目錄TOC\o"1-3"\h\u摘要： 弓形蟲ROP16蛋白作用于NR8383細胞的轉(zhuǎn)錄組測序與分析前言弓形蟲（Toxoplasmagondii）是一種專性的細胞內(nèi)寄生原蟲，能夠引發(fā)人與動物的共同疾病。這種原蟲在全球有廣泛的分布，感染的范圍很廣，大約有三分之一的全球人口受到了感染REF_Ref12288\r\h1。如果孕婦被弓形蟲感染，這可能會引發(fā)垂直傳播，從而導致胎兒的發(fā)育異常、畸形，甚至死亡。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，85%幸存的感染嬰兒可能會表現(xiàn)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)的異常，這對優(yōu)生優(yōu)育產(chǎn)生了重大的負面影響。另外，弓形蟲被認為是導致免疫系統(tǒng)受損或有缺陷的患者死亡的主要因素之一REF_Ref12651\r\h2,REF_Ref12654\r\h3。弓形蟲主要分為三個代表性的基因型，分別是I型（RH株）、II型（Me49株）以及III型（VEG株）。這三種基因型的蟲株具有高達98%的遺傳同源性，然而，它們在毒性方面卻表現(xiàn)出明顯的不同。在這些中，I型弓形蟲的毒性最為顯著，而II型與III型的毒性則相對較為溫和。弓形蟲的毒性主要表現(xiàn)在其對宿主細胞的侵略性、細胞內(nèi)的增殖速率、是否能在細胞內(nèi)形成包囊，以及其對宿主的致病性和致死性等方面REF_Ref12811\r\h4。弓形蟲棒狀體蛋白16（ROP16）是一種在弓形蟲侵入宿主細胞過程中起到至關(guān)重要作用的蛋白激酶REF_Ref12886\r\h5。經(jīng)過研究，ROP16被確認為一個關(guān)鍵的毒性調(diào)控因子，它主要存在于宿主的細胞核之中REF_Ref12935\r\h6,REF_Ref12964\r\h7。NR8383細胞被廣泛認為是大鼠肺泡巨噬細胞系中的一種常見類型REF_Ref13128\r\h8，這是一個研究弓形蟲感染與宿主免疫響應(yīng)的關(guān)鍵模型。在本次研究中，選擇了NR8383細胞株作為研究對象，并對ROP16進行了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染處理。通過整合轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對ROP16蛋白對宿主細胞基因表達的作用進行了深入探討，旨在為弓形蟲病的預防和治療提供科學依據(jù)和創(chuàng)新方向。1、材料與方法1.1材料1.細胞：NR8383細胞被存放在寧夏的臨床病原微生物關(guān)鍵實驗室中；嘌呤霉素是從Sigma公司采購而來的；在實驗過程中，所使用的慢病毒種類（包含空載體pHBLV-CMV和ROP16過表達載體pHBLV-CMVROP16）均是從漢恒生物科技（上海）有限公司采購而來；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均是從日本的TaKaRa公司采購而來的。2.試劑與儀器：胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶等細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑均購自GIBCO公司；WesternBlot相關(guān)試劑包括兔抗ROP16多克隆抗體，HRP標記山羊抗兔IgG(HRP-IgG）、山羊抗鼠IgG(HRP-IgG）均購自美國Abcam公司，RT-PCR所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。1.2方法1.2.1慢病毒轉(zhuǎn)染NR8383細胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株篩選1.慢病毒包裝與感染：在構(gòu)建完成的ROP16重組慢病毒質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒的共同作用下，對HEK293T細胞進行了轉(zhuǎn)染，并根據(jù)Lipofectamine3000試劑的說明書進行了操作。