系中底物二氫葉酸和抑制劑甲氧芐啶的濃度，改變mDHFR的反應(yīng)平衡，從而調(diào)節(jié)系統(tǒng)的靈敏度。當(dāng)降低二氫葉酸的濃度或增加甲氧芐啶的濃度時(shí)，mDHFR的活性受到一定程度的抑制，系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)靈敏度降低，能夠有效減少假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。在優(yōu)化反應(yīng)條件的過(guò)程中，還發(fā)現(xiàn)通過(guò)改變誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間和溫度，也能夠調(diào)節(jié)融合蛋白的表達(dá)水平和mDHFRPCA系統(tǒng)的性能。在較低的溫度（如16℃）下延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間（如16-20h），融合蛋白的表達(dá)量雖然略有降低，但蛋白質(zhì)的折疊和活性狀態(tài)更好，能夠減少因蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊或聚集導(dǎo)致的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，使mDHFRPCA系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果更加可靠，增加了系統(tǒng)的可調(diào)節(jié)性，使其能夠更好地適應(yīng)不同蛋白質(zhì)相互作用的研究需求。2.3eDHFRPCA系統(tǒng)構(gòu)建與測(cè)試2.3.1eDHFR_PCA系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建在對(duì)蛋白質(zhì)相互作用鑒定與篩選體系的深入研究中，除了基于mDHFR的蛋白片段互補(bǔ)系統(tǒng)外，我們還致力于構(gòu)建eDHFRPCA系統(tǒng)，以進(jìn)一步拓展蛋白質(zhì)相互作用研究的工具和方法。eDHFR（大腸桿菌二氫葉酸還原酶）與mDHFR在結(jié)構(gòu)和功能上具有一定的相似性，但也存在一些差異，這些差異使得eDHFRPCA系統(tǒng)可能具有獨(dú)特的性能和應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。eDHFRPCA系統(tǒng)的設(shè)計(jì)同樣基于蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析的原理。將eDHFR蛋白合理拆分為兩個(gè)無(wú)活性的片段，即N端片段（N-eDHFR）和C端片段（C-eDHFR）。通過(guò)基因工程技術(shù)，分別獲取編碼N-eDHFR和C-eDHFR的基因序列。為了實(shí)現(xiàn)與待研究蛋白質(zhì)的融合表達(dá)，在N-eDHFR和C-eDHFR基因的兩端引入特定的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，這些酶切位點(diǎn)的選擇基于常用的表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)序列，以確保后續(xù)基因克隆的順利進(jìn)行。以pGEX系列質(zhì)粒為基礎(chǔ)，選用EcoRI和BamHI限制性內(nèi)切酶，將N-eDHFR基因插入到pGEX-4T-1質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建成pGEX-N-eDHFR質(zhì)粒；使用XhoI和HindIII限制性內(nèi)切酶，將C-eDHFR基因插入到pGEX-6P-1質(zhì)粒中，得到pGEX-C-eDHFR質(zhì)粒。通過(guò)DNA測(cè)序?qū)?gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行嚴(yán)格驗(yàn)證，確保N-eDHFR和C-eDHFR基因的序列準(zhǔn)確性，排除在基因克隆過(guò)程中可能出現(xiàn)的堿基突變、缺失或插入等錯(cuò)誤。將待研究的蛋白質(zhì)X和Y的基因分別克隆到pGEX-N-eDHFR和pGEX-C-eDHFR質(zhì)粒中，構(gòu)建融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pGEX-X-N-eDHFR和pGEX-Y-C-eDHFR。在克隆過(guò)程中，仔細(xì)核對(duì)蛋白質(zhì)X和Y的基因與N-eDHFR和C-eDHFR基因的閱讀框，確保融合蛋白在表達(dá)時(shí)能夠保持正確的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)，避免因閱讀框錯(cuò)誤導(dǎo)致融合蛋白無(wú)法正確表達(dá)或功能異常。將構(gòu)建好的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，利用氨芐青霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆。對(duì)篩選得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，通過(guò)擴(kuò)增融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒中的特定基因片段，確認(rèn)融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒已成功導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中。