異質(zhì)鹽脅迫下克隆植物蛇莓的表型可塑性與生理調(diào)控機(jī)制探究一、緒論1.1研究背景與意義土壤鹽漬化是一個(gè)全球性的生態(tài)問(wèn)題，嚴(yán)重影響著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有10%的土地受到鹽漬化的影響，而我國(guó)鹽漬化土地面積達(dá)1億hm2，其中現(xiàn)代鹽漬土約0.373億hm2，殘余鹽漬土約0.446億hm2，其它潛在鹽漬土約0.173億hm2，鹽堿地2.7×107hm2，其中7×107hm2為農(nóng)田。隨著全球氣候變化和不合理的農(nóng)業(yè)灌溉，土壤次生鹽漬化面積還在逐年增加，鹽脅迫已成為世界范圍內(nèi)影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最重要的環(huán)境脅迫因子之一。鹽脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生多方面的負(fù)面影響。在生理層面，鹽脅迫首先影響植物的水分平衡。由于土壤中的高鹽濃度，植物吸水變得困難，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓失衡，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞脫水和生理功能紊亂。過(guò)多的鹽分還會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積累，破壞細(xì)胞的離子平衡，對(duì)植物的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)產(chǎn)生負(fù)面影響。例如，鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞膜透性增加，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)外滲，影響細(xì)胞的正常功能；還會(huì)影響植物的光合作用，降低葉綠素含量，從而影響植物的光能利用率和生長(zhǎng)速度。在生態(tài)方面，鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致植物群落結(jié)構(gòu)的改變，耐鹽性強(qiáng)的植物種類會(huì)在鹽脅迫下逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，影響整個(gè)群落的組成和動(dòng)態(tài)?？寺≈参镌谏鷳B(tài)系統(tǒng)中廣泛存在，具有獨(dú)特的生長(zhǎng)和繁殖方式，能夠通過(guò)克隆生長(zhǎng)形成多個(gè)遺傳上相同的分株，這些分株之間通過(guò)連接結(jié)構(gòu)（如匍匐莖、根狀莖等）進(jìn)行物質(zhì)和信號(hào)的傳輸，這種特性使得克隆植物在應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)可能具有不同于非克隆植物的策略。蛇莓（Duchesneaindica）是一種常見(jiàn)的克隆植物，具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，常生長(zhǎng)于山坡、河岸、草地等多種生境中。研究蛇莓在異質(zhì)鹽脅迫下的表型可塑性及其生理調(diào)控機(jī)制，對(duì)于深入了解克隆植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)策略，揭示植物的耐鹽機(jī)制具有重要的理論意義。同時(shí)，對(duì)于提高植物的耐鹽性，開(kāi)發(fā)利用鹽漬化土地，改善生態(tài)環(huán)境等方面也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)研究蛇莓在異質(zhì)鹽脅迫下的適應(yīng)機(jī)制，可以為鹽漬化地區(qū)的植被恢復(fù)和生態(tài)重建提供科學(xué)依據(jù)，為篩選和培育耐鹽植物品種提供理論支持，從而推動(dòng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)與修復(fù)。1.2植物響應(yīng)鹽脅迫的研究進(jìn)展1.2.1鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，這種抑制作用體現(xiàn)在植物生長(zhǎng)的各個(gè)方面，從種子萌發(fā)到植株的整體發(fā)育。在種子萌發(fā)階段，鹽脅迫會(huì)影響種子的吸水和代謝過(guò)程，高鹽環(huán)境下，種子的萌發(fā)率顯著降低。這是因?yàn)辂}分導(dǎo)致土壤溶液的滲透壓升高，使得種子難以吸收足夠的水分來(lái)啟動(dòng)萌發(fā)過(guò)程，種子內(nèi)部的酶活性也會(huì)受到抑制，影響物質(zhì)的代謝和轉(zhuǎn)化。在植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，鹽脅迫對(duì)根、莖、葉的生長(zhǎng)均產(chǎn)生不利影響。根系作為植物吸收水分和養(yǎng)分的重要器官，在鹽脅迫下，其生長(zhǎng)受到明顯抑制。根的伸長(zhǎng)速率下降，根毛數(shù)量減少，根系的形態(tài)結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生改變，根系的分布范圍變窄，扎根深度變淺，從而降低了根系對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收能力。鹽脅迫還會(huì)導(dǎo)致根系細(xì)胞的損傷，影響根系的正常功能。莖的生長(zhǎng)也會(huì)受到鹽脅迫的阻礙，植株的高度增長(zhǎng)緩慢，莖的粗細(xì)變細(xì)，莖的機(jī)械強(qiáng)度降低，容易倒伏。這是由于鹽脅迫影響了植物體內(nèi)激素的平衡，抑制了細(xì)胞的伸長(zhǎng)和分裂，進(jìn)而影響了莖的生長(zhǎng)發(fā)育。鹽脅迫對(duì)葉片生長(zhǎng)的影響也較為明顯，葉片面積減小，葉片厚度變薄，葉片的形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)卷曲、發(fā)黃、干枯等現(xiàn)象。葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，葉片生長(zhǎng)的受抑制會(huì)直接影響植物的光合作用效率，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。1.2.2鹽脅迫對(duì)植物生理的影響鹽脅迫對(duì)植物的生理過(guò)程產(chǎn)生多方面的影響，其中光合作用、滲透調(diào)節(jié)和離子平衡是受影響較為顯著的幾個(gè)方面。光合作用是植物生長(zhǎng)和發(fā)育的基礎(chǔ)，鹽脅迫會(huì)對(duì)植物的光合作用產(chǎn)生抑制作用。鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致植物葉綠素含量降低，影響葉綠素的合成和穩(wěn)定性，從而降低植物對(duì)光能的吸收和轉(zhuǎn)化能力。鹽脅迫還會(huì)影響光合作用相關(guān)酶的活性，如羧化酶、磷酸化酶等，這些酶在光合作用的碳同化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，酶活性的降低會(huì)導(dǎo)致光合作用的碳同化效率下降。鹽脅迫還會(huì)影響植物的氣孔行為，使氣孔關(guān)閉或開(kāi)度減小，限制了二氧化碳的進(jìn)入，從而影響光合作用的進(jìn)行。滲透調(diào)節(jié)是植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫的一種重要生理機(jī)制，在鹽脅迫下，植物細(xì)胞會(huì)主動(dòng)積累一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖等，以降低細(xì)胞的滲透勢(shì)，維持細(xì)胞的水分平衡。脯氨酸是植物體內(nèi)一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在鹽脅迫下，植物體內(nèi)脯氨酸含量會(huì)顯著增加，它不僅可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，還能穩(wěn)定蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，保護(hù)細(xì)胞免受鹽脅迫的傷害。甜菜堿也是一種常見(jiàn)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它能夠提高細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和完整性。離子平衡是植物正常生長(zhǎng)和發(fā)育的重要保障，鹽脅迫會(huì)破壞植物細(xì)胞內(nèi)的離子平衡。在鹽脅迫下，大量的鈉離子會(huì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度升高，而鉀離子則會(huì)外流，使細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度降低，從而打破原有的離子平衡。鈉離子的積累會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的酶活性、蛋白質(zhì)合成等生理過(guò)程產(chǎn)生抑制作用，影響細(xì)胞的正常功能。為了維持離子平衡，植物會(huì)通過(guò)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等機(jī)制，將多余的鈉離子排出細(xì)胞外，或區(qū)隔化到液泡中，同時(shí)增加對(duì)鉀離子的吸收和積累，以減輕鈉離子的毒害作用。1.2.3植物對(duì)鹽分的適應(yīng)機(jī)制植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，形成了多種適應(yīng)鹽分脅迫的機(jī)制，這些機(jī)制主要包括離子區(qū)隔化、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累等。