在轉(zhuǎn)染完成后的48-72小時內(nèi)，需要收集細胞表面的清液，并通過0.45μm的過濾器進行過濾，獲得攜帶ROP16基因的慢病毒顆粒。將NR8383細胞分為正常對照組（轉(zhuǎn)染空載體慢病毒）和過表達組（轉(zhuǎn)染ROP16重組慢病毒），按復染率（MOI）為50的比例分別加入相應(yīng)慢病毒顆粒，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-8小時后，更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。2.熒光顯微鏡觀察：在感染發(fā)生后的48-72小時內(nèi)，利用熒光顯微鏡檢查細胞內(nèi)綠色熒光蛋白（GFP）的表達水平，從而初步評估轉(zhuǎn)染的效果。正常對照組細胞由于轉(zhuǎn)染空載慢病毒，僅少量或無GFP表達，而過表達組細胞應(yīng)有大量GFP陽性細胞，轉(zhuǎn)染效率應(yīng)達到80%以上，以確保后續(xù)實驗的可靠性。3.實時熒光定量PCR（qRT-pcr）檢測：收集轉(zhuǎn)染后72小時的NR8383細胞，按照Trizol試劑說明書提取細胞總RNA。使用qRT-pcr的方法檢測正常對照組和過表達組細胞中ROP16基因的相對表達量。4.WesternBlot檢測：在轉(zhuǎn)染后的72小時內(nèi)，收集了NR8383細胞，并采用含有1%PMSF的RIPA裂解液對其進行了裂解處理。從這些裂解中，我們成功提取了總蛋白，并利用BCA蛋白定量試劑盒對這些蛋白的濃度進行了測定。首先，我們使用10%的SDS電泳技術(shù)對蛋白樣本進行分離，接著把這些分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后，用5%的脫脂牛奶進行為期兩小時的密封處理。接下來，分別加入了兔抗ROP16多克隆抗體（1:1000稀釋）和鼠抗GAPDH單克隆抗體（1:5000稀釋），然后在4°C的溫度下孵化過夜。第二天，我們加入了帶有辣根過氧化物酶標記的二抗（1:10000稀釋），并在常溫條件下孵化了兩小時。隨后，我們使用化學發(fā)光試劑進行了顯色處理，并通過凝膠成像系統(tǒng)進行了檢測。我們采用ImageJ軟件對條帶的灰度進行了分析，并利用ROP16蛋白條帶灰度與GAPDH蛋白條帶灰度的比值來描述ROP16蛋白的相對表達水平，進而對比了兩組細胞中ROP16蛋白的表達差異。1.2.2轉(zhuǎn)錄組測序及分析1.RNA提取與質(zhì)量檢測：將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的正常對照組和過表達組NR8383細胞分別收集，每組設(shè)置三個生物學重復。使用Trizol試劑來提取細胞的總RNA，并根據(jù)RNA的純度和完整性標準，利用NanoDrop2000分光光度計來測定RNA的濃度和純度，即OD260與OD280的比值）。2.測序文庫構(gòu)建與測序：將提取的高質(zhì)量RNA樣品委托給專業(yè)測序公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。3.數(shù)據(jù)分析：通過使用韋恩圖，探討了正常對照組與ROP16過表達組在基因表達上的差異性。利用火山圖和散點圖技術(shù)，我們能夠直觀地展示差異表達基因DEGs的特性?；鹕綀D的橫坐標是log2（FoldChange），而縱坐標則是log10（P-value），散點圖以log10（ExpressionofNR8383）為橫坐標，log10（ExpressionofOverExp-ROP16）為縱坐標，設(shè)定篩選條件為|log2（FoldChange）|≥1且P-value≤0.05，篩選出在正常對照組和過表達組間差異表達的基因。了解這些DEGs在生物學功能和信號通路中的分布情況，以深入探究ROP16蛋白作用于NR8383細胞的分子機制。1.2.3實時熒光定量PCR驗證轉(zhuǎn)錄譜基因表達1.驗證基因的選?。阂罁?jù)轉(zhuǎn)錄組的測序數(shù)據(jù)，并結(jié)合基因功能的注釋和富集分析，為了確保驗證基因的代表性和可靠性，我們選擇了與ROP16蛋白可能作用相關(guān)的差異表達基因進行驗證，并選取了具有不同表達趨勢的基因，以全面評估轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性。2.