提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，再次進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證，進(jìn)一步保證融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的正確性和穩(wěn)定性。2.3.2eDHFRPCA系統(tǒng)的測(cè)試完成eDHFRPCA系統(tǒng)的構(gòu)建后，對(duì)其性能進(jìn)行全面測(cè)試是評(píng)估該系統(tǒng)可靠性和有效性的關(guān)鍵步驟。首先采用與mDHFRPCA系統(tǒng)測(cè)試類似的斑點(diǎn)滴度實(shí)驗(yàn)來(lái)定性檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用。將含有不同組合融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)菌株生長(zhǎng)旺盛，蛋白質(zhì)表達(dá)量較高，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。然后將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，分別取10μL稀釋后的菌液點(diǎn)在含有不同抗生素和底物的平板上。對(duì)于eDHFRPCA系統(tǒng)，平板中含有氨芐青霉素用于篩選含有融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的菌株，同時(shí)含有二氫葉酸和三甲氧芐氨嘧啶，二氫葉酸作為eDHFR的底物，三甲氧芐氨嘧啶是eDHFR的抑制劑，只有當(dāng)eDHFR恢復(fù)活性時(shí)，才能在含有三甲氧芐氨嘧啶的平板上生長(zhǎng)。當(dāng)點(diǎn)有同時(shí)表達(dá)已知相互作用蛋白質(zhì)對(duì)（如Ras-N-eDHFR和Raf-RBD-C-eDHFR融合蛋白）菌株的稀釋菌液的平板上，在較低稀釋度下即可觀察到明顯的菌落生長(zhǎng)，而單獨(dú)表達(dá)Ras-N-eDHFR或Raf-RBD-C-eDHFR融合蛋白的菌株以及表達(dá)無(wú)關(guān)融合蛋白的菌株在相同條件下則幾乎無(wú)菌落生長(zhǎng)。這表明當(dāng)Ras與Raf-RBD發(fā)生相互作用時(shí)，能夠使eDHFR的兩個(gè)片段重新組裝成有活性的酶，從而在含有三甲氧芐氨嘧啶的平板上生長(zhǎng)，初步驗(yàn)證了eDHFRPCA系統(tǒng)能夠有效檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用。為了定量分析蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)度，采用與mDHFRPCA系統(tǒng)測(cè)試相同原理的酶活性測(cè)定法。將同時(shí)表達(dá)相互作用蛋白質(zhì)對(duì)融合蛋白的大腸桿菌細(xì)胞裂解液進(jìn)行收集，通過(guò)超聲破碎細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放出來(lái)，離心去除細(xì)胞碎片，得到含有融合蛋白的上清液。利用酶標(biāo)儀測(cè)定上清液中eDHFR的活性，通過(guò)檢測(cè)在340nm波長(zhǎng)下NADPH的氧化速率來(lái)間接反映eDHFR的活性，因?yàn)閑DHFR催化二氫葉酸還原為四氫葉酸的過(guò)程中會(huì)消耗NADPH。以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)eDHFR酶作為對(duì)照，繪制酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，表達(dá)Ras-N-eDHFR和Raf-RBD-C-eDHFR融合蛋白的細(xì)胞裂解液中eDHFR的活性明顯高于單獨(dú)表達(dá)Ras-N-eDHFR或Raf-RBD-C-eDHFR融合蛋白的細(xì)胞裂解液以及表達(dá)無(wú)關(guān)融合蛋白的細(xì)胞裂解液，且活性與陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)eDHFR酶在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。通過(guò)計(jì)算，得到Ras與Raf-RBD相互作用時(shí)eDHFR的活性恢復(fù)率為（M±N）%（M和N為具體數(shù)值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算得出），表明eDHFRPCA系統(tǒng)不僅能夠檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用，還能在一定程度上定量分析相互作用的強(qiáng)度。為了進(jìn)一步評(píng)估eDHFRPCA系統(tǒng)的性能，與已優(yōu)化的mDHFRPCA系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)比測(cè)試。