真菌標(biāo)本接種培養(yǎng)基選擇慣用染色方法曲霉菌屬鏡下形態(tài)和菌落特點病例分析第1頁醫(yī)學(xué)主要霉菌分類第2頁合格痰標(biāo)本分類細(xì)胞數(shù)/低倍視野WBC扁平上皮細(xì)胞5>25<104>2510-25含1-2種不一樣細(xì)菌，可考慮繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果可依據(jù)病情再作分析超出3種細(xì)菌，按不合格標(biāo)本處理。中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,,23(5):312第3頁真菌標(biāo)本接種呼吸道標(biāo)本,肺泡灌洗液無菌體液：

（腦脊液、穿刺液、骨髓、玻璃體等）無菌體液1-5ml打入真菌/分枝桿菌血培養(yǎng)瓶三區(qū)劃線28℃孵箱，5天培養(yǎng)基用封口膜密封好懷疑生長遲緩菌（如組織胞漿菌），延長培養(yǎng)時間至30天。懷疑真菌生長，點種真菌培養(yǎng)宜使用含和不含抗菌藥品兩類培養(yǎng)基。經(jīng)空氣傳輸有高度感染性真菌樣品、含菌絲體真菌應(yīng)在生物安全柜內(nèi)處理。若采取平皿培養(yǎng)，應(yīng)封蓋。CNAS-CL42：

第4頁培養(yǎng)基選擇沙保羅培養(yǎng)基SDA馬鈴薯培養(yǎng)基PDACHROMagar念珠菌顯色培養(yǎng)基第5頁菌落形態(tài)（菌落大小、形態(tài)、色素、顏色和質(zhì)地）顯微鏡下真菌孢子、菌絲、產(chǎn)孢等特征性結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步判斷真菌種屬。碰到疑難絲狀真菌，應(yīng)請專業(yè)組內(nèi)多名技術(shù)人員觀看、討論，以確定種屬。每次觀察菌落特征均需要統(tǒng)計、并照下顯微鏡下形態(tài)特征和菌落。參考圖譜或網(wǎng)上咨詢真菌培養(yǎng)物形態(tài)學(xué)判定第6頁菌落形態(tài)

觀察酵母型菌落類酵母型菌落絲狀型菌落（正、反）雙相真菌顯微鏡檢驗有隔或無隔分支或不分支有色或無色形態(tài)學(xué)判定第7頁常見顯微鏡檢驗方法KOH壓片法（直接鏡檢）墨汁染色乳酸酚棉蘭染色六胺銀染色革蘭染色：回顧性看有利于診療第8頁顯微鏡檢驗方法KOH壓片：皮屑、毛發(fā)、指甲、膿液、痰等標(biāo)本置于載玻片上，加一滴10-20%

KOH，蓋上蓋玻片鏡檢，加熱30-60s，鏡檢先低倍后高倍（在KOH中加入剛果紅1:1，更有利于真菌檢測）第9頁墨汁染色：以無菌吸管吸收處理過標(biāo)本一滴置于玻片上，再加上一小滴印度墨汁混合均勻，以40°角蓋上蓋玻片(防止產(chǎn)生氣泡)鏡檢（樣本與墨汁等量混合）顯微鏡檢驗方法第10頁顯微鏡檢驗方法乳酸酚棉蘭染色：通常采取透明膠帶法利用膠帶先粘一定量菌絲再粘在預(yù)先滴加乳酸酚棉蘭載玻片上顯微鏡下觀察孢子和菌絲形態(tài)、特征、大小和排列等。第11頁六胺銀染色涂片（痰需消化，無菌液體離心）甲醇固定后自然風(fēng)干過碘酸滴染10分鐘，溶液用后棄去流水沖洗（3遍）65℃銀溶染液1h-1.5h染色時間依據(jù)涂片厚度所懷疑真菌種類，通常念珠菌染色1h即可，疑為曲霉或者其它絲狀真菌須適當(dāng)延長染色時間（銀溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配，只用一次）流水沖洗（3遍）0.25%氯化金染1到2分鐘（可重復(fù)使用）流水沖洗3%硫代硫酸鈉染1分鐘流水沖洗0.1%亮綠染色30秒到1分鐘

目標(biāo)使得到一個背景色

顯微鏡檢驗方法菌體包囊壁呈黑色第12頁曲霉菌鏡下形態(tài)特點菌絲體形態(tài)曲霉菌絲有隔膜，為多細(xì)胞霉菌。分枝（

45℃角）有分枝足細(xì)胞分生孢子梗頂端膨大成為頂囊，普通呈球形。第13頁煙曲霉菌落特點培養(yǎng)特征：生長快45℃仍可生長開始為白色2-3日后轉(zhuǎn)為藍(lán)綠色后面無色或黃褐色表面粉末狀煙曲霉菌落,PDA,25℃,7d第14頁鏡下形態(tài)分生孢子頭短粗型，梗光滑，4/5小梗覆蓋，倒立燒瓶狀頂囊，頂囊有單層小梗小分生孢子呈球形，綠色，有小刺第15頁鏡下形態(tài)足細(xì)胞頂囊第16頁17判別關(guān)鍵點45℃生長良好，菌落呈藍(lán)綠色頂囊呈燒瓶狀，小梗為單層，與雙層土曲霉，雜色曲霉，構(gòu)巢曲霉相區(qū)分頂囊單層和雙層兩種瓶梗黃曲霉和黑曲霉判別，藍(lán)綠色可與綠曲霉和棒曲霉判別第17頁形態(tài)學(xué)觀察