引物設(shè)計與合成：依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫里特定基因的cDNA序列，精心設(shè)計的引物序列是由生工生物工程（上海）股份有限公司負責合成的，引物序列如下：表1引物序列Table1Primersequences基因名稱Genename引物序列（5′-3′）Primersequence（5′-3′）GAPDHF：ACAGCAACAGGGTGGTGGACR：TTTGAGGGTGCAGCGAACTTROP16F：TGGGCTCCTGAACTTGCGAAATCR：AGACGAACTCGAAGATTGCCAACCJAK3F：TGTAGCCTCTCATCCTCAGAAGCR：ACACAGGTCCTCAGCCAAGTAGCD11bF：GCAAGAGAATCCAGTGTGACATCCR：CAGGAGGTGGTCGTGAGAAGTCCXCR1F：TCTGGAACAGTCTGCTATGAGGTCR：GATGAACAGCGGCAAGAGGAAGHoxc6F：TCCTACTTCACTAACCCTTCCTTATCCR：GCTACGGCTGCTCCATAGGTC2、結(jié)果2.1穩(wěn)定表達ROP16的NR8383細胞株構(gòu)建：將構(gòu)建好的ROP16慢病毒轉(zhuǎn)染至大鼠肺泡巨噬細胞NR8383中，如圖1：慢病毒轉(zhuǎn)染后72小時，熒光顯微鏡下觀察到正常對照組細胞有極少部分細胞有微弱GFP熒光，而過表達組細胞中有大量細胞呈現(xiàn)明亮的GFP熒光信號，轉(zhuǎn)染效率達到85%以上，表明ROP16重組慢病毒成功轉(zhuǎn)染至NR8383細胞，為后續(xù)篩選提供了良好的基礎(chǔ)。圖1熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染情況2.2.實時熒光定量PCR檢測結(jié)果：（如圖2）在完成轉(zhuǎn)染后的72小時時間里，收集了細胞樣本，并對其進行了實時熒光定量PCR檢測。經(jīng)過檢測，發(fā)現(xiàn)在過表達組的細胞里，ROP16基因的相對表達量顯著超過了正常對照組，這種差異在統(tǒng)計上是有意義的（P<0.01）。從轉(zhuǎn)錄的角度證實了ROP16基因在NR8383細胞里的過度表達，說明構(gòu)建的ROP16過表達質(zhì)粒能夠有效驅(qū)動ROP16基因在宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄。2.3WesternBlot的檢測數(shù)據(jù)表明（如圖3所示），與正常對照組相比，過表達組的表達量明顯更高，這種差異在統(tǒng)計學上是有意義的（P<0.01）。這一結(jié)果從蛋白質(zhì)水平進一步驗證了ROP16基因在NR8383細胞中的過表達，研究結(jié)果顯示，已經(jīng)成功地建立了能夠穩(wěn)定表達ROP16的NR8383細胞系，這為進一步探討ROP16蛋白如何影響細胞基因表達提供了寶貴的細胞實驗模型。圖3ROP16蛋白表達情況圖4ROP16過表達后差異表達基因的韋恩圖圖5ROP16過表達后差異表達基因的火山圖與散點圖2.4轉(zhuǎn)錄組測序及分析結(jié)果：通過差異表達基因（DEGs）的分析，使用韋恩圖對正常對照組和ROP16過表達組的基因表達進行了評估。如圖4展示的，與過表達組相比，對照組僅表達了799個基因，而過表達組僅表達了771個基因。這兩組在ROP16過表達組中共同表達了13731個基因，這表明ROP16過表達后，NR8383巨噬細胞的基因表達發(fā)生了改變。接下來，根據(jù)“|log2FC|≥1和Qvalue≤0.05”的標準進行了篩選。如圖5展示，ROP16在過度表達后，有128個基因表現(xiàn)出顯著的差異，其中81個基因的表達上升，而47個基因的表達下降。在比較表達組樣本和正常對照組樣本的差異表達時選出了（如表2）上調(diào)基因JAK3和CD11b，以及下調(diào)基因CXCR1和Hoxc6來進行驗證來表明ROP16蛋白的過表達對NR8383細胞的基因表達譜產(chǎn)生了廣泛而顯著的影響。