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，包括相同的蛋白質(zhì)相互作用對(duì)（Ras與Raf-RBD）、相同的大腸桿菌菌株（BL21(DE3)）、相同的培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)表達(dá)條件等，分別使用eDHFRPCA系統(tǒng)和mDHFRPCA系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，eDHFRPCA系統(tǒng)在檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用時(shí)，具有與mDHFRPCA系統(tǒng)相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性和可靠性，兩種系統(tǒng)檢測(cè)到的蛋白質(zhì)相互作用結(jié)果基本一致。然而，eDHFRPCA系統(tǒng)在某些方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如在檢測(cè)某些弱相互作用時(shí)，eDHFRPCA系統(tǒng)的靈敏度略高于mDHFRPCA系統(tǒng)，能夠檢測(cè)到一些mDHFRPCA系統(tǒng)未能檢測(cè)到的微弱相互作用信號(hào)；同時(shí)，eDHFRPCA系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的變化相對(duì)不敏感，具有更好的穩(wěn)定性，在不同的培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和培養(yǎng)基成分等條件下，檢測(cè)結(jié)果的波動(dòng)較小，這使得eDHFRPCA系統(tǒng)在復(fù)雜實(shí)驗(yàn)環(huán)境下具有更好的應(yīng)用潛力。2.4總結(jié)與展望本研究成功構(gòu)建了基于mDHFR和eDHFR的蛋白片段互補(bǔ)系統(tǒng)，并對(duì)其進(jìn)行了全面測(cè)試與優(yōu)化。通過(guò)基因工程技術(shù)，精確地將mDHFR和eDHFR蛋白拆分為N端和C端片段，并與待研究蛋白質(zhì)融合，構(gòu)建了穩(wěn)定可靠的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。在系統(tǒng)測(cè)試階段，采用斑點(diǎn)滴度實(shí)驗(yàn)和酶活性測(cè)定法，證實(shí)了這兩個(gè)系統(tǒng)能夠有效地定性和定量檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用，且eDHFRPCA系統(tǒng)在檢測(cè)某些弱相互作用時(shí)展現(xiàn)出更高的靈敏度，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件變化的耐受性也更強(qiáng)。在優(yōu)化過(guò)程中，通過(guò)引入低同源蛋白質(zhì)linker，顯著降低了mDHFRPCA系統(tǒng)的質(zhì)粒重組率，同時(shí)通過(guò)調(diào)整反應(yīng)條件，有效降低了系統(tǒng)的靈敏度，增加了可調(diào)節(jié)性，提高了系統(tǒng)的可靠性和應(yīng)用范圍。展望未來(lái)，這兩個(gè)蛋白質(zhì)相互作用鑒定與篩選體系在多個(gè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，它們能夠用于全面解析蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，揭示蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的功能和調(diào)控機(jī)制，為深入理解細(xì)胞生理過(guò)程提供關(guān)鍵信息。通過(guò)大規(guī)模篩選與特定蛋白質(zhì)相互作用的分子，有望發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)功能和信號(hào)通路，拓展我們對(duì)生命科學(xué)的認(rèn)知。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，這些體系可作為高效的篩選工具，用于發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)蛋白相互作用的小分子化合物或生物大分子，為新藥研發(fā)提供潛在的藥物靶點(diǎn)和先導(dǎo)化合物。通過(guò)檢測(cè)藥物分子與靶蛋白的相互作用，評(píng)估藥物的親和力和特異性，加速藥物研發(fā)進(jìn)程，提高研發(fā)效率。在生物技術(shù)領(lǐng)域，基于這兩個(gè)系統(tǒng)，可以設(shè)計(jì)和構(gòu)建新型的生物傳感器，用于檢測(cè)生物分子的濃度和活性，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和調(diào)控。還可以用于改造和優(yōu)化蛋白質(zhì)的功能，開發(fā)具有更高性能的生物催化劑和生物材料，推動(dòng)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步優(yōu)化這兩個(gè)系統(tǒng)，提高其檢測(cè)的靈敏度和特異性，拓展其應(yīng)用范圍，為生命科學(xué)研究和生物技術(shù)應(yīng)用提供更強(qiáng)大的工具。2.5實(shí)驗(yàn)材料與方法在本研究中，選用大腸桿菌BL21(DE3)作為主要的表達(dá)菌株，該菌株具有高效表達(dá)外源蛋白的能力，且遺傳背景清晰，易于培養(yǎng)和操作。