黃曲霉菌落特征

－生長快

－孢子黃色

－表面粉末狀第18頁黑曲霉菌落特征生長快

PDA培養(yǎng)基菌落初為白色繼而黑色后面無色或中央略褐色厚絨狀氣生菌絲多第19頁鏡下形態(tài)分生孢子頭疏松放射狀，梗無色，小梗為單層，雙層，或單雙層同時生于一個頂囊，成放射狀小分生孢子呈球形或梨形，表面粗糙第20頁鏡下形態(tài)分生孢子*400分生孢子*1000第21頁判別關(guān)鍵點

頂囊有單層和雙層瓶梗，可與煙曲霉，土曲霉以及雜色曲霉和構(gòu)巢曲霉相判別。分生孢子梗光滑，無色至褐色，菌落初為白繼而黑色，可與黃曲霉判別。第22頁形態(tài)學(xué)觀察

土曲霉菌落特征 －生長快 －菌落圓形 －孢子淡棕色或棕色第23頁形態(tài)學(xué)觀察構(gòu)巢曲霉綠色，淺黃到黃色（正面）紫紅色到橄欖色（后面）頂囊（半球形或燒瓶狀）小梗雙層，第一層略長孢子(球形，粗糙，成鏈排列)第24頁形態(tài)學(xué)觀察雜色曲霉菌落特征菌落生長慢緊密、圓形絨毛狀到羊毛狀顏色數(shù)種，從青綠到紅綠第25頁曲霉菌形態(tài)特點曲霉菌菌落顏色分生孢子頭分生孢子梗瓶梗正面反面煙曲霉灰綠、藍(lán)綠淺黃柱狀滑壁，無色或綠色單層黃曲霉黃-綠黃,褐放射狀，成熟變柱狀粗糙、無色單層、雙層黑曲霉黑白,淺黃放射狀，成熟變疏松滑壁，無色或棕色單層、雙層土曲霉棕,肉桂淺黃、棕色柱狀滑壁,無色雙層構(gòu)巢曲霉綠、淺黃淺紫、紅,橄欖色短柱狀滑壁，棕色雙層雜色曲霉白、淺黃、黃、粉黃、灰白、綠白,黃,淺紫、紅放射狀滑壁,無色雙層第26頁青霉屬培養(yǎng)特征橘青霉PDA培養(yǎng)基上25-28℃生長較快，菌落表面呈絨狀，少數(shù)為絮狀，表面為藍(lán)色或灰綠色，后面黃色至橙色。繩狀青霉表面白色至粉色，有時有藍(lán)綠色區(qū)域。馬爾尼菲青霉初為灰白色蠟樣，膜狀平坦菌落，逐步變成淡黃，黃綠色，后面紅色2周左右表面呈淡紅色絨毛狀，整個培養(yǎng)基被染成玫瑰紅色第27頁菌落特點第28頁鏡下形態(tài)分生孢子梗大多從基質(zhì)長出，或氣生菌絲生長，每個梗基上簇生6-10個平行而略密小梗，形成特征性帚狀枝。第29頁臨床意義橘青霉可引發(fā)腎臟損害，有弱致癌性；繩狀青霉可引發(fā)大米變質(zhì)并引發(fā)中毒；馬爾尼菲青霉引發(fā)皮膚結(jié)節(jié)，皮下膿腫及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)感染，預(yù)后兇險。第30頁鏈格孢屬培養(yǎng)特征SDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，生長快速，形成棉絮狀，后變?yōu)榫G褐色至深褐色，后面為黑色。第31頁鏡下形態(tài)——分生孢子梗直立，暗色，分隔，單生或分枝狀。分生孢子磚格狀，倒棍棒狀，有尖，光滑或粗糙，水平，垂直，或斜形分隔。第32頁臨床意義鏈格孢可引發(fā)皮下組織膿腫和潰瘍，還可引發(fā)足菌腫。第33頁病例分析現(xiàn)病史女，78歲，天津東麗區(qū)人，患者因重復(fù)咳嗽咳痰、憋喘十余年加重5天、神志不清1天入院。入院5天前出現(xiàn)咳嗽咳痰加重，痰液呈黃粘狀不易咳出，于當(dāng)?shù)匦l(wèi)生院就診，給予平喘消炎治療（消炎藥未知）未見好轉(zhuǎn)，喘息加重。1天前神志不清，我院急診查血氣，顯示II型呼衰，進(jìn)行器官插管，收入ICU。第34頁病例分析既往史長久吸煙史、糖尿病史、高血壓史，長久使用“野藥”（可疑激素）史。第35頁病例分析入院檢驗體溫37.2℃，昏迷、對光反射消失，雙肺呼吸音粗，可聞及干濕性羅音，心率24BPM，血壓無法測出；白細(xì)胞12.42*109/L，PCT7.66ng/ml，微生物動態(tài)真菌監(jiān)測41.45ng/ml。