表2差異基因表達在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的信息基因基因IDlog2(OverExp-ROP16/NR8383)Qvalue(OverExp-ROP16/NR8383)JAK3253261.405e-8CD11b250211.790.02CXCR1252885-1.934.46e-5Hoxc654258-1.435.94e-3圖6轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的qRT-PCR驗證2.5實時熒光定量PCR技術(shù)被用于驗證JAK3CD11bCXCR1和Hoxc6。為了確保表2中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準確性，使用qRT-PCR方法來檢查JAK3和CD11b這兩個差異表達上調(diào)基因以及CXCR1和Hoxc6這兩個差異表達下調(diào)基因的表達情況。如圖6所示，上調(diào)的JAK3和CD11b差異表達基因以及下調(diào)的CXCR1和Hoxc6差異表達基因的表達模式與轉(zhuǎn)錄組的基因表達模式是一致的。3、討論一旦弓形蟲被感染，它會轉(zhuǎn)變?yōu)榭焖俜敝车淖臃N，并在宿主體內(nèi)傳播，導致人和動物都可能受到弓形蟲疾病的困擾REF_Ref13219\r\h9,REF_Ref13222\r\h10。本項研究是通過構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達弓形蟲ROP16蛋白的NR8383細胞系來進行的REF_Ref13458\r\h11，還進行了轉(zhuǎn)錄組的測序分析，結(jié)果顯示ROP16蛋白對NR8383細胞的基因表達產(chǎn)生了明顯的影響。通過篩選，我們找到了大量的差異表達基因，并通過功能富集分析揭示了這些基因在免疫反應(yīng)和細胞功能等多個方面的潛在作用機制。從免疫反應(yīng)角度來看，弓形蟲感染宿主細胞后，ROP16蛋白作為其重要的效應(yīng)蛋白，可能通過調(diào)控宿主細胞的免疫相關(guān)基因表達來抑制宿主的抗感染免疫反應(yīng)，從而促進弓形蟲的感染和擴散。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，在ROP16蛋白過表達的NR8383細胞中，JAK3的基因表達有了明顯的增加。JAK3基因編碼出的蛋白是Janus激酶家族中的一員REF_Ref13670\r\h12，該物質(zhì)主要在免疫細胞內(nèi)表達，并在細胞因子的信號傳遞中起到關(guān)鍵作用，特別是在由白細胞介素-2（IL-2）和白細胞介素-4（IL-4）等細胞因子觸發(fā)的信號途徑中，它對T細胞和B細胞的增長、分化和生存起到了核心調(diào)控作用REF_Ref13729\r\h13。在本研究中，ROP16蛋白過表達導致JAK3基因上調(diào)，這可能會觸發(fā)NR8383細胞內(nèi)的特定細胞因子信號途徑，從而提高細胞的免疫響應(yīng)能力。CD11b基因在過表達ROP16蛋白的NR8383細胞中也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。CD11b是一種整合素受體，廣泛表達于白細胞表面，在細胞黏附、遷移以及免疫細胞的激活過程中扮演重要角色REF_Ref13794\r\h14，尤其在巨噬細胞的吞噬作用和抗原呈遞功能中具有關(guān)鍵地位。ROP16蛋白誘導CD11b基因表達上調(diào)，可能增強NR8383細胞的黏附和遷移能力，促進其對病原體的吞噬和清除。但考慮到弓形蟲的巧妙逃逸機制，這種上調(diào)也可能是蟲體為了自身在宿主體內(nèi)的傳播和擴散而對宿主細胞功能進行的某種調(diào)控。從細胞功能角度來看，CXCR1基因在ROP16蛋白作用下表達下調(diào)。CXCR1是一種趨化因子受體，它主要涉及中性粒細胞的趨化和激活過程，對于炎癥反應(yīng)的觸發(fā)和持續(xù)起到了關(guān)鍵的角色。其配體包括IL-8等趨化因子，當炎癥發(fā)生時，這些趨化因子與CXCR1結(jié)合，引導中性粒細胞遷移到炎癥部位，發(fā)揮抗菌、抗炎等作用REF_Ref13931\r\h15。在本研究中，ROP16蛋白導致CXCR1基因表達下調(diào)，可能抑制中性粒細胞的趨化和活化，從而減弱炎癥反應(yīng)。這可能是弓形蟲為了逃避宿主的炎癥攻擊而對宿主細胞基因表達進行的調(diào)控，有利于其在宿主體內(nèi)的長期生存。