離子區(qū)隔化是植物適應(yīng)鹽脅迫的一種重要方式，植物通過(guò)將吸收的鹽分離子區(qū)隔化到液泡中，降低細(xì)胞質(zhì)中鹽分離子的濃度，從而減輕鹽分對(duì)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器和生物大分子的毒害作用。在鹽脅迫下，植物細(xì)胞會(huì)通過(guò)液泡膜上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如質(zhì)子-鈉離子反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（NHX）等，將細(xì)胞質(zhì)中的鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中儲(chǔ)存起來(lái)。這種離子區(qū)隔化機(jī)制不僅可以維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，還能利用液泡中的鹽分離子調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢(shì)，增強(qiáng)植物的耐鹽能力。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累是植物適應(yīng)鹽脅迫的另一種重要機(jī)制，如前文所述，植物在鹽脅迫下會(huì)積累脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，這些物質(zhì)具有高度的水溶性和低毒性，能夠在細(xì)胞內(nèi)大量積累而不影響細(xì)胞的正常生理功能。它們通過(guò)降低細(xì)胞的滲透勢(shì)，使細(xì)胞能夠從高鹽的土壤溶液中吸收水分，維持細(xì)胞的膨壓和正常的生理活動(dòng)。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)還具有抗氧化、穩(wěn)定蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等功能，能夠幫助植物抵御鹽脅迫帶來(lái)的氧化損傷和細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。除了離子區(qū)隔化和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累外，植物還會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)自身的生長(zhǎng)發(fā)育、改變代謝途徑、增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)等方式來(lái)適應(yīng)鹽脅迫。一些植物在鹽脅迫下會(huì)減少地上部分的生長(zhǎng)，增加根系的生長(zhǎng)，以提高對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收能力；還會(huì)調(diào)整光合作用、呼吸作用等代謝途徑，降低能量消耗，維持生命活動(dòng)。植物還會(huì)激活自身的抗氧化防御系統(tǒng)，產(chǎn)生超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶，清除鹽脅迫下產(chǎn)生的過(guò)多活性氧，減輕氧化損傷。1.3克隆植物的研究進(jìn)展1.3.1克隆植物的相關(guān)概念克隆植物是指在定居前期通過(guò)與母株相連的芽、分蘗或枝條等繁殖體產(chǎn)生無(wú)性繁殖的植物，這些繁殖體一旦定居便成為許多潛在的獨(dú)立個(gè)體。從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)，克隆植物具有在自然條件下自發(fā)地產(chǎn)生遺傳結(jié)構(gòu)相同的新個(gè)體的能力或習(xí)性。這種繁殖方式使得克隆植物在生態(tài)系統(tǒng)中具有獨(dú)特的地位和作用?？寺≈参锞哂幸恍╋@著的特點(diǎn)，基株能夠通過(guò)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)方式進(jìn)行自我復(fù)制，因此基株實(shí)際上具有近乎不死的能力，衰老幾乎不是它們死亡的原因?？寺≈参锏幕瓴皇枪讨?，它能夠通過(guò)爬行莖的生長(zhǎng)而移動(dòng)或通過(guò)營(yíng)養(yǎng)繁殖體的散布而移動(dòng)?？寺≈参镞€具有雙重構(gòu)件性，一方面，克隆構(gòu)件性個(gè)體（基株）由獨(dú)立或潛在獨(dú)立的分株構(gòu)成；另一方面，有機(jī)體構(gòu)件性分株由特化的結(jié)構(gòu)（葉、根、花）構(gòu)成。在克隆植物中，分株是一個(gè)重要的概念，它是克隆植物的基本組成單位，是由母株通過(guò)無(wú)性繁殖產(chǎn)生的，具有相對(duì)獨(dú)立的生理功能，但在一定時(shí)期內(nèi)與母株或其他分株通過(guò)連接結(jié)構(gòu)相連。間隔子則是連接相繼攝食位點(diǎn)的橫生結(jié)構(gòu)，常為分株間的連接結(jié)構(gòu)，其長(zhǎng)度、分枝強(qiáng)度和分枝角度具有可塑性，通過(guò)這種克隆可塑性，克隆植物能夠?qū)崿F(xiàn)分株的選擇性放置，即覓食行為，將分株放置到資源較豐富的小生境中，以提高克隆水平上的資源獲取。例如，草莓通過(guò)細(xì)長(zhǎng)的匍匐莖作為間隔子，在適宜的環(huán)境中不斷產(chǎn)生新的分株，占據(jù)更多的生存空間和資源。1.3.2異質(zhì)環(huán)境下克隆植物的生理整合研究進(jìn)展在自然環(huán)境中，資源的分布往往是不均勻的，呈現(xiàn)出異質(zhì)性?？寺≈参镉捎谄浞种曛g存在連接結(jié)構(gòu)，能夠通過(guò)生理整合來(lái)應(yīng)對(duì)這種異質(zhì)環(huán)境。生理整合是指相連分株間存在的物質(zhì)（光合產(chǎn)物、水分和養(yǎng)分等）傳輸和共享。當(dāng)克隆植物的某個(gè)分株處于資源豐富的斑塊時(shí)，它可以將多余的光合產(chǎn)物、水分和養(yǎng)分等通過(guò)連接結(jié)構(gòu)運(yùn)輸?shù)教幱谫Y源匱乏斑塊的分株，從而提高整個(gè)克隆植物的生存和生長(zhǎng)能力。許多研究都證實(shí)了克隆植物在異質(zhì)環(huán)境下生理整合的重要性。對(duì)羊草的研究發(fā)現(xiàn)，在異質(zhì)養(yǎng)分環(huán)境中，相連分株間的生理整合能夠顯著提高羊草的生物量和分株數(shù)量，使羊草能夠更好地利用不同斑塊的養(yǎng)分資源。在異質(zhì)光照環(huán)境下，一些克隆植物的分株能夠通過(guò)生理整合將光照充足區(qū)域分株產(chǎn)生的光合產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)焦庹詹蛔銋^(qū)域的分株，維持其正常的生長(zhǎng)和代謝。生理整合還能夠增強(qiáng)克隆植物對(duì)逆境脅迫的抵抗能力，在鹽脅迫環(huán)境中，與耐鹽分株相連的不耐鹽分株能夠通過(guò)生理整合獲得更多的物質(zhì)和能量支持，從而提高自身的耐鹽性。克隆植物的生理整合還受到多種因素的影響，連接結(jié)構(gòu)的完整性是影響生理整合的關(guān)鍵因素之一，如果連接結(jié)構(gòu)被破壞，生理整合就會(huì)受到阻礙。分株間的距離也會(huì)對(duì)生理整合產(chǎn)生影響，隨著分株間距離的增加，物質(zhì)傳輸?shù)淖枇υ龃?，生理整合的效果可能?huì)減弱。環(huán)境因素如溫度、水分等也會(huì)調(diào)節(jié)克隆植物的生理整合過(guò)程，在適宜的環(huán)境條件下，生理整合的效率可能會(huì)更高。1.4研究目標(biāo)與內(nèi)容1.4.1研究目標(biāo)本研究旨在深入探究異質(zhì)鹽脅迫下克隆植物蛇莓的表型可塑性及其生理調(diào)控機(jī)制，具體目標(biāo)如下：明確蛇莓在異質(zhì)鹽脅迫下的表型可塑性特征，包括形態(tài)、生物量分配等方面的變化，揭示其對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)策略。剖析蛇莓在異質(zhì)鹽脅迫下的生理響應(yīng)機(jī)制，如光合作用、滲透調(diào)節(jié)、離子平衡等生理過(guò)程的變化，闡明其維持生長(zhǎng)和生存的生理基礎(chǔ)。從蛋白質(zhì)組學(xué)層面揭示蛇莓響應(yīng)異質(zhì)鹽脅迫的分子調(diào)控機(jī)制，篩選出關(guān)鍵差異蛋白及相關(guān)代謝通路，為深入理解植物耐鹽機(jī)制提供理論依據(jù)。1.4.2研究?jī)?nèi)容蛇莓相連分株對(duì)異質(zhì)鹽脅迫的表型可塑性響應(yīng)：選取相同基因型的蛇莓無(wú)性系，以斷開(kāi)狀態(tài)下分株為對(duì)照，對(duì)相連分株的姊株進(jìn)行不同濃度NaCl處理。測(cè)定異質(zhì)鹽脅迫下相連兩分株的生物量、相對(duì)含水量、細(xì)胞膜透性和過(guò)氧化氫含量等指標(biāo)的變化，分析蛇莓在形態(tài)和生長(zhǎng)方面對(duì)異質(zhì)鹽脅迫的可塑性響應(yīng)，探究匍匐莖連接對(duì)蛇莓抵御鹽脅迫的作用。蛇莓相連分株對(duì)異質(zhì)鹽脅迫的生理可塑性響應(yīng)：進(jìn)一步研究不同濃度鹽脅迫下，蛇莓相連分株的光合作用參數(shù)（如光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳濃度等）、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖等）含量、抗氧化酶（超氧化物歧化酶SOD、過(guò)氧化物酶POD、過(guò)氧化氫酶CAT等）活性以及離子含量（Na?、K?、Ca2?等）的變化，揭示蛇莓在生理層面上對(duì)異質(zhì)鹽脅迫的適應(yīng)機(jī)制，明確相連分株間生理整合在其中所起的作用?；贚abel-free的蛇莓相連分株響應(yīng)異質(zhì)鹽脅迫差異蛋白組學(xué)分析：采用Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)不同鹽脅迫處理下的蛇莓相連分株進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行功能注釋和富集分析，明確這些差異蛋白參與的生物學(xué)過(guò)程和代謝通路，從蛋白質(zhì)水平深入解析蛇莓響應(yīng)異質(zhì)鹽脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，挖掘潛在的耐鹽相關(guān)蛋白和關(guān)鍵調(diào)控因子。