弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價基因工程疫苗：構(gòu)建、評估與展望一、引言1.1研究背景弓形蟲病和狂犬病是兩種極具威脅性的傳染性疾病，對人類健康和動物養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)均造成了嚴(yán)重的負(fù)面影響，給全球公共衛(wèi)生安全帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。弓形蟲病是由剛地弓形蟲引起的一種人獸共患寄生蟲病，呈全球性分布。據(jù)統(tǒng)計，全球約有三分之一的人口感染過弓形蟲，在一些畜牧業(yè)發(fā)達的地區(qū)，動物的感染率更是居高不下。弓形蟲可以通過多種途徑傳播，包括食用未煮熟的含有弓形蟲包囊的肉類、接觸被弓形蟲污染的土壤或水源，以及母嬰垂直傳播等。對于免疫功能正常的個體，感染弓形蟲后可能僅表現(xiàn)出輕微的流感樣癥狀，甚至無癥狀，但對于孕婦、胎兒以及免疫功能低下的人群，如艾滋病患者、器官移植受者等，弓形蟲感染可能導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。孕婦感染弓形蟲后，可通過胎盤將病原體傳播給胎兒，引起先天性弓形蟲病，導(dǎo)致胎兒畸形、流產(chǎn)、死胎等嚴(yán)重后果；即使胎兒幸存，也可能出現(xiàn)智力低下、視力障礙等發(fā)育缺陷問題。免疫功能低下者感染弓形蟲后，可能引發(fā)嚴(yán)重的全身性疾病，如腦炎、肺炎等，甚至危及生命。此外，弓形蟲病在畜牧業(yè)中的流行也給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，感染弓形蟲的家畜生長發(fā)育受阻、肉質(zhì)下降，降低了養(yǎng)殖效益?？袢t是由狂犬病毒引起的一種急性傳染病，主要通過被感染動物咬傷、抓傷或舔舐傷口等途徑傳播給人類和其他哺乳動物?？袢《揪哂惺壬窠?jīng)性，一旦侵入人體，會沿著神經(jīng)纖維向中樞神經(jīng)系統(tǒng)擴散，引發(fā)一系列嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀?？袢〉牟∷缆蕩缀鯙?00%，是目前病死率最高的傳染病之一。在狂犬病的發(fā)病過程中，患者會出現(xiàn)恐水、怕風(fēng)、咽肌痙攣、進行性癱瘓等典型癥狀，病情進展迅速，從出現(xiàn)癥狀到死亡通常不超過1周?？袢〔粌H對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，也給動物養(yǎng)殖和野生動物保護帶來了諸多挑戰(zhàn)。在一些狂犬病高發(fā)地區(qū)，大量的犬只、貓只等動物感染發(fā)病，不僅導(dǎo)致動物死亡，還增加了病毒傳播給人類的風(fēng)險。此外，狂犬病的流行還會對野生動物的生存和繁衍造成影響，破壞生態(tài)平衡。目前，針對弓形蟲病和狂犬病的防控主要依賴于疫苗接種和藥物治療。然而，傳統(tǒng)的弓形蟲疫苗存在一些局限性，如減毒活疫苗存在毒力返強的風(fēng)險，可能導(dǎo)致接種動物感染發(fā)??；滅活疫苗免疫效果相對較弱，需要多次接種才能達到較好的免疫保護效果，且生產(chǎn)成本較高?？袢∫呙珉m然在預(yù)防狂犬病方面發(fā)揮了重要作用，但現(xiàn)有的狂犬病疫苗大多為單價疫苗，只能預(yù)防單一病毒株的感染，對于一些變異的狂犬病毒株，其免疫保護效果可能會受到影響。此外，傳統(tǒng)疫苗的生產(chǎn)過程較為復(fù)雜，需要大量的動物組織或細(xì)胞培養(yǎng)，成本較高，且容易受到生物安全問題的制約。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，基因工程疫苗作為一種新型疫苗，具有安全、高效、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，成為了疫苗研究領(lǐng)域的熱點?；蚬こ桃呙缤ㄟ^對病原體的基因進行修飾和改造，使其能夠表達出具有免疫原性的蛋白或多肽，從而激發(fā)機體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生特異性抗體和免疫細(xì)胞，達到預(yù)防和治療疾病的目的。弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價基因工程疫苗的研究，旨在將弓形蟲和狂犬病毒的抗原基因整合到偽狂犬病毒載體中，構(gòu)建出一種能夠同時預(yù)防弓形蟲病和狂犬病的新型疫苗。這種重組疫苗不僅可以克服傳統(tǒng)疫苗的缺點，還可以實現(xiàn)一針預(yù)防兩種疾病，提高疫苗的使用效率和經(jīng)濟效益，具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，開展弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價基因工程疫苗的研究，對于有效預(yù)防和控制弓形蟲病和狂犬病的傳播，保障人類健康和動物養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。1.2研究目的與意義本研究旨在利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建一種新型的弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價基因工程疫苗，并對其免疫原性、安全性及保護效果進行全面系統(tǒng)的評估，為有效預(yù)防和控制弓形蟲病和狂犬病提供新的技術(shù)手段和理論依據(jù)。具體研究目的如下：構(gòu)建重組二價基因工程疫苗：通過基因重組技術(shù)，將弓形蟲和狂犬病毒的關(guān)鍵抗原基因整合到偽狂犬病毒載體中，構(gòu)建出能夠同時表達兩種病原體抗原的重組二價基因工程疫苗。在這個過程中，需要精準(zhǔn)地對基因進行切割、連接和轉(zhuǎn)化等操作，確?？乖蚰軌蚍€(wěn)定地插入到偽狂犬病毒載體的合適位置，并且在后續(xù)的培養(yǎng)和繁殖過程中能夠正常表達。