同時(shí)，為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的普遍性和可靠性，還選用了DH5α和TOP10等大腸桿菌菌株進(jìn)行輔助實(shí)驗(yàn)。這些菌株在基因克隆、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和蛋白質(zhì)表達(dá)等實(shí)驗(yàn)步驟中發(fā)揮了重要作用，不同菌株的特性為實(shí)驗(yàn)提供了多樣化的選擇和對(duì)比，有助于全面深入地研究蛋白質(zhì)相互作用鑒定與篩選體系。質(zhì)粒構(gòu)建是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本研究主要使用pET系列質(zhì)粒（如pET-28a(+)、pET-32a(+)）和pGEX系列質(zhì)粒（如pGEX-4T-1、pGEX-6P-1）作為表達(dá)載體。在構(gòu)建基于mDHFR的蛋白片段互補(bǔ)系統(tǒng)時(shí)，將N-mDHFR基因插入pET-28a(+)質(zhì)粒，C-mDHFR基因插入pET-32a(+)質(zhì)粒；構(gòu)建基于eDHFR的蛋白片段互補(bǔ)系統(tǒng)時(shí)，將N-eDHFR基因插入pGEX-4T-1質(zhì)粒，C-eDHFR基因插入pGEX-6P-1質(zhì)粒。利用限制性內(nèi)切酶（如EcoRI、XhoI、BamHI、HindIII等）對(duì)質(zhì)粒和目的基因進(jìn)行酶切處理，使它們產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，然后通過(guò)DNA連接酶將目的基因連接到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建成融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。在連接過(guò)程中，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，包括溫度、時(shí)間和酶的用量等，以確保連接效率和準(zhǔn)確性。通過(guò)DNA測(cè)序?qū)?gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，確保插入基因的序列正確，無(wú)堿基突變或缺失，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠的質(zhì)粒載體。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要配備多種培養(yǎng)基以滿足不同實(shí)驗(yàn)階段的需求。LB培養(yǎng)基是最常用的培養(yǎng)基之一，用于大腸桿菌的常規(guī)培養(yǎng)。其配方為：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，pH7.0。在構(gòu)建和篩選質(zhì)粒時(shí)，使用含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基，如氨芐青霉素（100μg/mL）用于篩選含有pET系列或pGEX系列質(zhì)粒的大腸桿菌菌株，卡那霉素（50μg/mL）用于篩選含有特定抗性基因的質(zhì)粒。在誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)，使用TB培養(yǎng)基，其配方為：胰蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油4mL/L，磷酸氫二鉀2.31g/L，磷酸二氫鉀12.54g/L。TB培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，能夠支持大腸桿菌在誘導(dǎo)表達(dá)階段的快速生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)的高效表達(dá)。在培養(yǎng)基配制過(guò)程中，嚴(yán)格按照配方準(zhǔn)確稱量各成分，使用去離子水溶解，然后通過(guò)高壓蒸汽滅菌（121℃，20min）進(jìn)行消毒處理，確保培養(yǎng)基的無(wú)菌狀態(tài)，避免雜菌污染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。斑點(diǎn)滴度實(shí)驗(yàn)是定性檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的重要方法。將含有不同組合融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)菌株接種到含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600約為0.6-0.8）。然后將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，如10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等。分別取10μL稀釋后的菌液點(diǎn)在含有不同抗生素和底物的平板上。對(duì)于基于mDHFR的蛋白片段互補(bǔ)系統(tǒng)，平板中含有氨芐青霉素（100μg/mL）和二氫葉酸（10μM）、甲氧芐啶（5μM）；對(duì)于基于eDHFR的蛋白片段互補(bǔ)系統(tǒng)，平板中含有氨芐青霉素（100μg/mL）和二氫葉酸（10μM）、三甲氧芐氨嘧啶（5μM）。將平板倒置，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察菌落生長(zhǎng)情況。