Hoxc6基因在細胞中表達也是下調(diào)，Hox基因家族在胚胎發(fā)育過程中對細胞分化、器官形成等具有關(guān)鍵調(diào)控作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)其在免疫細胞功能調(diào)節(jié)中也發(fā)揮作用REF_Ref13996\r\h16。Hoxc6基因的下調(diào)可能影響NR8383細胞的分化和功能，進而影響其在炎癥反應(yīng)中的表現(xiàn)。具體而言，Hoxc6基因的低表達可能改變巨噬細胞的活化狀態(tài)，使其向某種特定的表型極化，這種極化狀態(tài)可能更有利于弓形蟲的感染和存活，例如抑制巨噬細胞的抗菌活性或促炎因子的分泌。綜合來看，弓形蟲ROP16蛋白對NR8383細胞的轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)生了顯著影響，通過調(diào)控多個關(guān)鍵基因的表達，影響宿主細胞的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。上調(diào)的JAK3和CD11b基因有可能提升細胞內(nèi)某些免疫系統(tǒng)的功能，而下調(diào)的CXCR1和Hoxc6基因則可能抑制炎癥反應(yīng)和細胞的正常分化。這種復雜的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能是弓形蟲在長期進化過程中形成的一種適應(yīng)性策略，通過精細調(diào)控宿主細胞的基因表達，既滿足自身在宿主體內(nèi)的生存和繁殖需求，又能有效逃避宿主的免疫清除。然而，本研究仍存在一些局限性。首先，雖然通過轉(zhuǎn)錄組測序和實時熒光定量PCR驗證了基因表達的變化，但對于這些基因在蛋白水平的表達變化以及具體的生物學功能驗證還不夠充分。其次，對于ROP16蛋白調(diào)控這些基因表達的分子機制尚未完全明確，是否存在某些轉(zhuǎn)錄因子或信號通路的直接參與尚需進一步研究。此外，本研究僅在體外細胞水平進行，未開展體內(nèi)實驗驗證，無法確定這些基因表達變化在整體動物感染模型中的作用和意義，未來需要進一步開展深入的實驗研究，通過基因敲除、蛋白相互作用等實驗手段，進一步探討了ROP16蛋白與宿主細胞基因間的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，以及這些基因在弓形蟲感染中的關(guān)鍵角色，旨在為弓形蟲病的預防和治療提供更為精確的目標和方法。4、結(jié)論本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達弓形蟲ROP16蛋白的NR8383細胞株，并通過轉(zhuǎn)錄組測序和實時熒光定量PCR驗證，全面分析對ROP16蛋白如何影響NR8383細胞的基因表達進行了深入的探討，得出以下結(jié)論：ROP16蛋白能夠顯著改變NR8383細胞的基因表達譜，篩選出的差異表達基因涉及多個重要的生物學過程和信號通路，包括免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細胞代謝調(diào)控等,為弓形蟲ROP16蛋白的作用機制以及弓形蟲與宿主細胞之間的相互作用提供了重要的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)，也為弓形蟲病的防治研究提供了新的方向和潛在的靶點。參考文獻HillDE,ChirukandothS,DubeyJP.BiologyandepidemiologyofToxoplasmagondiiinmanandanimals.AnimHealthResRev.2005Jun;6(1):41-61.張愛梅.弓形蟲基因型Chinese1不同毒力的分離株誘導巨噬細胞偏移應(yīng)答的研究[D].安徽醫(yī)科大學,2013.WangJ,LiuX,JiaB,LuH,PengS,PiaoX,HouN,CaiP,YinJ,JiangN,ChenQ.AcomparativestudyofsmallRNAsinToxoplasmagondiiofdistinctgenotypes.ParasitVectors.2012Sep3;5:186.

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