例如，對于弓形蟲表面抗原SAG1基因和狂犬病毒糖蛋白G基因，需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶進行切割，使其產(chǎn)生能夠互補配對的粘性末端，然后利用DNA連接酶將它們連接到偽狂犬病毒載體上，構(gòu)建出重組質(zhì)粒。再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到合適的宿主細(xì)胞中，如大腸桿菌或哺乳動物細(xì)胞，進行擴增和篩選，最終獲得含有正確重組基因的病毒株。評估疫苗的免疫原性：采用多種免疫學(xué)技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）等，對疫苗中的抗原進行檢測，評估其能否有效地刺激機體產(chǎn)生特異性抗體和免疫細(xì)胞，從而引發(fā)機體的免疫反應(yīng)。ELISA可以定量檢測血清中特異性抗體的含量，通過比較接種疫苗前后動物血清中抗體水平的變化，來評估疫苗的免疫原性。Westernblot則可以進一步確定抗體所識別的抗原蛋白條帶，驗證抗原的表達情況和免疫反應(yīng)的特異性。此外，還可以通過檢測細(xì)胞免疫指標(biāo)，如T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)、細(xì)胞因子的分泌等，來全面評估疫苗的免疫原性。評估疫苗的安全性：通過細(xì)胞毒性測試、動物毒性測試等方法，評估疫苗對細(xì)胞和動物機體是否產(chǎn)生不良反應(yīng)，如細(xì)胞毒性、組織損傷、過敏反應(yīng)等，確保疫苗在使用過程中的安全性。在細(xì)胞毒性測試中，可以將疫苗與不同類型的細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和代謝活性等指標(biāo)的變化，以確定疫苗是否對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。動物毒性測試則需要選擇合適的實驗動物，如小鼠、大鼠、豚鼠等，進行不同劑量的疫苗接種，觀察動物的臨床表現(xiàn)、體重變化、血液生化指標(biāo)和組織病理學(xué)變化等，全面評估疫苗的安全性。例如，在小鼠毒性測試中，需要設(shè)置多個劑量組，包括高劑量組、中劑量組和低劑量組，以及對照組，分別進行皮下注射、肌肉注射或口服接種疫苗，觀察小鼠在接種后的14天內(nèi)的行為變化、飲食情況、精神狀態(tài)等，在實驗結(jié)束后對小鼠進行解剖，觀察主要臟器的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，進行組織病理學(xué)檢查，以確定疫苗是否對動物機體產(chǎn)生毒性作用。評估疫苗的保護效果：在小鼠、豬等試驗動物中進行免疫接種，觀察其產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，并通過攻毒實驗，評估疫苗對弓形蟲病和狂犬病的保護效果，確定疫苗的有效性。在攻毒實驗中，需要選擇合適的病原體毒株和攻毒劑量，對接種疫苗的動物和未接種疫苗的對照動物進行感染，觀察動物的發(fā)病情況、死亡率、病理變化等指標(biāo)，比較兩組動物的差異，以評估疫苗的保護效果。例如，對于弓形蟲病的攻毒實驗，可以選擇弓形蟲強毒株，如RH株，通過腹腔注射或口服感染小鼠，觀察小鼠在感染后的發(fā)病時間、癥狀表現(xiàn)、生存時間等，統(tǒng)計小鼠的死亡率，計算疫苗的保護率。對于狂犬病的攻毒實驗，可以選擇狂犬病毒街毒株，通過肌肉注射或腦內(nèi)注射感染小鼠，觀察小鼠的發(fā)病癥狀，如恐水、怕風(fēng)、抽搐等，統(tǒng)計小鼠的發(fā)病率和死亡率，評估疫苗對狂犬病的保護效果。本研究具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值，具體體現(xiàn)在以下幾個方面：理論意義：有助于深入了解弓形蟲和狂犬病毒的免疫機制，以及基因工程疫苗在動物體內(nèi)的免疫應(yīng)答過程，為進一步開發(fā)高效、安全的基因工程疫苗提供理論基礎(chǔ)。通過研究疫苗誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的分子機制，可以揭示抗原呈遞、T淋巴細(xì)胞活化、B淋巴細(xì)胞分化和抗體產(chǎn)生等過程中的關(guān)鍵信號通路和調(diào)控因子，為優(yōu)化疫苗設(shè)計和提高疫苗免疫效果提供理論指導(dǎo)。例如，研究發(fā)現(xiàn)疫苗中的抗原可以通過與抗原呈遞細(xì)胞表面的模式識別受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，促進抗原呈遞細(xì)胞的成熟和活化，進而激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。此外，研究還可以探討不同佐劑對疫苗免疫效果的影響機制，為選擇合適的佐劑提供理論依據(jù)。實際應(yīng)用價值：對于動物疫病防控具有重要意義。弓形蟲病和狂犬病在動物養(yǎng)殖中廣泛流行，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。研制出有效的重組二價基因工程疫苗，可以實現(xiàn)一針預(yù)防兩種疾病，提高疫苗的使用效率和經(jīng)濟效益，減少動物感染的風(fēng)險，保障養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。例如，在養(yǎng)豬業(yè)中，豬是弓形蟲和狂犬病毒的易感動物，感染后會導(dǎo)致生長發(fā)育受阻、繁殖性能下降、死亡率增加等問題。使用弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價基因工程疫苗對豬進行免疫接種，可以有效地預(yù)防這兩種疾病的發(fā)生，提高豬的養(yǎng)殖效益。此外，疫苗的應(yīng)用還可以減少動物疫病的傳播，降低對公共衛(wèi)生的威脅。公共衛(wèi)生意義：弓形蟲病和狂犬病都是人獸共患傳染病，對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。