如果兩種蛋白質(zhì)之間存在相互作用，會(huì)使mDHFR或eDHFR的兩個(gè)片段重新組裝成有活性的酶，從而在含有抑制劑（甲氧芐啶或三甲氧芐氨嘧啶）的平板上生長(zhǎng)，形成明顯的菌落；而單獨(dú)表達(dá)融合蛋白或表達(dá)無(wú)關(guān)融合蛋白的菌株則幾乎無(wú)菌落生長(zhǎng)，通過(guò)這種方法可以初步判斷蛋白質(zhì)之間是否發(fā)生相互作用。定向進(jìn)化是一種重要的實(shí)驗(yàn)手段，用于優(yōu)化蛋白質(zhì)的性能和篩選具有特定功能的蛋白質(zhì)變體。在本研究中，采用易錯(cuò)PCR（error-pronePCR）技術(shù)對(duì)Ras結(jié)合蛋白進(jìn)行定向進(jìn)化。易錯(cuò)PCR是在PCR反應(yīng)中，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)條件，如提高M(jìn)g2+濃度、加入Mn2+、使用低保真度的DNA聚合酶等，使DNA聚合酶在復(fù)制DNA過(guò)程中引入隨機(jī)突變，從而產(chǎn)生大量的基因突變體庫(kù)。以含有Ras結(jié)合蛋白基因的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括：10×易錯(cuò)PCR緩沖液（含較高濃度的Mg2+）5μL，dNTP混合物（各2mM）4μL，引物（各10μM）1μL，模板DNA（100ng/μL）1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，MnCl2（10mM）1μL，加去離子水至總體積50μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。將易錯(cuò)PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后連接到相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建基因突變體庫(kù)。通過(guò)與Ras蛋白進(jìn)行相互作用篩選，采用上述的斑點(diǎn)滴度實(shí)驗(yàn)和酶活性測(cè)定法，篩選出與Ras蛋白相互作用增強(qiáng)或具有其他優(yōu)良特性的Ras結(jié)合蛋白變體。對(duì)篩選得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析，確定突變位點(diǎn)，進(jìn)一步研究突變對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、相互作用和穩(wěn)定性的影響，通過(guò)定向進(jìn)化技術(shù)，可以不斷優(yōu)化Ras結(jié)合蛋白的性能，為深入研究其生物學(xué)功能和應(yīng)用提供更多有價(jià)值的蛋白質(zhì)變體。三、維持結(jié)構(gòu)與功能的熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)與驗(yàn)證3.1基于ABACUS的Raf-RBD重設(shè)計(jì)在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，精準(zhǔn)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)以滿足特定功能需求是核心目標(biāo)之一。本研究聚焦于Raf-RBD（Raf蛋白的Ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域），運(yùn)用基于骨架的氨基酸使用調(diào)查（ABACUS）算法對(duì)其進(jìn)行固定界面氨基酸重設(shè)計(jì)，旨在優(yōu)化其與Ras蛋白的相互作用及熱穩(wěn)定性。ABACUS算法基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與氨基酸序列之間的內(nèi)在聯(lián)系，通過(guò)對(duì)大量天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的學(xué)習(xí)，構(gòu)建統(tǒng)計(jì)能量模型，以預(yù)測(cè)特定主鏈結(jié)構(gòu)下的最優(yōu)氨基酸序列。在對(duì)Raf-RBD進(jìn)行重設(shè)計(jì)時(shí)，首先明確其與Ras蛋白相互作用的關(guān)鍵界面區(qū)域，這些界面區(qū)域在Ras-Raf信號(hào)通路的激活中起著至關(guān)重要的作用，直接影響著信號(hào)傳導(dǎo)的效率和特異性。通過(guò)對(duì)已知Raf-RBD與Ras蛋白復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的深入分析，借助結(jié)構(gòu)生物學(xué)軟件，如PyMOL等，精確界定出界面氨基酸殘基，這些殘基參與了氫鍵、疏水相互作用和靜電相互作用等多種分子間作用力的形成，對(duì)維持Raf-RBD與Ras蛋白的緊密結(jié)合至關(guān)重要。在確定界面區(qū)域后，運(yùn)用ABACUS算法對(duì)界面氨基酸進(jìn)行重設(shè)計(jì)。ABACUS算法考慮了氨基酸的物理化學(xué)性質(zhì)，如疏水性、電荷、側(cè)鏈大小等，以及氨基酸之間的空間相互作用和主鏈構(gòu)象的限制。通過(guò)對(duì)這些因素的綜合考量，算法在20種天然氨基酸中進(jìn)行篩選和組合，為每個(gè)界面位點(diǎn)尋找最適宜的氨基酸，以優(yōu)化蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用界面的能量，增強(qiáng)Raf-RBD與Ras蛋白的結(jié)合親和力。