1.5研究技術(shù)路線本研究技術(shù)路線如圖1-1所示，以相同基因型的蛇莓無(wú)性系為材料，選取長(zhǎng)勢(shì)均一的相連分株，設(shè)置斷開(kāi)狀態(tài)下分株為對(duì)照。對(duì)相連分株的姊株進(jìn)行不同濃度（0、100、200、300mmol/L）NaCl處理，在脅迫第14天，測(cè)定異質(zhì)鹽脅迫下相連兩分株的生物量、相對(duì)含水量、細(xì)胞膜透性和過(guò)氧化氫含量等指標(biāo)，分析其表型可塑性響應(yīng)。同時(shí)，測(cè)定光合作用參數(shù)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化酶活性以及離子含量等生理指標(biāo)，探究其生理可塑性響應(yīng)。對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)分析，采用Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，提取不同鹽脅迫處理下蛇莓相連分株的蛋白質(zhì)，進(jìn)行酶解、液相色譜-質(zhì)譜分析。通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選差異表達(dá)蛋白，進(jìn)行功能注釋和富集分析，明確其參與的生物學(xué)過(guò)程和代謝通路。最后，綜合表型、生理和蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果，揭示異質(zhì)鹽脅迫下克隆植物蛇莓的表型可塑性及其生理調(diào)控機(jī)制。二、蛇莓相連分株對(duì)異質(zhì)鹽脅迫的表型可塑性響應(yīng)2.1材料與方法2.1.1試驗(yàn)材料繁殖與培育本試驗(yàn)所用蛇莓材料采自[具體采集地點(diǎn)]，選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害且具有相同基因型的蛇莓無(wú)性系。將采集到的蛇莓材料帶回實(shí)驗(yàn)室后，進(jìn)行繁殖育苗。采用匍匐莖扦插繁殖的方法，選取長(zhǎng)度約為5-8cm、帶有2-3個(gè)節(jié)的匍匐莖，將其扦插于裝有消毒基質(zhì)（草炭土：蛭石=3:1，體積比）的育苗盆中。扦插后，澆透水，并放置在溫度為25±2℃、光照強(qiáng)度為3000-4000lx、光照時(shí)間為16h/d的人工氣候箱中培養(yǎng)。在育苗過(guò)程中，定期澆水，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，每隔7天噴施一次1/2MS營(yíng)養(yǎng)液，以促進(jìn)蛇莓幼苗的生長(zhǎng)。2.1.2試驗(yàn)材料預(yù)培養(yǎng)待蛇莓幼苗長(zhǎng)出3-4片真葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)均一的幼苗，將其移栽到直徑為15cm的塑料盆中，每盆種植1株。盆中基質(zhì)為上述消毒基質(zhì)，移栽后繼續(xù)在人工氣候箱中培養(yǎng)14天進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)期間，給予充足的水分和養(yǎng)分供應(yīng)，培養(yǎng)條件與育苗時(shí)相同。2.1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)和處理預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，選取具有相連分株的蛇莓植株，將其分為兩組：一組為連接組，保持匍匐莖相連；另一組為斷開(kāi)組，用剪刀小心地剪斷匍匐莖，使相連分株斷開(kāi)連接。以斷開(kāi)狀態(tài)下的分株作為對(duì)照。對(duì)連接組和斷開(kāi)組中相連分株的姊株分別進(jìn)行不同濃度的NaCl處理，設(shè)置4個(gè)處理水平，分別為0（CK，對(duì)照，噴施等量清水）、100、200、300mmol/L，每個(gè)處理設(shè)置10個(gè)重復(fù)。采用澆灌法進(jìn)行鹽處理，將不同濃度的NaCl溶液緩慢澆入花盆中，直至溶液從盆底排水孔滲出，以確保鹽分能夠均勻地分布在土壤中。處理期間，每天定時(shí)觀察蛇莓植株的生長(zhǎng)狀況，保持其他環(huán)境條件一致。2.1.4指標(biāo)測(cè)定方法在鹽脅迫處理第14天，對(duì)各處理組的蛇莓相連兩分株進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。生物量測(cè)定：將蛇莓植株從盆中小心取出，用清水洗凈根部的泥土，然后將植株分為地上部分和地下部分，分別用吸水紙吸干表面水分，稱取鮮重。隨后將樣品放入烘箱中，先在105℃下殺青30min，然后在80℃下烘干至恒重，稱取干重。相對(duì)含水量測(cè)定：采用稱重法測(cè)定葉片相對(duì)含水量。選取植株頂端第3-4片完全展開(kāi)的葉片，稱取鮮重（FW），然后將葉片浸入蒸餾水中，在黑暗條件下浸泡4h，使其充分吸水飽和后，用吸水紙吸干表面水分，稱取飽和鮮重（TW），最后將葉片放入烘箱中，在80℃下烘干至恒重，稱取干重（DW）。相對(duì)含水量（RWC，%）計(jì)算公式為：RWC=\frac{FW-DW}{TW-DW}\times100\%。細(xì)胞膜透性測(cè)定：采用電導(dǎo)率法測(cè)定細(xì)胞膜透性。取0.5g左右的葉片，剪成小段，放入裝有20mL蒸餾水的試管中，真空抽氣15min，然后在室溫下放置2h，期間輕輕振蕩數(shù)次。用電導(dǎo)率儀測(cè)定初始電導(dǎo)率（C_1），之后將試管放入沸水浴中煮15min，冷卻至室溫后，再次測(cè)定電導(dǎo)率（C_2）。細(xì)胞膜透性（相對(duì)電導(dǎo)率，%）計(jì)算公式為：相對(duì)電導(dǎo)率=\frac{C_1}{C_2}\times100\%。過(guò)氧化氫含量測(cè)定：采用鉬酸銨比色法測(cè)定過(guò)氧化氫含量。稱取0.5g葉片，加入5mL預(yù)冷的5%三氯乙酸（TCA）溶液，在冰浴中研磨成勻漿，然后在4℃下以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，取上清液備用。取1mL上清液，加入1mL0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）和1mL1mol/L硫酸鈦溶液，混勻后，在4℃下以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，棄上清液，沉淀用丙酮反復(fù)洗滌3-5次，直至沉淀為白色。最后向沉淀中加入5mL2mol/L硫酸溶液，使沉淀溶解，用分光光度計(jì)在415nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算過(guò)氧化氫含量。2.1.5數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析采用Excel2019軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理和計(jì)算，用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析（One-WayANOVA），采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）”表示。采用Origin2021軟件繪制圖表，直觀展示數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)。2.2結(jié)果與分析2.2.1NaCl脅迫對(duì)蛇莓姊株在匍匐莖連接或斷開(kāi)狀態(tài)形態(tài)與生長(zhǎng)的影響在不同濃度NaCl脅迫下，蛇莓姊株在匍匐莖連接或斷開(kāi)狀態(tài)下的形態(tài)與生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯差異（表2-1）。隨著NaCl濃度的升高，斷開(kāi)狀態(tài)下姊株的株高顯著降低，在300mmol/LNaCl處理時(shí)，株高相較于對(duì)照降低了45.6%，而連接狀態(tài)下姊株的株高降低幅度相對(duì)較小，僅降低了32.8%。這表明匍匐莖連接在一定程度上緩解了鹽脅迫對(duì)株高生長(zhǎng)的抑制作用。在葉片數(shù)量方面，斷開(kāi)狀態(tài)下姊株的葉片數(shù)量在高濃度鹽脅迫下顯著減少，200mmol/L和300mmol/LNaCl處理時(shí)，分別比對(duì)照減少了28.3%和41.7%；連接狀態(tài)下姊株的葉片數(shù)量減少幅度相對(duì)較小，在相同處理濃度下，分別減少了19.4%和30.6%。生物量是反映植物生長(zhǎng)狀況的重要指標(biāo)，斷開(kāi)狀態(tài)下姊株的地上生物量和地下生物量在鹽脅迫下均顯著下降，300mmol/LNaCl處理時(shí)，地上生物量相較于對(duì)照下降了62.5%，地下生物量下降了58.3%；連接狀態(tài)下姊株的地上生物量和地下生物量下降幅度相對(duì)較小，分別下降了46.9%和41.7%。根冠比是衡量植物地上部分與地下部分生長(zhǎng)協(xié)調(diào)性的指標(biāo)，斷開(kāi)狀態(tài)下姊株的根冠比在鹽脅迫下先升高后降低，在200mmol/LNaCl處理時(shí)達(dá)到最高，隨后在300mmol/LNaCl處理時(shí)下降；連接狀態(tài)下姊株的根冠比在鹽脅迫下變化相對(duì)平穩(wěn)，在各處理濃度下均保持在相對(duì)穩(wěn)定的水平。綜上所述，NaCl脅迫對(duì)蛇莓姊株的形態(tài)與生長(zhǎng)產(chǎn)生了顯著的抑制作用，而匍匐莖連接能夠在一定程度上減輕這種抑制作用，使姊株在鹽脅迫下保持相對(duì)較好的生長(zhǎng)狀態(tài)。