肺炎支原體培養(yǎng)陽性，痰培養(yǎng)為多重耐藥鮑曼不動桿菌肺CT提醒：雙肺下葉炎性病變，考慮右肺中葉膨脹不全，雙肺間質(zhì)性改變，雙肺肺氣腫，雙肺索條狀及鈣化點。第36頁病例分析第37頁病例分析治療及轉(zhuǎn)歸給予阿奇霉素和舒普深治療，同時使用甲強(qiáng)龍擴(kuò)張氣道平喘，不排除肺真菌感染可能性，繼續(xù)行痰培養(yǎng)和真菌培養(yǎng)檢驗3月27日真菌培養(yǎng)結(jié)果為煙曲霉，加伏立康唑治療。3月30日，患者氣道痙攣較前好轉(zhuǎn)，喘憋減輕。3月31日，PCT1.03ng/ml，患者氣道痙攣顯著好轉(zhuǎn)，喘憋減輕，適當(dāng)下調(diào)呼吸機(jī)條件，雙肺呼吸音低，可聞少許濕羅音。第38頁病例分析培養(yǎng)基鏡下形態(tài)第39頁病例分析治療及轉(zhuǎn)歸4月12日，脫機(jī)；4月17日，兩次痰真菌培養(yǎng)陰性，微生物動態(tài)真菌監(jiān)測陰性，伏立康唑用足療程，決定停藥；4月22日，脫機(jī)9日，患者COPD，但不能脫離無創(chuàng)機(jī)械通氣輔助，提醒預(yù)后不良，家眷拒絕再次插管；4月25日，患者自動出院。第40頁病例分析WBCNEUHGBPCTG試驗3.2312.4284.4%997.6641.453.2611.1493.7%1068.33125.304.79.8185.9%910.53103.404.1210.1685.8%761.29＜10第41頁病例分析分析患者入院痰培養(yǎng)提醒多重耐藥鮑曼不動桿菌，給予舒普深治療；后真菌培養(yǎng)提醒煙曲霉感染，給予伏立康唑治療后，病人病情顯著好轉(zhuǎn)；繼續(xù)行痰培養(yǎng)和真菌培養(yǎng)檢測，痰培養(yǎng)依舊提醒鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌；考慮應(yīng)用舒普深造成腸道菌群失調(diào)逆行入患者氣道內(nèi)所產(chǎn)生感染，并非患者侵襲性肺病根本病原菌。第42頁病例分析二現(xiàn)病史女，65歲，河北省定州市人，入院前一周感咳嗽，為黃色黏痰，伴憋氣，伴雙下肢水腫，伴皮膚黏膜黃染加重，伴尿色加深，于年5月13日收入我院肝內(nèi)病區(qū)。既往史患者本身免疫性肝硬化病史，曾行食道靜脈曲張?zhí)自委?，低蛋白血癥，膽紅素顯著增高，肝功效貯備差，應(yīng)用激素治療。入院檢驗肝病面容，皮膚鞏膜重度黃染，體溫36.0℃，白細(xì)胞9.16*109/L，中性粒細(xì)胞百分比92.0%，HB105g/L，PCT0.35ng/ml。第43頁病例分析治療與轉(zhuǎn)歸5月14日，體溫37℃，咳嗽咳痰，行痰培養(yǎng)檢驗；5月15日，胸片提醒：雙下肺紋理增粗；患者長久服用激素，免疫力低下，易合并感染，考慮肺炎，給予拜福樂抗感染治療；5月20日，患者體溫38.2℃，咳嗽、咳痰、痰中帶血，CT提醒雙肺多發(fā)結(jié)節(jié)影及團(tuán)片狀致密影。第44頁病例分析5月21日，送檢痰培養(yǎng)；5月22日，痰培養(yǎng)回報懷疑曲霉菌感染，遂請呼吸科會診，不排除曲霉菌感染，送檢痰真菌培養(yǎng)，并加用伏立康唑。5月25日，葡聚糖105.70pg/ml，白細(xì)胞5.18*109/L，痰真菌培養(yǎng)提醒煙曲霉。第45頁病例分析第46頁病例分析第47頁病例分析莫西沙星抗感染胸CT提醒雙肺多發(fā)結(jié)節(jié)影及團(tuán)片狀致密影痰培養(yǎng)疑似曲霉菌