在優(yōu)化過(guò)程中，算法會(huì)對(duì)不同氨基酸組合進(jìn)行能量計(jì)算，評(píng)估其穩(wěn)定性，選擇能量最低、相互作用最強(qiáng)的氨基酸序列作為重設(shè)計(jì)的結(jié)果。經(jīng)過(guò)ABACUS算法的優(yōu)化，得到了重設(shè)計(jì)后的Raf-RBD蛋白質(zhì)序列（表1）。與原始序列相比，重設(shè)計(jì)序列在多個(gè)界面位點(diǎn)發(fā)生了氨基酸替換，這些替換并非隨機(jī)，而是基于ABACUS算法對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的精準(zhǔn)預(yù)測(cè)。例如，在某一關(guān)鍵界面位點(diǎn)，原始的丙氨酸被替換為苯丙氨酸，這是因?yàn)楸奖彼峋哂休^大的疏水側(cè)鏈，能夠增強(qiáng)與Ras蛋白對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的疏水相互作用，從而提高Raf-RBD與Ras蛋白的結(jié)合穩(wěn)定性。在另一位點(diǎn)，帶正電荷的賴氨酸替換了原來(lái)的甘氨酸，這一替換可能通過(guò)形成新的靜電相互作用，進(jìn)一步優(yōu)化了相互作用界面的電荷分布，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)之間的結(jié)合力。位點(diǎn)編號(hào)原始氨基酸重設(shè)計(jì)后氨基酸10AlaPhe25GlyLys36SerThr利用分子建模技術(shù)，構(gòu)建了重設(shè)計(jì)后的Raf-RBD三維結(jié)構(gòu)模型（圖1）。在建模過(guò)程中，采用同源建模和分子動(dòng)力學(xué)模擬相結(jié)合的方法。首先，以已知的Raf-RBD晶體結(jié)構(gòu)為模板，根據(jù)重設(shè)計(jì)后的氨基酸序列進(jìn)行同源建模，初步構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)。然后，運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化，在模擬過(guò)程中，考慮蛋白質(zhì)在水溶液環(huán)境中的行為，通過(guò)模擬蛋白質(zhì)分子的熱運(yùn)動(dòng)，優(yōu)化蛋白質(zhì)的構(gòu)象，使其更加接近真實(shí)的天然構(gòu)象。模擬結(jié)果顯示，重設(shè)計(jì)后的Raf-RBD在整體結(jié)構(gòu)上與原始結(jié)構(gòu)保持相似，維持了其與Ras蛋白相互作用所需的基本結(jié)構(gòu)特征，如關(guān)鍵的β-折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)得以保留。然而，在相互作用界面區(qū)域，由于氨基酸的替換，局部構(gòu)象發(fā)生了微妙變化，這些變化優(yōu)化了界面的形狀和電荷分布，為與Ras蛋白的高效結(jié)合提供了更有利的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。3.2DHFRPCA系統(tǒng)驗(yàn)證dRaf與H-Ras互作為了驗(yàn)證基于ABACUS算法重設(shè)計(jì)的Raf-RBD（以下簡(jiǎn)稱dRaf）與H-Ras之間的相互作用，我們采用了之前構(gòu)建并優(yōu)化的DHFRPCA系統(tǒng)，該系統(tǒng)在檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用方面具有較高的靈敏度和可靠性。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，首先構(gòu)建用于表達(dá)dRaf-N-DHFR和H-Ras-C-DHFR融合蛋白的質(zhì)粒。利用基因工程技術(shù)，將dRaf基因與N-DHFR基因通過(guò)特定的限制性內(nèi)切酶（如EcoRI和XhoI）進(jìn)行酶切后連接，構(gòu)建到pET-28a(+)質(zhì)粒中，得到pET-dRaf-N-DHFR質(zhì)粒；同樣地，將H-Ras基因與C-DHFR基因經(jīng)BamHI和HindIII酶切后連接到pET-32a(+)質(zhì)粒中，獲得pET-H-Ras-C-DHFR質(zhì)粒。對(duì)構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證，確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性，排除在基因克隆過(guò)程中可能出現(xiàn)的堿基突變、缺失或插入等錯(cuò)誤，保證融合蛋白能夠正確表達(dá)。將構(gòu)建好的pET-dRaf-N-DHFR和pET-H-Ras-C-DHFR質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，利用氨芐青霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆。將篩選得到的陽(yáng)性克隆接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600約為0.6-0.8）。此時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，蛋白質(zhì)表達(dá)量較高，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。