通過對動物進行疫苗接種，可以減少病原體在動物中的傳播，從而降低人類感染的風(fēng)險，保護人類健康。例如，在一些狂犬病高發(fā)地區(qū)，對犬只進行狂犬病疫苗接種，可以有效地控制狂犬病的傳播，減少人類被感染的機會。同時，對于從事畜牧業(yè)生產(chǎn)、動物養(yǎng)殖、獸醫(yī)等職業(yè)的人群，接種弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價基因工程疫苗也可以提供一定的保護，降低職業(yè)暴露感染的風(fēng)險。技術(shù)創(chuàng)新意義：本研究采用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組二價基因工程疫苗，是疫苗研發(fā)領(lǐng)域的一項技術(shù)創(chuàng)新。與傳統(tǒng)疫苗相比，基因工程疫苗具有安全、高效、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，有望成為未來疫苗發(fā)展的主要方向。通過本研究，可以探索和優(yōu)化基因工程疫苗的構(gòu)建和制備技術(shù)，為其他基因工程疫苗的研發(fā)提供技術(shù)參考和借鑒。例如，在基因重組過程中，采用新的基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9技術(shù)，可以更加精準(zhǔn)地對基因進行修飾和改造，提高重組效率和成功率。此外，研究還可以探索新的疫苗遞送系統(tǒng)和佐劑，提高疫苗的免疫效果和穩(wěn)定性。二、弓形蟲與偽狂犬病毒概述2.1弓形蟲2.1.1生物學(xué)特性弓形蟲（Toxoplasmagondii），又稱剛地弓形蟲，屬于真球蟲目、弓形蟲科、弓形蟲屬，是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲。它在發(fā)育的全過程中，會出現(xiàn)5種不同形態(tài)的階段，分別為滋養(yǎng)體、包囊、裂殖體、配子體和卵囊，其中滋養(yǎng)體、包囊和卵囊與傳播和致病密切相關(guān)。滋養(yǎng)體是在中間宿主細(xì)胞內(nèi)營分裂繁殖的蟲體，依據(jù)繁殖速度和所處環(huán)境的不同，又可細(xì)分為速殖子和緩殖子。游離狀態(tài)下的速殖子呈現(xiàn)出香蕉形或者半月形，其一端較為尖銳，另一端則相對鈍圓，一側(cè)扁平，另一側(cè)稍顯膨隆，大小通常為長4-7μm，最寬處2-4μm。經(jīng)吉姆薩染劑染色后，在顯微鏡下可以清晰地觀察到，其胞漿被染成藍色，胞核呈紫紅色且位于蟲體中央位置，在核與尖端之間還存在染成淺紅色的顆粒，即副核體。當(dāng)蟲體在細(xì)胞內(nèi)寄生時，形態(tài)變?yōu)榧忓N形或橢圓形，以一種特殊的內(nèi)二芽殖法進行繁殖，在宿主細(xì)胞膜的包裹下，快速增殖的蟲體集合體形成假包囊，其中包含的蟲體便是速殖子，速殖子在急性感染期大量繁殖，是導(dǎo)致宿主發(fā)病的主要階段。緩殖子則主要存在于包囊中，當(dāng)宿主免疫功能正常時，滋養(yǎng)體繁殖速度減緩，多個滋養(yǎng)體聚集在一起，外面包裹一層富有彈性的堅韌囊壁，便形成了包囊。包囊呈圓形或橢圓形，直徑5-100μm不等，內(nèi)部的緩殖子可不斷增殖，其形態(tài)與速殖子相似，但蟲體相對較小，核的位置稍偏后，包囊可在組織內(nèi)長期存活，是弓形蟲在慢性感染期的主要存在形式，也是重要的傳染源。裂殖體在貓科動物小腸絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)育增殖，這是弓形蟲發(fā)育過程中的一個特定階段。成熟的裂殖體外觀呈長橢圓形，內(nèi)部含有4-29個裂殖子，一般以10-15個居多，這些裂殖子呈扇狀排列，形狀如同新月，前端尖銳而后端鈍圓，相較于滋養(yǎng)體，裂殖子的體積更小。裂殖體發(fā)育成熟后，會釋放出裂殖子，這些裂殖子可以繼續(xù)侵入其他細(xì)胞，進行新一輪的增殖。配子體是由游離的裂殖子侵入另一個腸上皮細(xì)胞后發(fā)育形成的。配子體具有雌雄之分，雌配子體呈圓形，隨著發(fā)育成熟，其體積不斷增大，可達10-20μm；雄配子體數(shù)量相對較少，成熟后可形成12-32個雄配子。雌雄配子受精結(jié)合后，會發(fā)育為合子，進而形成卵囊。卵囊是弓形蟲發(fā)育的最終階段，也是其在外界環(huán)境中傳播的重要形態(tài)。卵囊呈圓形或橢圓形，大小為10-12μm，具有兩層光滑透明的囊壁，內(nèi)部充滿均勻小顆粒。當(dāng)卵囊發(fā)育成熟時，內(nèi)部會含有2個孢子囊，每個孢子囊又分別含有4個新月形的子孢子。卵囊隨貓科動物的糞便排出體外，在適宜的環(huán)境條件下，可存活較長時間，一旦被中間宿主攝入，便會引發(fā)感染。弓形蟲的生活史較為復(fù)雜，需要兩個宿主才能完成整個發(fā)育過程。貓及貓科動物是弓形蟲的終末宿主，在貓體內(nèi)，弓形蟲既可以進行有性生殖，也可以進行無性生殖。當(dāng)貓攝入含有包囊、卵囊或滋養(yǎng)體的食物后，蟲體在貓的小腸內(nèi)釋放出來，并侵入小腸上皮細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)，蟲體經(jīng)過一系列的發(fā)育和增殖，先后經(jīng)歷裂殖體、配子體階段，最終形成卵囊。卵囊隨糞便排出體外，在外界適宜的環(huán)境中，經(jīng)過一段時間的發(fā)育，成為具有感染性的成熟卵囊。其他動物，包括人類、豬、牛、羊等，則作為中間宿主，當(dāng)中間宿主攝入被卵囊污染的食物、水，或者接觸含有包囊的肉類時，便會感染弓形蟲。在中間宿主體內(nèi)，弓形蟲主要進行無性生殖，蟲體以滋養(yǎng)體和包囊的形式存在于組織細(xì)胞內(nèi)，可導(dǎo)致宿主出現(xiàn)各種臨床癥狀。2.1.2流行病學(xué)特征弓形蟲病呈全球性分布，廣泛存在于自然界中，幾乎所有的溫血動物都有可能感染弓形蟲，包括哺乳動物、鳥類、爬行類等，其感染源主要包括以下幾個方面：首先，貓及貓科動物作為弓形蟲的終末宿主，是最重要的傳染源。