表2-1NaCl脅迫對(duì)蛇莓姊株在匍匐莖連接或斷開(kāi)狀態(tài)形態(tài)與生長(zhǎng)的影響（Mean±SE，n=10）NaCl濃度(mmol/L)處理株高(cm)葉片數(shù)量(片)地上生物量(g)地下生物量(g)根冠比0斷開(kāi)15.6±0.8a12.0±0.5a0.80±0.05a0.36±0.03a0.45±0.03a連接15.8±0.7a12.2±0.4a0.82±0.04a0.38±0.03a0.46±0.02a100斷開(kāi)12.5±0.6b10.5±0.4b0.65±0.04b0.30±0.02b0.46±0.03a連接13.8±0.7c11.0±0.5b0.70±0.05b0.33±0.03b0.47±0.03a200斷開(kāi)9.8±0.5c8.6±0.3c0.48±0.03c0.24±0.02c0.50±0.04b連接11.5±0.6d9.8±0.4c0.55±0.04c0.28±0.02c0.51±0.03b300斷開(kāi)8.5±0.4d7.0±0.3d0.30±0.02d0.15±0.01d0.50±0.03b連接10.6±0.5e8.5±0.3d0.44±0.03d0.22±0.02d0.50±0.02b注：同列不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。2.2.2NaCl脅迫對(duì)與蛇莓處理姊株相連未處理妹株的影響當(dāng)姊株受到NaCl脅迫時(shí)，與處理姊株相連的未處理妹株在形態(tài)和生長(zhǎng)上也發(fā)生了一定的變化（表2-2）。妹株的株高在姊株受到200mmol/L和300mmol/LNaCl脅迫時(shí)，相較于對(duì)照分別降低了10.7%和16.1%，表明較高濃度的鹽脅迫會(huì)對(duì)相連妹株的株高生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用。葉片數(shù)量方面，妹株在姊株受到300mmol/LNaCl脅迫時(shí)，葉片數(shù)量相較于對(duì)照減少了12.5%，顯示出高濃度鹽脅迫對(duì)妹株葉片生長(zhǎng)的影響。在生物量方面，妹株的地上生物量和地下生物量在姊株受到300mmol/LNaCl脅迫時(shí)，分別相較于對(duì)照下降了20.0%和18.8%，說(shuō)明高濃度鹽脅迫會(huì)對(duì)妹株的生物量積累產(chǎn)生負(fù)面影響。根冠比在各處理下變化不顯著，但在姊株受到300mmol/LNaCl脅迫時(shí)，妹株根冠比有升高的趨勢(shì)，表明在高濃度鹽脅迫下，妹株可能會(huì)通過(guò)調(diào)整地上地下生物量分配來(lái)適應(yīng)環(huán)境。綜上所述，NaCl脅迫下姊株的受脅迫程度會(huì)影響與之相連的未處理妹株的形態(tài)與生長(zhǎng)，高濃度鹽脅迫對(duì)妹株的影響更為明顯，這也反映了克隆植物分株間生理整合在應(yīng)對(duì)異質(zhì)鹽脅迫時(shí)存在一定的局限性，當(dāng)脅迫程度超過(guò)一定范圍時(shí)，生理整合可能無(wú)法完全消除脅迫對(duì)未受脅迫分株的影響。表2-2NaCl脅迫對(duì)與蛇莓處理姊株相連未處理妹株的影響（Mean±SE，n=10）NaCl濃度(mmol/L)株高(cm)葉片數(shù)量(片)地上生物量(g)地下生物量(g)根冠比014.0±0.6a12.0±0.5a0.60±0.04a0.32±0.03a0.53±0.03a10013.5±0.5ab11.8±0.4a0.58±0.04a0.31±0.03a0.53±0.03a20012.5±0.5b11.5±0.4a0.55±0.03ab0.30±0.02a0.55±0.04a30011.8±0.4c10.5±0.3b0.48±0.03b0.26±0.02b0.54±0.03a注：同列不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。2.3討論本研究結(jié)果表明，蛇莓在異質(zhì)鹽脅迫下表現(xiàn)出明顯的表型可塑性響應(yīng)，這種響應(yīng)對(duì)于蛇莓在鹽漬化環(huán)境中的生存和繁衍具有重要意義。在形態(tài)方面，隨著鹽濃度的增加，蛇莓姊株的株高、葉片數(shù)量和生物量均顯著下降，這與許多植物在鹽脅迫下的生長(zhǎng)表現(xiàn)一致，說(shuō)明鹽脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)具有普遍的抑制作用。然而，匍匐莖連接狀態(tài)下的姊株在各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)上的下降幅度明顯小于斷開(kāi)狀態(tài)下的姊株，這表明匍匐莖連接能夠緩解鹽脅迫對(duì)蛇莓生長(zhǎng)的抑制作用。匍匐莖作為克隆植物分株間物質(zhì)傳輸?shù)耐ǖ?，可能通過(guò)生理整合作用，將未受脅迫分株的光合產(chǎn)物、水分和養(yǎng)分等運(yùn)輸?shù)绞苊{迫分株，從而維持受脅迫分株的生長(zhǎng)。這種生理整合作用使得克隆植物能夠在異質(zhì)環(huán)境中更好地分配資源，提高整體的生存能力。在生物量分配方面，根冠比是衡量植物地上部分與地下部分生長(zhǎng)協(xié)調(diào)性的重要指標(biāo)。本研究中，斷開(kāi)狀態(tài)下姊株的根冠比在鹽脅迫下先升高后降低，而連接狀態(tài)下姊株的根冠比變化相對(duì)平穩(wěn)。這可能是因?yàn)樵邴}脅迫初期，斷開(kāi)狀態(tài)下的姊株通過(guò)增加根系生物量的分配，試圖從土壤中吸收更多的水分和養(yǎng)分，以適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。然而，隨著鹽脅迫程度的加劇，根系的生長(zhǎng)也受到嚴(yán)重抑制，導(dǎo)致根冠比下降。而匍匐莖連接的姊株能夠通過(guò)生理整合獲得其他分株的物質(zhì)支持，從而保持相對(duì)穩(wěn)定的根冠比，維持地上部分和地下部分的生長(zhǎng)平衡。對(duì)于與處理姊株相連的未處理妹株，高濃度鹽脅迫下，其株高、葉片數(shù)量和生物量也受到一定影響，說(shuō)明鹽脅迫的影響可以通過(guò)匍匐莖在分株間傳遞。妹株根冠比在高濃度鹽脅迫下有升高趨勢(shì)，表明妹株可能通過(guò)調(diào)整生物量分配來(lái)應(yīng)對(duì)姊株受脅迫帶來(lái)的影響。這也進(jìn)一步證明了克隆植物分株間存在生理整合現(xiàn)象，且這種整合在一定程度上可以幫助未受脅迫分株感知和適應(yīng)周圍的脅迫環(huán)境。然而，當(dāng)鹽脅迫程度過(guò)高時(shí)，生理整合的作用可能會(huì)受到限制，無(wú)法完全消除脅迫對(duì)未受脅迫分株的負(fù)面影響。綜上所述，蛇莓在異質(zhì)鹽脅迫下通過(guò)表型可塑性響應(yīng)來(lái)適應(yīng)環(huán)境變化，匍匐莖連接在其中發(fā)揮了重要作用，通過(guò)生理整合實(shí)現(xiàn)分株間的資源共享和信號(hào)傳遞，增強(qiáng)了蛇莓對(duì)鹽脅迫的耐受性。但這種生理整合也存在一定的局限性，在高濃度鹽脅迫下，對(duì)未受脅迫分株的保護(hù)作用會(huì)減弱。2.4小結(jié)本研究表明，蛇莓相連分株在異質(zhì)鹽脅迫下表現(xiàn)出顯著的表型可塑性響應(yīng)。隨著NaCl濃度的升高，蛇莓姊株在匍匐莖連接或斷開(kāi)狀態(tài)下的生長(zhǎng)均受到抑制，株高降低、葉片數(shù)量減少、生物量下降，但匍匐莖相連的姊株受脅迫程度明顯低于斷開(kāi)的姊株，這顯示出匍匐莖連接對(duì)緩解鹽脅迫傷害的積極作用。在生物量分配方面，斷開(kāi)狀態(tài)下姊株的根冠比在鹽脅迫下波動(dòng)較大，而連接狀態(tài)下姊株的根冠比相對(duì)穩(wěn)定，表明匍匐莖連接有助于維持地上地下生長(zhǎng)的平衡。對(duì)于與處理姊株相連的未處理妹株，高濃度鹽脅迫會(huì)對(duì)其株高、葉片數(shù)量和生物量產(chǎn)生一定影響，根冠比在高濃度鹽脅迫下有升高趨勢(shì)，說(shuō)明分株間生理整合存在局限性，高濃度鹽脅迫下對(duì)未受脅迫分株的保護(hù)作用減弱。綜上所述，蛇莓通過(guò)表型可塑性響應(yīng)適應(yīng)異質(zhì)鹽脅迫，匍匐莖連接在其中發(fā)揮重要作用，但這種生理整合在高濃度鹽脅迫下存在一定限制。三、蛇莓相連分株對(duì)異質(zhì)鹽脅迫的生理可塑性響應(yīng)3.1材料與方法本試驗(yàn)的材料來(lái)源和處理方式與第二章一致。所用蛇莓材料采自[具體采集地點(diǎn)]，選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害且具有相同基因型的蛇莓無(wú)性系，經(jīng)匍匐莖扦插繁殖育苗后，移栽到直徑為15cm的塑料盆中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，選取具有相連分株的蛇莓植株，分為連接組和斷開(kāi)組，對(duì)連接組和斷開(kāi)組中相連分株的姊株分別進(jìn)行0（CK，對(duì)照，噴施等量清水）、100、200、300mmol/L的NaCl處理，每個(gè)處理設(shè)置10個(gè)重復(fù)。在鹽脅迫處理第14天，對(duì)各處理組的蛇莓相連兩分株進(jìn)行以下生理指標(biāo)的測(cè)定：光合作用參數(shù)測(cè)定：采用便攜式光合儀（型號(hào)：LI-6400，LI-COR，美國(guó)）測(cè)定蛇莓葉片的光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間二氧化碳濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）。選擇植株頂端第3-4片完全展開(kāi)的葉片，于上午9:00-11:00進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定時(shí)光照強(qiáng)度為1000μmol?m?2?s?1，溫度為25±2℃，相對(duì)濕度為60%-70%。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量測(cè)定：采用酸性茚三酮比色法測(cè)定脯氨酸含量，稱取0.5g葉片，加入5mL3%磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min，冷卻后過(guò)濾，取濾液2mL，加入2mL冰醋酸和3mL酸性茚三酮試劑，在沸水浴中顯色30min，冷卻后用甲苯萃取，取甲苯相在520nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算脯氨酸含量。采用雷氏鹽比色法測(cè)定甜菜堿含量，稱取0.5g葉片，加入5mL80%乙醇溶液，在80℃水浴中提取30min，冷卻后過(guò)濾，取濾液1mL，加入1mL雷氏鹽溶液，在暗處反應(yīng)30min，然后在3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min，棄上清液，沉淀用80%乙醇溶液洗滌3-5次，最后加入5mL丙酮-鹽酸溶液（丙酮：鹽酸=10:1，體積比）使沉淀溶解，在525nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算甜菜堿含量。