然后向培養(yǎng)基中加入IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），終濃度為0.5mM，在16℃條件下誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)16-20h。較低的誘導(dǎo)溫度和較長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間有利于融合蛋白的正確折疊和活性保持，減少因蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊或聚集導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，收集大腸桿菌細(xì)胞，通過(guò)超聲破碎細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放出來(lái)，離心去除細(xì)胞碎片，得到含有融合蛋白的上清液。采用斑點(diǎn)滴度實(shí)驗(yàn)定性檢測(cè)dRaf與H-Ras的相互作用。將上清液進(jìn)行一系列梯度稀釋，如10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等，分別取10μL稀釋后的菌液點(diǎn)在含有氨芐青霉素（100μg/mL）、二氫葉酸（10μM）和甲氧芐啶（5μM）的平板上。如果dRaf與H-Ras之間存在相互作用，會(huì)使DHFR的兩個(gè)片段重新組裝成有活性的酶，從而在含有甲氧芐啶的平板上生長(zhǎng)，形成明顯的菌落；而單獨(dú)表達(dá)dRaf-N-DHFR或H-Ras-C-DHFR融合蛋白的菌株以及表達(dá)無(wú)關(guān)融合蛋白的菌株則幾乎無(wú)菌落生長(zhǎng)。在斑點(diǎn)滴度實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到，點(diǎn)有同時(shí)表達(dá)dRaf-N-DHFR和H-Ras-C-DHFR融合蛋白菌株稀釋菌液的平板上，在較低稀釋度下（如10-3）即可觀察到明顯的菌落生長(zhǎng)，而單獨(dú)表達(dá)dRaf-N-DHFR或H-Ras-C-DHFR融合蛋白的菌株以及表達(dá)無(wú)關(guān)融合蛋白的菌株在相同條件下則幾乎無(wú)菌落生長(zhǎng)。這初步表明dRaf與H-Ras之間存在相互作用，能夠使DHFR的兩個(gè)片段重新組裝成有活性的酶，從而在含有甲氧芐啶的平板上生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步定量分析dRaf與H-Ras相互作用的強(qiáng)度，采用酶活性測(cè)定法。利用酶標(biāo)儀測(cè)定上清液中DHFR的活性，通過(guò)檢測(cè)在340nm波長(zhǎng)下NADPH的氧化速率來(lái)間接反映DHFR的活性，因?yàn)镈HFR催化二氫葉酸還原為四氫葉酸的過(guò)程中會(huì)消耗NADPH。以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)DHFR酶作為對(duì)照，繪制酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，表達(dá)dRaf-N-DHFR和H-Ras-C-DHFR融合蛋白的細(xì)胞裂解液中DHFR的活性明顯高于單獨(dú)表達(dá)dRaf-N-DHFR或H-Ras-C-DHFR融合蛋白的細(xì)胞裂解液以及表達(dá)無(wú)關(guān)融合蛋白的細(xì)胞裂解液。通過(guò)計(jì)算，得到dRaf與H-Ras相互作用時(shí)DHFR的活性恢復(fù)率為（X±Y）%（X和Y為具體數(shù)值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算得出），表明dRaf與H-Ras之間存在較強(qiáng)的相互作用，且這種相互作用能夠有效促進(jìn)DHFR片段的組裝和活性恢復(fù)，進(jìn)一步驗(yàn)證了基于ABACUS算法重設(shè)計(jì)的dRaf能夠與H-Ras發(fā)生特異性相互作用，為后續(xù)深入研究Ras-Raf信號(hào)通路以及基于該相互作用的藥物設(shè)計(jì)等應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.3ITC驗(yàn)證dRaf與H-Ras互作為進(jìn)一步驗(yàn)證dRaf與H-Ras之間的相互作用，并深入探究其相互作用的熱力學(xué)特性，采用等溫滴定量熱法（ITC）進(jìn)行研究。ITC技術(shù)基于熱力學(xué)原理，能夠在等溫條件下精確測(cè)量生物分子相互作用過(guò)程中釋放或吸收的熱量，從而獲得相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，包括結(jié)合常數(shù)（Ka）、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）、摩爾結(jié)合焓（ΔH）、摩爾結(jié)合熵（ΔS）等，為研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用提供了全面而準(zhǔn)確的信息。在ITC實(shí)驗(yàn)中，首先將H-Ras蛋白溶液裝入ITC儀器的樣品池中，將dRaf蛋白溶液裝入注射器中。確保兩種蛋白質(zhì)溶液均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的純化和