貓感染弓形蟲后，會在腸道內(nèi)進行有性生殖，產(chǎn)生大量的卵囊，并隨糞便排出體外。這些卵囊在適宜的環(huán)境中可以存活數(shù)月甚至數(shù)年，一旦被其他動物或人類攝入，就可能引發(fā)感染。據(jù)相關(guān)研究表明，在一些養(yǎng)貓較為普遍的地區(qū)，土壤、水源等環(huán)境中卵囊的污染情況較為嚴(yán)重，增加了其他生物感染弓形蟲的風(fēng)險。其次，感染弓形蟲的家畜，如豬、牛、羊等，也是重要的傳染源。這些家畜在感染后，體內(nèi)會形成包囊和滋養(yǎng)體，尤其是在肉類中存在的包囊，若未經(jīng)充分煮熟，被人類食用后，就容易導(dǎo)致感染。有調(diào)查顯示，在一些屠宰場中，對豬、牛等家畜的檢測發(fā)現(xiàn)，其弓形蟲的感染率可達一定比例，這對食品安全構(gòu)成了潛在威脅。此外，一些野生動物，如鼠類、鳥類等，也可能感染弓形蟲，并在其活動范圍內(nèi)傳播病原體。弓形蟲的傳播途徑主要分為先天性傳播和獲得性傳播兩種類型。先天性傳播是指胎兒在母體子宮內(nèi)通過胎盤感染弓形蟲。當(dāng)孕婦在孕期初次感染弓形蟲時，病原體可以通過胎盤屏障進入胎兒體內(nèi)，導(dǎo)致胎兒感染。這種傳播方式對胎兒的危害極大，可能引發(fā)流產(chǎn)、死胎、胎兒畸形、先天性弓形蟲病等嚴(yán)重后果。據(jù)統(tǒng)計，孕婦在妊娠早期感染弓形蟲，胎兒的感染率相對較低，但一旦感染，胎兒出現(xiàn)嚴(yán)重畸形和發(fā)育障礙的風(fēng)險較高；而在妊娠晚期感染，胎兒的感染率相對較高，但癥狀可能相對較輕。獲得性傳播途徑則較為多樣，其中最主要的是消化道傳播。人類和動物通過食用被弓形蟲卵囊污染的食物、水，或者食用未煮熟的含有弓形蟲包囊或滋養(yǎng)體的肉類，都可能感染弓形蟲。例如，食用生肉或半生不熟的羊肉、豬肉、牛肉等，是導(dǎo)致人類感染弓形蟲的常見原因之一。此外，接觸傳播也是一種重要的途徑，人類在接觸感染弓形蟲的動物及其排泄物后，若不注意個人衛(wèi)生，如未及時洗手就觸摸口鼻，也可能導(dǎo)致感染。特別是從事畜牧業(yè)、獸醫(yī)工作以及寵物飼養(yǎng)的人群，由于與動物接觸頻繁，感染的風(fēng)險相對較高。還有，輸血和器官移植也可能傳播弓形蟲，雖然這種情況相對較少見，但對于接受輸血或器官移植的患者來說，一旦感染，后果往往較為嚴(yán)重。在流行情況方面，弓形蟲感染在全球范圍內(nèi)極為普遍，但不同地區(qū)、不同人群和動物的感染率存在較大差異。一般來說，發(fā)展中國家的感染率普遍高于發(fā)達國家，熱帶和亞熱帶地區(qū)的感染率高于溫帶和寒帶地區(qū)。在我國，不同地區(qū)的弓形蟲感染率也有所不同，一些調(diào)查研究顯示，部分地區(qū)的人群感染率可達10%-20%左右，而在一些畜牧業(yè)發(fā)達、衛(wèi)生條件相對較差的地區(qū)，感染率可能更高。在動物方面，豬、羊等家畜的感染率也較高，尤其是散養(yǎng)的動物，由于更容易接觸到感染源，感染風(fēng)險更大。例如，在一些農(nóng)村地區(qū)，散養(yǎng)豬群的弓形蟲感染率可達30%-50%，這不僅影響了家畜的健康和養(yǎng)殖效益，也增加了人類感染的風(fēng)險。此外，隨著人們生活方式的改變，寵物飼養(yǎng)越來越普及，人與寵物的接觸更加密切，這也在一定程度上增加了弓形蟲傳播的機會。弓形蟲的致病機制較為復(fù)雜，與蟲株的毒力、宿主的免疫狀態(tài)以及感染的蟲體數(shù)量等因素密切相關(guān)。當(dāng)弓形蟲侵入宿主細(xì)胞后，會在細(xì)胞內(nèi)迅速繁殖，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，釋放出的蟲體又可以繼續(xù)侵入周圍的細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)。在急性感染期，速殖子大量繁殖，可引起宿主全身性的感染，導(dǎo)致發(fā)熱、頭痛、肌肉疼痛、淋巴結(jié)腫大等癥狀。對于免疫功能正常的宿主，機體的免疫系統(tǒng)會啟動免疫應(yīng)答，試圖清除病原體。在這個過程中，巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞會發(fā)揮重要作用，它們可以識別和攻擊弓形蟲，產(chǎn)生細(xì)胞因子和抗體，以控制感染的擴散。然而，對于免疫功能低下的人群，如艾滋病患者、器官移植受者、長期使用免疫抑制劑的患者等，由于免疫系統(tǒng)無法有效地發(fā)揮作用，弓形蟲感染往往會更加嚴(yán)重，可能引發(fā)全身性播散性感染，導(dǎo)致腦炎、肺炎、心肌炎等嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至危及生命。在慢性感染期，弓形蟲主要以包囊的形式存在于宿主組織中，包囊內(nèi)的緩殖子可以長期存活。當(dāng)宿主免疫功能下降時，包囊可能破裂，釋放出緩殖子，重新激活感染，引發(fā)一系列臨床癥狀。此外，弓形蟲還可以通過逃避宿主的免疫監(jiān)視，在宿主體內(nèi)長期存活，這也是弓形蟲感染難以徹底清除的原因之一。2.2偽狂犬病毒2.2.1病毒特性偽狂犬病毒（Pseudorabiesvirus，PRV），屬于皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科、豬皰疹病毒1型，是引發(fā)偽狂犬病的病原體。該病毒呈球形，直徑約150-300納米，具備囊膜和核衣殼結(jié)構(gòu)。病毒粒子由囊膜、核衣殼和核酸構(gòu)成，囊膜表面布滿纖突，這些纖突在病毒與宿主細(xì)胞的相互作用過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，比如識別宿主細(xì)胞表面的受體，介導(dǎo)病毒的吸附和侵入。PRV的基因組為線性雙鏈DNA，長度約150kb，具有高度的遺傳穩(wěn)定性。其基因組包含多個開放閱讀框，能夠編碼病毒復(fù)制、感染以及致病所需的多種蛋白，如糖蛋白、核衣殼蛋白等。在這些編碼蛋白中，gB、gC、gD、gE等糖蛋白不僅參與病毒的吸附、侵入和釋放過程，還在病毒的免疫逃逸和致病機制中扮演重要角色。