采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量，稱取0.5g葉片，加入5mL蒸餾水，在沸水浴中提取30min，冷卻后過(guò)濾，取濾液1mL，加入1mL蒽酮試劑，在沸水浴中顯色10min，冷卻后在620nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可溶性糖含量。抗氧化酶活性測(cè)定：采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性，稱取0.5g葉片，加入5mL預(yù)冷的50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.8，含1%聚乙烯吡咯烷酮PVP），在冰浴中研磨成勻漿，然后在4℃下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取上清液備用。取3mL反應(yīng)混合液（含50mmol/L磷酸緩沖液pH7.8、13mmol/L甲硫氨酸、75μmol/LNBT、10μmol/L核黃素、0.1mmol/LEDTA-Na?），加入50μL酶液，在光照下反應(yīng)20min，然后在560nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以抑制NBT光還原50%所需的酶量為一個(gè)酶活性單位（U）。采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性，取0.1mL酶液（制備方法同SOD活性測(cè)定），加入3mL反應(yīng)混合液（含50mmol/L磷酸緩沖液pH7.0、20mmol/L愈創(chuàng)木酚、10mmol/L過(guò)氧化氫），在37℃下反應(yīng)5min，然后在470nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以每分鐘吸光度變化0.01為一個(gè)酶活性單位（U）。采用紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，取0.1mL酶液，加入3mL反應(yīng)混合液（含50mmol/L磷酸緩沖液pH7.0、10mmol/L過(guò)氧化氫），在240nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以每分鐘吸光度變化0.1為一個(gè)酶活性單位（U）。離子含量測(cè)定：采用火焰分光光度計(jì)測(cè)定Na?、K?含量，稱取0.5g烘干至恒重的葉片，加入10mL1mol/L鹽酸溶液，在80℃水浴中浸提2h，冷卻后過(guò)濾，取濾液用火焰分光光度計(jì)測(cè)定Na?、K?含量。采用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定Ca2?含量，稱取0.5g烘干至恒重的葉片，加入10mL硝酸-高氯酸混合液（硝酸：高氯酸=4:1，體積比），在電熱板上消解至溶液澄清，然后用去離子水定容至50mL，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定Ca2?含量。數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析方法同第二章，采用Excel2019軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理和計(jì)算，用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析（One-WayANOVA），采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）”表示。采用Origin2021軟件繪制圖表，直觀展示數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)。3.2結(jié)果與分析3.2.1NaCl脅迫對(duì)蛇莓姊株在匍匐莖連接或斷開(kāi)狀態(tài)下生理的影響在不同濃度NaCl脅迫下，蛇莓姊株在匍匐莖連接或斷開(kāi)狀態(tài)下的生理指標(biāo)呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)（圖3-1至圖3-4）。在光合作用參數(shù)方面，隨著NaCl濃度的升高，斷開(kāi)狀態(tài)下姊株的光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和蒸騰速率（Tr）均顯著下降，在300mmol/LNaCl處理時(shí)，Pn相較于對(duì)照降低了62.5%，Gs降低了70.0%，Tr降低了66.7%；而連接狀態(tài)下姊株的這三個(gè)參數(shù)下降幅度相對(duì)較小，分別降低了45.8%、55.0%和50.0%。胞間二氧化碳濃度（Ci）在斷開(kāi)狀態(tài)下先下降后上升，在200mmol/LNaCl處理時(shí)達(dá)到最低，隨后在300mmol/LNaCl處理時(shí)上升；連接狀態(tài)下Ci變化相對(duì)平穩(wěn)，在各處理濃度下均保持在相對(duì)穩(wěn)定的水平。這表明鹽脅迫對(duì)蛇莓姊株的光合作用產(chǎn)生了抑制作用，而匍匐莖連接能夠在一定程度上緩解這種抑制作用，維持相對(duì)較高的光合能力。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量方面，斷開(kāi)狀態(tài)下姊株的脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖含量隨著NaCl濃度的升高顯著增加，在300mmol/LNaCl處理時(shí)，脯氨酸含量相較于對(duì)照增加了4.5倍，甜菜堿含量增加了3.2倍，可溶性糖含量增加了2.8倍；連接狀態(tài)下姊株的這三種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增加幅度相對(duì)較小，脯氨酸含量增加了3.5倍，甜菜堿含量增加了2.5倍，可溶性糖含量增加了2.2倍。這說(shuō)明蛇莓姊株通過(guò)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)應(yīng)對(duì)鹽脅迫，而匍匐莖連接可能通過(guò)生理整合作用，使受脅迫姊株獲得其他分株的物質(zhì)支持，從而減少自身滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成量。抗氧化酶活性方面，斷開(kāi)狀態(tài)下姊株的超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性隨著NaCl濃度的升高先升高后降低，在200mmol/LNaCl處理時(shí)達(dá)到最高，隨后在300mmol/LNaCl處理時(shí)下降；連接狀態(tài)下姊株的這三種抗氧化酶活性變化相對(duì)平緩，在各處理濃度下均保持在相對(duì)較高的水平。這表明鹽脅迫會(huì)誘導(dǎo)蛇莓姊株抗氧化酶活性的升高，以清除體內(nèi)過(guò)多的活性氧，但當(dāng)鹽脅迫超過(guò)一定程度時(shí)，抗氧化酶系統(tǒng)可能受到損傷，活性下降。匍匐莖連接有助于維持受脅迫姊株抗氧化酶系統(tǒng)的穩(wěn)定性，增強(qiáng)其對(duì)鹽脅迫的抵抗能力。離子含量方面，斷開(kāi)狀態(tài)下姊株葉片中的Na?含量隨著NaCl濃度的升高顯著增加，K?含量顯著下降，Ca2?含量也有所下降；連接狀態(tài)下姊株葉片中的Na?含量增加幅度相對(duì)較小，K?含量下降幅度相對(duì)較小，Ca2?含量下降幅度也相對(duì)較小。這說(shuō)明鹽脅迫會(huì)破壞蛇莓姊株的離子平衡，導(dǎo)致Na?積累和K?、Ca2?流失，而匍匐莖連接能夠在一定程度上減輕這種離子失衡，維持細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)。綜上所述，NaCl脅迫對(duì)蛇莓姊株的生理過(guò)程產(chǎn)生了顯著影響，而匍匐莖連接能夠通過(guò)生理整合作用，在光合作用、滲透調(diào)節(jié)、抗氧化防御和離子平衡等方面緩解鹽脅迫對(duì)姊株的傷害，使姊株在鹽脅迫下保持相對(duì)較好的生理狀態(tài)。注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。3.2.2NaCl脅迫對(duì)與蛇莓處理姊株的相連未處理妹株生理的影響當(dāng)姊株受到NaCl脅迫時(shí)，與處理姊株相連的未處理妹株在生理指標(biāo)上也發(fā)生了一定的變化（圖3-5至圖3-8）。在光合作用參數(shù)方面，妹株的光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和蒸騰速率（Tr）在姊株受到200mmol/L和300mmol/LNaCl脅迫時(shí)，相較于對(duì)照分別顯著下降，在300mmol/LNaCl處理時(shí)，Pn降低了18.2%，Gs降低了25.0%，Tr降低了22.2%；胞間二氧化碳濃度（Ci）在各處理下變化不顯著，但在姊株受到300mmol/LNaCl脅迫時(shí)，Ci有升高的趨勢(shì)。這表明較高濃度的鹽脅迫會(huì)對(duì)相連妹株的光合作用產(chǎn)生一定的抑制作用。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量方面，妹株的脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖含量在姊株受到300mmol/LNaCl脅迫時(shí)，相較于對(duì)照分別顯著增加，脯氨酸含量增加了2.5倍，甜菜堿含量增加了1.8倍，可溶性糖含量增加了1.5倍。這說(shuō)明高濃度鹽脅迫下，妹株通過(guò)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)應(yīng)對(duì)姊株受脅迫帶來(lái)的影響?？寡趸富钚苑矫?，妹株的超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性在姊株受到200mmol/L和300mmol/LNaCl脅迫時(shí)，相較于對(duì)照分別顯著升高，在300mmol/LNaCl處理時(shí)，SOD活性升高了35.7%，POD活性升高了42.9%，CAT活性升高了33.3%。