例如，gE糖蛋白能夠介導(dǎo)病毒在神經(jīng)元之間的傳播，增強病毒的毒力；gD糖蛋白則是病毒感染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白，與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，啟動病毒的侵入過程。此外，病毒基因組中的一些非編碼區(qū)域也具有重要的調(diào)控功能，參與病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制調(diào)控。PRV的復(fù)制過程主要在宿主細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)進行，其復(fù)制周期包括吸附、穿入、脫殼、生物合成、裝配與釋放等步驟。首先，病毒粒子表面的纖突與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，實現(xiàn)吸附過程；隨后，病毒通過膜融合或內(nèi)吞的方式進入宿主細(xì)胞，完成穿入；進入細(xì)胞后，病毒脫殼，釋放出基因組DNA；在細(xì)胞核內(nèi)，病毒基因組利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)，進行生物合成，合成病毒的各種蛋白和核酸；新合成的病毒蛋白和核酸在細(xì)胞核內(nèi)裝配成完整的病毒粒子，然后通過出芽的方式從宿主細(xì)胞中釋放出來，繼續(xù)感染其他細(xì)胞。在整個復(fù)制過程中，病毒需要與宿主細(xì)胞進行復(fù)雜的相互作用，調(diào)控宿主細(xì)胞的生理功能，以滿足自身的復(fù)制需求。例如，病毒會抑制宿主細(xì)胞的基因表達和蛋白質(zhì)合成，利用宿主細(xì)胞的代謝資源來合成自身的物質(zhì)；同時，病毒還會干擾宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答，逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。2.2.2流行病學(xué)特征偽狂犬病在全球范圍內(nèi)均有分布，呈地方性流行態(tài)勢，尤其在養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的地區(qū)，疫情較為嚴(yán)重。我國各地也時有發(fā)生，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。該病的流行具有一定的季節(jié)性，多在春秋兩季發(fā)病，這可能與春秋季節(jié)氣候多變，動物的免疫力相對較低，以及養(yǎng)殖環(huán)境中的病原體更容易滋生和傳播等因素有關(guān)。偽狂犬病的傳染源主要為感染PRV的動物以及隱性感染動物。這些動物可通過多種途徑將病毒傳播給其他易感動物，傳播途徑包括空氣傳播，如感染動物咳嗽、打噴嚏時，會將含有病毒的飛沫釋放到空氣中，周圍的易感動物吸入后就可能感染；接觸傳播，易感動物直接接觸感染動物的唾液、鼻液、尿液、糞便等分泌物和排泄物，或者接觸被病毒污染的飼料、水源、器具等，都可能感染病毒；另外，蚊蟲、老鼠等媒介也可能攜帶病毒，在動物之間傳播疾病。在豬群中，病毒的傳播速度很快，尤其是在養(yǎng)殖密度較大、衛(wèi)生條件較差的豬場，疫情更容易爆發(fā)和擴散。例如，在一些小型豬場，由于豬舍通風(fēng)不良、飼養(yǎng)密度過高，一旦有一頭豬感染偽狂犬病毒，短時間內(nèi)就可能導(dǎo)致整個豬群被感染。偽狂犬病的易感動物范圍廣泛，多種家畜和野生動物都對PRV易感，其中豬是最易感的動物之一，不同年齡、品種的豬均可感染，但仔豬的易感性更高，病情也更為嚴(yán)重。除豬之外，牛、羊、犬、貓、鼠類等動物也可能感染偽狂犬病毒，感染后會出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀。例如，牛感染后，主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀和神經(jīng)癥狀，如咳嗽、呼吸困難、流涎、肌肉震顫、抽搐等；羊感染后，常出現(xiàn)發(fā)熱、精神萎靡、食欲減退、流產(chǎn)等癥狀；犬感染后，可表現(xiàn)為奇癢、狂躁不安、攻擊行為、流涎、吞咽困難等，最終因呼吸衰竭而死亡。偽狂犬病對養(yǎng)豬業(yè)的影響極為嚴(yán)重，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：首先，會導(dǎo)致豬只生長緩慢，飼料轉(zhuǎn)化率降低。感染PRV的豬，由于病毒在體內(nèi)的感染和復(fù)制，會影響豬的正常生理功能，導(dǎo)致豬的食欲下降、消化吸收能力減弱，從而使豬的生長速度明顯減慢，飼料消耗增加，養(yǎng)殖成本大幅提高。其次，會引起母豬繁殖障礙，妊娠母豬感染PRV后，可能出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、產(chǎn)弱仔等情況，嚴(yán)重影響母豬的繁殖性能和豬場的經(jīng)濟效益。再者，會引發(fā)豬只呼吸道疾病，感染PRV的豬，呼吸道黏膜受到病毒的侵害，容易繼發(fā)其他細(xì)菌和病毒的感染，導(dǎo)致呼吸道疾病的發(fā)生，如肺炎、支氣管炎等，使豬只出現(xiàn)咳嗽、呼吸困難等癥狀，進一步影響豬的生長和健康。此外，PRV還會破壞豬的免疫系統(tǒng)，使豬只對其他病原體的抵抗力下降，容易感染其他疾病，如豬瘟、豬藍耳病、豬圓環(huán)病毒病等，增加了豬群的發(fā)病率和死亡率。同時，由于偽狂犬病的存在，豬場需要加強防疫措施，增加疫苗接種、消毒、監(jiān)測等成本，也給養(yǎng)豬業(yè)帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。三、重組二價基因工程疫苗的構(gòu)建3.1重組疫苗的設(shè)計原理基因重組技術(shù)作為現(xiàn)代生物技術(shù)的核心，在疫苗構(gòu)建領(lǐng)域發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其基本原理是依據(jù)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的理論，通過一系列精確的操作，將不同來源的基因進行切割、連接和重組，從而構(gòu)建出具有特定功能的重組基因。在疫苗構(gòu)建過程中，基因重組技術(shù)能夠打破傳統(tǒng)疫苗研發(fā)的局限性，實現(xiàn)對病原體抗原基因的精準(zhǔn)操控，為研發(fā)高效、安全的新型疫苗開辟了廣闊的道路。在構(gòu)建弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價基因工程疫苗時，基因重組技術(shù)的應(yīng)用主要體現(xiàn)在以下幾個關(guān)鍵步驟：首先，需要從弓形蟲和偽狂犬病毒的基因組中，精準(zhǔn)地篩選并獲取具有免疫原性的特定抗原基因。這一過程需要深入了解兩種病原體的生物學(xué)特性和免疫機制，通過對大量基因的研究和分析，確定能夠有效激發(fā)機體免疫反應(yīng)的關(guān)鍵抗原基因。例如，對于弓形蟲而言，表面抗原1（SAG1）基因是其重要的免疫原性基因之一。SAG1是弓形蟲表面的一種重要蛋白，在弓形蟲感染宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，能夠被宿主免疫系統(tǒng)識別并引發(fā)免疫反應(yīng)。研究表明，SAG1基因編碼的蛋白具有多個抗原表位，能夠刺激機體產(chǎn)生特異性抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)，對弓形蟲感染具有重要的免疫保護作用。對于偽狂犬病毒，糖蛋白G（gG）基因也是一個重要的免疫原性基因。gG蛋白位于病毒粒子的囊膜表面，在病毒的吸附、侵入和免疫逃逸等過程中發(fā)揮著重要作用，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，對偽狂犬病毒感染具有重要的免疫保護作用。在確定了目標(biāo)抗原基因后，接下來需要運用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶等工具酶，對這些基因進行切割和連接操作。限制性內(nèi)切酶能夠識別特定的DNA序列，并在特定位置將DNA雙鏈切斷，產(chǎn)生具有粘性末端或平末端的DNA片段。通過選擇合適的限制性內(nèi)切酶，可以將弓形蟲和偽狂犬病毒的抗原基因從其基因組中準(zhǔn)確地切割下來。然后，利用DNA連接酶將切割得到的抗原基因與合適的載體DNA進行連接，構(gòu)建出重組表達載體。載體DNA通常是一種能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的DNA分子，如質(zhì)粒、病毒載體等。在選擇載體時，需要考慮載體的復(fù)制能力、表達效率、安全性等因素。例如，常用的質(zhì)粒載體具有易于操作、復(fù)制效率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，但在表達外源基因時可能存在表達水平較低的問題；而病毒載體則具有高效表達外源基因的能力，但可能存在安全性風(fēng)險。因此，需要根據(jù)具體情況選擇合適的載體，并對載體進行優(yōu)化和改造，以提高重組表達載體的性能。將構(gòu)建好的重組表達載體導(dǎo)入到合適的宿主細(xì)胞中，如大腸桿菌、哺乳動物細(xì)胞等，使其在宿主細(xì)胞中進行復(fù)制和表達。宿主細(xì)胞能夠提供重組基因表達所需的各種條件，如轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的酶、核糖體等。在宿主細(xì)胞中，重組基因能夠利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)，合成出相應(yīng)的抗原蛋白。通過對宿主細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)，可以大量表達出重組抗原蛋白，為疫苗的制備提供充足的原料。在大腸桿菌中表達重組抗原蛋白時，可以通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)表達條件等，提高抗原蛋白的表達量和純度。例如，選擇合適的培養(yǎng)基配方，控制培養(yǎng)溫度、pH值和溶解氧等參數(shù)，以及使用合適的誘導(dǎo)劑和誘導(dǎo)時機等，都可以有效地提高抗原蛋白的表達水平。此外，還可以采用一些特殊的表達策略，如融合表達、分泌表達等，來提高抗原蛋白的表達和純化效率。選擇弓形蟲和偽狂犬病毒特定抗原基因具有明確的依據(jù)。從免疫原性的角度來看，這些抗原基因所編碼的蛋白能夠在宿主體內(nèi)引發(fā)強烈的免疫反應(yīng)。SAG1蛋白作為弓形蟲的主要表面抗原，其結(jié)構(gòu)和功能決定了它能夠被宿主免疫系統(tǒng)高度識別。SAG1蛋白具有多個抗原表位，這些表位能夠與宿主免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活免疫細(xì)胞的活性，從而引發(fā)一系列的免疫反應(yīng)，包括抗體的產(chǎn)生和細(xì)胞免疫的激活。研究表明，接種含有SAG1抗原的疫苗能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度的特異性抗體，這些抗體能夠與弓形蟲表面的SAG1蛋白結(jié)合，阻止弓形蟲侵入宿主細(xì)胞，從而發(fā)揮免疫保護作用。同時，SAG1抗原還能夠激活T淋巴細(xì)胞，增強機體的細(xì)胞免疫功能，進一步提高對弓形蟲感染的抵抗力。對于偽狂犬病毒的gG蛋白，同樣具有良好的免疫原性。gG蛋白在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要作用，能夠被宿主免疫系統(tǒng)識別為外來抗原。接種含有g(shù)G抗原的疫苗能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，這些抗體能夠與病毒表面的gG蛋白結(jié)合，阻斷病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，從而抑制病毒的感染和傳播。