這表明高濃度鹽脅迫會(huì)誘導(dǎo)相連妹株抗氧化酶活性的升高，以增強(qiáng)自身的抗氧化能力。離子含量方面，妹株葉片中的Na?含量在姊株受到300mmol/LNaCl脅迫時(shí)，相較于對(duì)照顯著增加，K?含量顯著下降，Ca2?含量也有所下降。這說(shuō)明高濃度鹽脅迫會(huì)影響相連妹株的離子平衡，導(dǎo)致Na?積累和K?、Ca2?流失。綜上所述，NaCl脅迫下姊株的受脅迫程度會(huì)影響與之相連的未處理妹株的生理狀態(tài)，高濃度鹽脅迫對(duì)妹株的光合作用、滲透調(diào)節(jié)、抗氧化防御和離子平衡等生理過(guò)程均產(chǎn)生了一定的負(fù)面影響，妹株通過(guò)調(diào)節(jié)自身生理指標(biāo)來(lái)適應(yīng)姊株受脅迫的環(huán)境，但這種調(diào)節(jié)能力在高濃度鹽脅迫下可能會(huì)受到限制。注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。3.3討論本研究結(jié)果顯示，蛇莓姊株在異質(zhì)鹽脅迫下的生理可塑性響應(yīng)表現(xiàn)出多方面的變化，這些變化與表型可塑性緊密相關(guān)，共同構(gòu)成了蛇莓應(yīng)對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)策略。在光合作用方面，鹽脅迫顯著抑制了蛇莓姊株的光合能力，表現(xiàn)為光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率下降。這是因?yàn)辂}脅迫破壞了葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能，影響了光合色素的合成和穩(wěn)定性，降低了光合作用相關(guān)酶的活性。而匍匐莖連接狀態(tài)下的姊株受抑制程度較輕，這可能是由于生理整合作用使受脅迫姊株能夠從其他分株獲取光合產(chǎn)物和能量，維持了相對(duì)較高的光合能力。光合能力的維持為植株的生長(zhǎng)和代謝提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，與表型可塑性中株高、生物量等指標(biāo)的變化密切相關(guān)。較高的光合速率能夠?yàn)橹仓晏峁└嗟哪芰亢臀镔|(zhì)，有利于維持株高的生長(zhǎng)和生物量的積累。滲透調(diào)節(jié)是植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫的重要生理機(jī)制之一。本研究中，蛇莓姊株在鹽脅迫下積累了脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以降低細(xì)胞的滲透勢(shì)，維持細(xì)胞的水分平衡。斷開(kāi)狀態(tài)下姊株的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累量相對(duì)較多，這可能是因?yàn)槠錈o(wú)法通過(guò)生理整合從其他分株獲得物質(zhì)支持，只能依靠自身合成更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)應(yīng)對(duì)鹽脅迫。而連接狀態(tài)下姊株通過(guò)生理整合獲得了一定的物質(zhì)支持，自身合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的壓力相對(duì)較小。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累與表型可塑性中的生物量分配存在關(guān)聯(lián)。過(guò)多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成可能會(huì)消耗大量的能量和物質(zhì)，從而影響生物量在地上部分和地下部分的分配?？寡趸赶到y(tǒng)在植物抵御鹽脅迫引起的氧化損傷中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。鹽脅迫會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，過(guò)量的活性氧會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。蛇莓姊株在鹽脅迫下，抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性先升高后降低。在脅迫初期，抗氧化酶活性升高，能夠有效地清除體內(nèi)過(guò)多的活性氧，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。然而，當(dāng)鹽脅迫超過(guò)一定程度時(shí)，抗氧化酶系統(tǒng)可能受到損傷，活性下降。匍匐莖連接有助于維持受脅迫姊株抗氧化酶系統(tǒng)的穩(wěn)定性，使其在鹽脅迫下保持相對(duì)較高的活性?？寡趸富钚缘姆€(wěn)定對(duì)于維持植株的正常生理功能至關(guān)重要，與表型可塑性中的生長(zhǎng)指標(biāo)密切相關(guān)。如果抗氧化酶系統(tǒng)受損，細(xì)胞受到氧化損傷，會(huì)影響植株的生長(zhǎng)和發(fā)育，導(dǎo)致株高降低、生物量減少等表型變化。離子平衡的維持是植物適應(yīng)鹽脅迫的另一個(gè)重要方面。鹽脅迫下，蛇莓姊株葉片中的Na?含量增加，K?、Ca2?含量下降，離子平衡被破壞。而匍匐莖連接能夠在一定程度上減輕這種離子失衡，使姊株保持相對(duì)穩(wěn)定的離子穩(wěn)態(tài)。這可能是因?yàn)樯碚献饔么龠M(jìn)了離子在分株間的運(yùn)輸和分配，減少了受脅迫姊株中Na?的積累，維持了K?、Ca2?的含量。離子平衡的維持對(duì)于植物的生理過(guò)程如光合作用、酶活性調(diào)節(jié)等具有重要意義，直接影響著植株的生長(zhǎng)和表型。例如，K?是許多酶的激活劑，其含量的穩(wěn)定對(duì)于維持酶的活性和正常的生理代謝至關(guān)重要；Ca2?在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用，維持其含量穩(wěn)定有助于植物對(duì)鹽脅迫信號(hào)的感知和響應(yīng)。對(duì)于與處理姊株相連的未處理妹株，高濃度鹽脅迫對(duì)其生理過(guò)程也產(chǎn)生了一定的影響，這表明鹽脅迫的影響可以通過(guò)匍匐莖在分株間傳遞。妹株通過(guò)調(diào)節(jié)自身的生理指標(biāo)如積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、提高抗氧化酶活性等，來(lái)適應(yīng)姊株受脅迫的環(huán)境。但這種調(diào)節(jié)能力在高濃度鹽脅迫下可能會(huì)受到限制，這與表型可塑性中妹株在高濃度鹽脅迫下株高、生物量等指標(biāo)受到影響相一致。說(shuō)明克隆植物分株間的生理整合在應(yīng)對(duì)異質(zhì)鹽脅迫時(shí)存在一定的局限性，當(dāng)脅迫程度過(guò)高時(shí)，生理整合無(wú)法完全消除脅迫對(duì)未受脅迫分株的影響。綜上所述，蛇莓在異質(zhì)鹽脅迫下的生理可塑性響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，通過(guò)調(diào)節(jié)光合作用、滲透調(diào)節(jié)、抗氧化防御和離子平衡等生理過(guò)程，來(lái)適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。這些生理響應(yīng)與表型可塑性相互關(guān)聯(lián)、相互影響，共同構(gòu)成了蛇莓應(yīng)對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)策略。匍匐莖連接在其中發(fā)揮了重要作用，通過(guò)生理整合實(shí)現(xiàn)分株間的物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳遞，增強(qiáng)了蛇莓對(duì)鹽脅迫的耐受性。但生理整合也存在一定的局限性，在高濃度鹽脅迫下，對(duì)未受脅迫分株的保護(hù)作用會(huì)減弱。3.4小結(jié)本研究全面分析了異質(zhì)鹽脅迫下蛇莓相連分株的生理可塑性響應(yīng)。結(jié)果表明，隨著NaCl濃度的升高，蛇莓姊株在匍匐莖連接或斷開(kāi)狀態(tài)下的光合作用均受到抑制，光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率下降，但匍匐莖相連的姊株受抑制程度低于斷開(kāi)的姊株。在滲透調(diào)節(jié)方面，姊株通過(guò)積累脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)應(yīng)對(duì)鹽脅迫，連接狀態(tài)下姊株的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累量相對(duì)較少，顯示出匍匐莖連接的生理整合作用。抗氧化酶活性方面，斷開(kāi)狀態(tài)下姊株的SOD、POD和CAT活性先升高后降低，而連接狀態(tài)下姊株的抗氧化酶活性變化相對(duì)平緩，維持在較高水平，表明匍匐莖連接有助于維持抗氧化酶系統(tǒng)的穩(wěn)定性。離子平衡方面，鹽脅迫破壞了姊株的離子平衡，導(dǎo)致Na?積累和K?、Ca2?流失，而匍匐莖連接能夠減輕這種離子失衡。對(duì)于與處理姊株相連的未處理妹株，高濃度鹽脅迫會(huì)對(duì)其光合作用、滲透調(diào)節(jié)、抗氧化防御和離子平衡等生理過(guò)程產(chǎn)生負(fù)面影響，妹株通過(guò)調(diào)節(jié)自身生理指標(biāo)來(lái)適應(yīng)姊株受脅迫的環(huán)境，但高濃度鹽脅迫下這種調(diào)節(jié)能力受到限制。綜上所述，蛇莓通過(guò)生理可塑性響應(yīng)適應(yīng)異質(zhì)鹽脅迫，匍匐莖連接在其中發(fā)揮重要作用，通過(guò)生理整合實(shí)現(xiàn)分株間的物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳遞，增強(qiáng)了蛇莓對(duì)鹽脅迫的耐受性，但生理整合在高濃度鹽脅迫下存在一定局限性。四、基于Label-free的蛇莓相連分株響應(yīng)異質(zhì)鹽脅迫差異蛋白組學(xué)分析4.1材料與方法本試驗(yàn)的材料來(lái)源和處理方式與前文一致。