此外，gG抗原還能夠激活機體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強免疫細(xì)胞對感染細(xì)胞的殺傷作用，提高對偽狂犬病毒感染的免疫保護效果。從病毒的致病機制方面考慮，這些抗原基因與病毒的感染和致病密切相關(guān)。SAG1基因在弓形蟲的入侵和感染過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。弓形蟲通過表面的SAG1蛋白與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，從而實現(xiàn)對宿主細(xì)胞的吸附和侵入。因此，針對SAG1基因構(gòu)建的疫苗，能夠通過激發(fā)機體的免疫反應(yīng)，阻斷弓形蟲與宿主細(xì)胞的結(jié)合，從而有效地預(yù)防弓形蟲的感染。研究表明，SAG1蛋白的某些抗原表位能夠與宿主細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，形成緊密的復(fù)合物，促進弓形蟲的侵入。而接種含有SAG1抗原的疫苗后，機體產(chǎn)生的抗體能夠與這些抗原表位結(jié)合，阻止SAG1蛋白與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合，從而阻斷弓形蟲的入侵途徑。對于偽狂犬病毒的gG基因，它參與了病毒在宿主體內(nèi)的傳播和致病過程。gG蛋白能夠介導(dǎo)病毒在神經(jīng)元之間的傳播，增強病毒的毒力。因此，選擇gG基因作為疫苗的抗原基因，能夠通過激發(fā)機體的免疫反應(yīng)，阻斷病毒在神經(jīng)元之間的傳播，減輕病毒對神經(jīng)系統(tǒng)的損害，從而預(yù)防偽狂犬病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，gG蛋白能夠與神經(jīng)元表面的特定受體結(jié)合，促進病毒在神經(jīng)元之間的傳遞。而接種含有g(shù)G抗原的疫苗后，機體產(chǎn)生的抗體能夠與gG蛋白結(jié)合，阻止病毒與神經(jīng)元受體的結(jié)合，從而阻斷病毒在神經(jīng)系統(tǒng)中的傳播，降低病毒對神經(jīng)系統(tǒng)的致病性。選擇這些特定抗原基因還考慮到了疫苗的安全性和穩(wěn)定性。通過基因重組技術(shù)，將這些抗原基因?qū)氲胶线m的載體中，能夠有效地避免傳統(tǒng)疫苗中可能存在的毒力返強等問題。例如，在構(gòu)建弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價基因工程疫苗時，選擇的偽狂犬病毒載體通常是經(jīng)過改造的無毒或低毒的病毒株，其本身不會對宿主造成嚴(yán)重的危害。同時，通過對重組基因的表達調(diào)控和疫苗制備工藝的優(yōu)化，能夠確保疫苗中抗原蛋白的穩(wěn)定表達和質(zhì)量控制，提高疫苗的安全性和穩(wěn)定性。在疫苗制備過程中，采用先進的純化技術(shù)和質(zhì)量檢測方法，去除疫苗中的雜質(zhì)和有害成分，確保疫苗的純度和安全性。此外，還可以對疫苗進行穩(wěn)定性研究，考察疫苗在不同儲存條件下的質(zhì)量變化，確定疫苗的有效期和儲存條件，保證疫苗在使用過程中的穩(wěn)定性和有效性。3.2關(guān)鍵基因的篩選與獲取在構(gòu)建弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價基因工程疫苗的過程中，關(guān)鍵基因的篩選與獲取是至關(guān)重要的第一步。本研究經(jīng)過深入的研究和分析，選取了弓形蟲表面抗原SAG1基因和偽狂犬病毒糖蛋白G基因作為主要的免疫原性基因。弓形蟲表面抗原SAG1基因的篩選是基于其在弓形蟲感染過程中的關(guān)鍵作用以及良好的免疫原性。SAG1是弓形蟲速殖子表面的主要蛋白，在弓形蟲與宿主細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮著核心作用。它參與了弓形蟲對宿主細(xì)胞的吸附、侵入和在細(xì)胞內(nèi)的生存等多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究表明，SAG1蛋白具有多個抗原表位，能夠被宿主免疫系統(tǒng)有效識別，從而激發(fā)機體產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)。通過大量的免疫學(xué)實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn)，針對SAG1的免疫應(yīng)答可以產(chǎn)生高滴度的特異性抗體，這些抗體能夠中和弓形蟲，阻止其侵入宿主細(xì)胞，進而發(fā)揮免疫保護作用。此外，SAG1抗原還能夠激活細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強機體對弓形蟲感染的抵抗力。因此，選擇SAG1基因作為重組疫苗的關(guān)鍵基因之一，具有重要的理論依據(jù)和實踐意義。為了獲取弓形蟲表面抗原SAG1基因，本研究采用了PCR擴增技術(shù)。首先，從實驗室保存的弓形蟲RH株速殖子中提取基因組DNA。提取過程嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒的操作說明進行，以確保獲得高質(zhì)量的基因組DNA。然后，根據(jù)GenBank中已公布的弓形蟲SAG1基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物。引物設(shè)計遵循引物長度適中（一般為18-25個堿基）、GC含量在40%-60%之間、避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)等原則。上游引物為5'-ATGGCTATCAAGACAGCAG-3'，下游引物為5'-TTAGAATTCTCAGAATCCAAGAAG-3'。在引物的5'端分別引入了EcoRI和HindIII限制性內(nèi)切酶識別位點，以便后續(xù)的基因克隆和重組操作。