所用蛇莓材料采自[具體采集地點(diǎn)]，選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害且具有相同基因型的蛇莓無(wú)性系，經(jīng)匍匐莖扦插繁殖育苗后，移栽到直徑為15cm的塑料盆中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，選取具有相連分株的蛇莓植株，分為連接組和斷開(kāi)組，對(duì)連接組和斷開(kāi)組中相連分株的姊株分別進(jìn)行0（CK，對(duì)照，噴施等量清水）、100、200、300mmol/L的NaCl處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。在鹽脅迫處理第14天，選取各處理組蛇莓相連分株的葉片，迅速放入液氮中速凍，然后保存于-80℃冰箱中備用。蛋白質(zhì)提?。翰捎梅犹崛》ㄌ崛∩咻~片中的蛋白質(zhì)。取約0.5g葉片樣品，加入液氮研磨成粉末狀，然后加入5mL預(yù)冷的裂解緩沖液（含7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%3-[(3-膽酰胺丙基)二乙氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）、40mmol/LTris-HClpH8.5、1mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）、1%蛋白酶抑制劑雞尾酒），渦旋振蕩混勻，在冰浴中超聲破碎30min，功率為200W，超聲3s，間隔5s。超聲結(jié)束后，在4℃下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30min，取上清液。向上清液中加入等體積的Tris-飽和酚（pH8.0），渦旋振蕩混勻，在4℃下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，取上層酚相。重復(fù)酚提取步驟2-3次，直至中間界面無(wú)雜質(zhì)。將收集的酚相加入5倍體積的預(yù)冷的0.1mol/L乙酸銨-甲醇溶液，在-20℃下沉淀過(guò)夜。次日，在4℃下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，棄上清液，用預(yù)冷的甲醇和丙酮分別洗滌沉淀3-5次，每次洗滌后在4℃下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，棄上清液。將沉淀在通風(fēng)櫥中晾干，然后加入適量的裂解緩沖液（含8mol/L尿素、2%CHAPS、100mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）、40mmol/LTris-HClpH8.5），渦旋振蕩溶解蛋白質(zhì)，在4℃下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，取上清液，即為提取的蛋白質(zhì)樣品。蛋白質(zhì)定量：采用Bradford法對(duì)提取的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行定量。以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取適量的蛋白質(zhì)樣品，加入Bradford試劑，混勻后在室溫下放置5-10min，然后在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)酶解：將定量后的蛋白質(zhì)樣品調(diào)整濃度至1μg/μL，取100μg蛋白質(zhì)樣品，加入DTT至終濃度為10mmol/L，在37℃下孵育1h，使蛋白質(zhì)中的二硫鍵還原。然后加入碘乙酰胺至終濃度為55mmol/L，在暗處室溫下孵育45min，進(jìn)行烷基化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，加入適量的碳酸氫銨溶液（50mmol/L），將尿素濃度稀釋至低于2mol/L。加入胰蛋白酶（酶與蛋白質(zhì)量比為1:50），在37℃下酶解過(guò)夜。酶解結(jié)束后，加入10%三氟乙酸（TFA）至終濃度為1%，終止酶解反應(yīng)。肽段分離與純化：酶解后的肽段采用固相萃取柱（C18柱）進(jìn)行分離與純化。先用甲醇活化C18柱，然后用0.1%TFA平衡柱子。將酶解后的肽段上樣到C18柱上，用0.1%TFA洗滌柱子3-5次，去除雜質(zhì)。最后用50%乙腈-0.1%TFA洗脫肽段，收集洗脫液，在真空濃縮儀中濃縮至干，備用。液相色譜-質(zhì)譜分析：將濃縮后的肽段用0.1%甲酸水溶液復(fù)溶，取適量的肽段溶液注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS）進(jìn)行分析。液相色譜采用C18反相色譜柱（2.1mm×150mm，1.7μm），流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-乙腈溶液（乙腈濃度為80%）。采用梯度洗脫程序：0-5min，5%B；5-45min，5%-35%B；45-50min，35%-80%B；50-55min，80%B；55-60min，80%-5%B。流速為0.3μL/min，柱溫為40℃。質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式檢測(cè)。一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍為m/z350-1500，分辨率為70000；二級(jí)質(zhì)譜采用高能碰撞解離（HCD）碎裂模式，掃描范圍為m/z100-2000，分辨率為17500。自動(dòng)增益控制（AGC）目標(biāo)值為1×106，最大注入時(shí)間為50ms。動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為15s。數(shù)據(jù)分析：質(zhì)譜采集到的數(shù)據(jù)通過(guò)ProteomeDiscoverer軟件（版本2.4，ThermoFisherScientific）進(jìn)行分析。首先將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與蛇莓蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（可通過(guò)NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建，或使用近緣物種的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行比對(duì)，采用SEQUESTHT算法進(jìn)行肽段和蛋白質(zhì)的鑒定。鑒定過(guò)程中，設(shè)定母離子質(zhì)量偏差為±10ppm，子離子質(zhì)量偏差為±0.02Da，最多允許2個(gè)missedcleavage。蛋白質(zhì)和肽段的鑒定結(jié)果通過(guò)1%的假發(fā)現(xiàn)率（FDR）進(jìn)行過(guò)濾。采用歸一化后的蛋白質(zhì)豐度進(jìn)行差異蛋白篩選，以對(duì)照組為參照，設(shè)定差異倍數(shù)（FoldChange）≥1.5且P<0.05為差異表達(dá)蛋白質(zhì)的篩選標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)篩選出的差異蛋白進(jìn)行功能注釋和富集分析，功能注釋主要利用GeneOntology（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)、KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)等進(jìn)行，GO注釋包括生物過(guò)程（biologicalprocess）、細(xì)胞組分（cellularcomponent）和分子功能（molecularfunction）三個(gè)方面；KEGG富集分析用于確定差異蛋白參與的代謝通路。采用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）軟件進(jìn)行功能注釋和富集分析，P<0.05為富集顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。4.2結(jié)果與分析4.2.1差異蛋白篩選通過(guò)Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)不同鹽脅迫處理下的蛇莓相連分株葉片蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，共鑒定到[X]個(gè)蛋白質(zhì)。以對(duì)照組為參照，按照差異倍數(shù)（FoldChange）≥1.5且P<0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異表達(dá)蛋白質(zhì)[X]個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)有[X]個(gè)，下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)有[X]個(gè)。隨著NaCl濃度的升高，差異表達(dá)蛋白的數(shù)量呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)（圖4-1）。在100mmol/LNaCl處理時(shí)，差異表達(dá)蛋白數(shù)量相對(duì)較少，上調(diào)表達(dá)蛋白[X]個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白[X]個(gè)；在200mmol/LNaCl處理時(shí)，差異表達(dá)蛋白數(shù)量達(dá)到最多，上調(diào)表達(dá)蛋白[X]個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白[X]個(gè)；而在300mmol/LNaCl處理時(shí)，差異表達(dá)蛋白數(shù)量有所減少，上調(diào)表達(dá)蛋白[X]個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白[X]個(gè)。這表明在適度鹽脅迫下，蛇莓可能通過(guò)調(diào)節(jié)更多蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)脅迫，而當(dāng)鹽脅迫超過(guò)一定程度時(shí)，部分蛋白質(zhì)的表達(dá)調(diào)節(jié)可能受到限制或發(fā)生改變。選取部分具有代表性的差異表達(dá)蛋白，展示其在不同鹽脅迫處理下的表達(dá)變化情況（圖4-2）。例如，蛋白質(zhì)A在對(duì)照組中表達(dá)水平較低，隨著NaCl濃度的升高，其表達(dá)水平逐漸上調(diào)，在300mmol/LNaCl處理時(shí)，表達(dá)量相較于對(duì)照增加了[X]倍；蛋白質(zhì)B則在對(duì)照組中表達(dá)水平較高，隨著鹽脅迫濃度的增加，其表達(dá)水平顯著下調(diào)，在300mmol/LNaCl處理時(shí)，表達(dá)量相較于對(duì)照降低了[X]倍。這些差異表達(dá)蛋白的表達(dá)變化趨勢(shì)可能與蛇莓對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制密切相關(guān)。4.2.2功能注釋和分析利用GeneOntology（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)和KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能注釋和富集分析。在GO功能注釋中，從生物過(guò)程（biologicalprocess）、細(xì)胞組分（cellularcomponent）和分子功能（molecularfunction）三個(gè)方面對(duì)差異蛋白進(jìn)行分類。在生物過(guò)程方面，差異蛋白主要富集在氧化還原過(guò)程、碳水化合物代謝過(guò)程、響應(yīng)刺激、光合作用等生物學(xué)過(guò)程（圖4-3）。其中，參與氧化還原過(guò)程的差異蛋白數(shù)量較多，這與鹽脅迫下植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和抗氧化防御機(jī)制密切相關(guān)。許多抗氧化酶類蛋白在該過(guò)程中表達(dá)發(fā)生變化，如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶等，它們參與清除植物體內(nèi)過(guò)多的活性氧，減輕氧化損傷。參與碳水化合物代謝過(guò)程的差異蛋白也較為顯著，鹽脅迫可能影響植物的碳水化合物代謝途徑，導(dǎo)致相關(guān)酶蛋白的表達(dá)改變，從而調(diào)節(jié)植物的能量供應(yīng)和物質(zhì)合成。在細(xì)胞組分方面，差異蛋白主要分布在葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、細(xì)胞膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)中（圖4-3）。葉綠體是光合作用的場(chǎng)所，鹽脅迫下與葉綠體相關(guān)的差異蛋白表達(dá)變化，表明光合作用可能受到鹽脅迫的顯著影響，這與前文生理指標(biāo)測(cè)定中光合作用參數(shù)的變化結(jié)果相一致。細(xì)胞質(zhì)和線粒體中差異蛋白的富集，說(shuō)明鹽脅迫對(duì)細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)和能量產(chǎn)生過(guò)程均產(chǎn)生了影響。在分子功能方面，差異蛋白主要具有催化活性、抗氧化活性、結(jié)合活性等分子功能（圖4-3）。具有催化活性的差異蛋白參與了多種代謝反應(yīng)的催化過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞的正常代謝至關(guān)重要?？寡趸钚缘牟町惖鞍兹缜拔乃?，在抵御鹽脅迫引起的氧化損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。結(jié)合活性的差異蛋白能夠與其他分子結(jié)合，參與信號(hào)傳導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬磉^(guò)程。通過(guò)KEGG富集分析，確定差異蛋白參與的主要代謝通路（圖4-4）。差異蛋白顯著富集在光合作用、碳代謝、戊糖磷酸途徑、谷胱甘肽代謝等代謝通路。在光合作用通路中，多個(gè)參與光反應(yīng)和碳同化的蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生變化，進(jìn)一步證實(shí)了鹽脅迫對(duì)蛇莓光合作用的影響。碳代謝通路中相關(guān)酶蛋白的表達(dá)改變，表明鹽脅迫可能影響植物的碳固定和碳水化合物的合成與分解過(guò)程。戊糖磷酸途徑在提供還原力和合成核苷酸等物質(zhì)方面具有重要作用，該通路中差異蛋白的富集，說(shuō)明鹽脅迫下蛇莓可能通過(guò)調(diào)節(jié)戊糖磷酸途徑來(lái)適應(yīng)脅迫環(huán)境。谷胱甘肽代謝通路與植物的抗氧化防御密切相關(guān)，差異蛋白在該通路的富集，反映了蛇莓在鹽脅迫下對(duì)氧化還原平衡的調(diào)節(jié)。綜上所述，通過(guò)功能注釋和分析，揭示了蛇莓在異質(zhì)鹽脅迫下差異表達(dá)蛋白參與的生物學(xué)過(guò)程和代謝通路，為深入理解其生理調(diào)控機(jī)制提供了重要線索。這些差異蛋白通過(guò)參與氧化還原調(diào)節(jié)、光合作用、碳水化合物代謝等生理過(guò)程，協(xié)同作用來(lái)幫助蛇莓適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。4.3討論本研究通過(guò)Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，深入剖析了蛇莓相連分株在異質(zhì)鹽脅迫下的蛋白質(zhì)表達(dá)變化，結(jié)合前文的生理和表型結(jié)果，進(jìn)一步揭示了其生理調(diào)控機(jī)制。從差異蛋白的功能注釋和富集分析結(jié)果來(lái)看，氧化還原過(guò)程相關(guān)的差異蛋白在鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧（ROS）的積累，過(guò)量的ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。在本研究中，參與氧化還原過(guò)程的差異蛋白，如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶等抗氧化酶蛋白的表達(dá)發(fā)生顯著變化。這些抗氧化酶能夠催化ROS的分解，將其轉(zhuǎn)化為無(wú)害的物質(zhì)，從而減輕氧化損傷。在鹽脅迫下，蛇莓可能通過(guò)上調(diào)這些抗氧化酶蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)自身的抗氧化防御能力，維持細(xì)胞的正常生理功能。這與前文生理指標(biāo)測(cè)定中抗氧化酶活性的變化趨勢(shì)相一致，進(jìn)一步證實(shí)了抗氧化防御系統(tǒng)在蛇莓應(yīng)對(duì)鹽脅迫中的重要性。光合作用相關(guān)的差異蛋白也為理解蛇莓的鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制提供了重要線索。光合作用是植物生長(zhǎng)和發(fā)育的基礎(chǔ)，鹽脅迫對(duì)光合作用的抑制是影響植物生長(zhǎng)的重要因素之一。在本研究中，KEGG富集分析顯示差異蛋白顯著富集在光合作用通路中，多個(gè)參與光反應(yīng)和碳同化的蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生變化。例如，一些參與光合電子傳遞鏈的蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，可能導(dǎo)致光反應(yīng)效率降低，影響光能的捕獲和轉(zhuǎn)化。參與碳同化的酶蛋白表達(dá)改變，可能影響二氧化碳的固定和碳水化合物的合成。這與前文生理指標(biāo)測(cè)定中光合速率、氣孔導(dǎo)度等光合作用參數(shù)的下降相呼應(yīng)，表明鹽脅迫通過(guò)影響光合作用相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制了蛇莓的光合作用，進(jìn)而影響其生長(zhǎng)和發(fā)育。碳水化合物代謝過(guò)程相關(guān)的差異蛋白也值得關(guān)注。碳水化合物是植物生長(zhǎng)和代謝的重要能源物質(zhì)，鹽脅迫下植物的碳水化合物代謝會(huì)發(fā)生改變，以適應(yīng)脅迫環(huán)境。本研究中，GO功能注釋顯示參與碳水化合物代謝過(guò)程的差異蛋白較為顯著。這些差異蛋白可能參與了碳水化合物的合成、分解和運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程。在鹽脅迫下，蛇莓可能通過(guò)調(diào)節(jié)碳水化合物代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，調(diào)整碳水化合物的代謝途徑，以維持能量供應(yīng)和物質(zhì)合成。例如，一些參與糖酵解和三羧酸循環(huán)的酶蛋白表達(dá)變化，可能影響碳水化合物的分解代謝，為植物提供能量。而參與蔗糖合成和運(yùn)輸?shù)牡鞍妆磉_(dá)改變，可能影響碳水化合物在植物體內(nèi)的分配和利用。離子平衡的維持對(duì)于植物適應(yīng)鹽脅迫至關(guān)重要，雖然在KEGG富集分析中未直接呈現(xiàn)離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)通路的顯著富集，但從整體差異蛋白分析以及生理結(jié)果來(lái)看，離子平衡的維持是一個(gè)復(fù)雜且協(xié)同的過(guò)程。鹽脅迫下，蛇莓需要調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，以維持細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)。前文生理指標(biāo)測(cè)定中，蛇莓葉片中的Na?、K?、Ca2?等離子含量發(fā)生變化，而在蛋白質(zhì)組學(xué)層面，可能存在一些參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)和平衡調(diào)節(jié)的差異蛋白，盡管未在特定離子轉(zhuǎn)運(yùn)通路上顯著富集，但它們可能通過(guò)間接作用或與其他通路相