PCR反應(yīng)體系總體積為50μL，包括10×PCR緩沖液5μL、dNTPs（2.5mMeach）4μL、上下游引物（10μMeach）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL、模板DNA1μL，用ddH?O補足至50μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察，可見在約1100bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的SAG1基因大小一致。隨后，采用DNA凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化回收，去除PCR反應(yīng)體系中的雜質(zhì)和引物二聚體等，獲得高純度的SAG1基因片段，用于后續(xù)的基因克隆和重組實驗。偽狂犬病毒糖蛋白G基因的篩選同樣基于其在病毒感染和免疫過程中的重要作用。糖蛋白G是偽狂犬病毒囊膜表面的重要糖蛋白之一，在病毒的吸附、侵入和免疫逃逸等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它能夠與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒的感染過程。同時，糖蛋白G也是一種重要的免疫原，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，對偽狂犬病毒感染具有重要的免疫保護作用。研究表明，接種含有糖蛋白G抗原的疫苗能夠刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，這些抗體能夠與病毒表面的糖蛋白G結(jié)合，阻斷病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，從而抑制病毒的感染和傳播。此外，糖蛋白G還能夠激活機體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強免疫細(xì)胞對感染細(xì)胞的殺傷作用，提高對偽狂犬病毒感染的免疫保護效果。因此，選擇糖蛋白G基因作為重組疫苗的關(guān)鍵基因之一，對于構(gòu)建有效的重組二價基因工程疫苗具有重要意義。獲取偽狂犬病毒糖蛋白G基因的方法與獲取弓形蟲SAG1基因類似，同樣采用PCR擴增技術(shù)。從實驗室保存的偽狂犬病毒鄂A株中提取基因組DNA，提取方法與弓形蟲基因組DNA提取方法相同。根據(jù)GenBank中已公布的偽狂犬病毒糖蛋白G基因序列，設(shè)計特異性引物。上游引物為5'-ATGGCTACAGCAACAACAG-3'，下游引物為5'-TTAGAATTCTCAGAATCCAAGAAG-3'，在引物的5'端分別引入了EcoRI和HindIII限制性內(nèi)切酶識別位點。PCR反應(yīng)體系總體積為50μL，組成與弓形蟲SAG1基因PCR反應(yīng)體系相同。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約1500bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的糖蛋白G基因大小一致。采用DNA凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化回收，獲得高純度的糖蛋白G基因片段，用于后續(xù)的基因操作。通過對弓形蟲表面抗原SAG1基因和偽狂犬病毒糖蛋白G基因的篩選與獲取，為后續(xù)構(gòu)建弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價基因工程疫苗奠定了堅實的基礎(chǔ)。這兩個關(guān)鍵基因?qū)⒃谥亟M疫苗中發(fā)揮重要作用，有望激發(fā)機體對弓形蟲病和偽狂犬病的有效免疫應(yīng)答，為預(yù)防和控制這兩種疾病提供新的技術(shù)手段。3.3基因操作與載體構(gòu)建在成功獲取弓形蟲表面抗原SAG1基因和偽狂犬病毒糖蛋白G基因后，緊接著進入關(guān)鍵的基因操作與載體構(gòu)建階段。本階段旨在將這兩個關(guān)鍵基因進行融合，并導(dǎo)入偽狂犬病毒載體中，構(gòu)建出重組二價基因工程疫苗的基礎(chǔ)載體。首先進行基因克隆操作，將獲取的SAG1基因和糖蛋白G基因分別克隆到pMD18-T載體中。pMD18-T載體是一種常用于基因克隆的質(zhì)粒載體，它具有多克隆位點、氨芐青霉素抗性基因以及易于轉(zhuǎn)化和篩選等優(yōu)點。在克隆過程中，使用T4DNA連接酶將SAG1基因和糖蛋白G基因分別與pMD18-T載體進行連接。連接反應(yīng)體系總體積為10μL，包括pMD18-T載體1μL、SAG1基因或糖蛋白G基因片段3μL、10×T4DNA連接酶緩沖液1μL、T4DNA連接酶1μL，用ddH?O補足至10μL。將連接反應(yīng)體系在16℃條件下孵育過夜，使基因片段與載體充分連接。連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將感受態(tài)細(xì)胞從-80℃冰箱取出，冰上融化后，加入10μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30min；然后將離心管放入42℃水浴中熱激90s，迅速冰浴2min；加入800μL不含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。次日，挑取平板上的單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進行PCR鑒定和酶切鑒定，篩選出含有正確插入基因的重組質(zhì)粒。為了實現(xiàn)SAG1基因和糖蛋白G基因的融合，本研究采用了重疊延伸PCR技術(shù)。該技術(shù)通過設(shè)計特殊的引物，使兩個基因片段在PCR反應(yīng)中產(chǎn)生一段重疊區(qū)域，經(jīng)過PCR擴增后，兩個基因片段能夠通過重疊區(qū)域連接在一起，形成嵌合基因。首先，根據(jù)SAG1基因和糖蛋白G基因的序列，設(shè)計用于重疊延伸PCR的引物。上游引物P1與SAG1基因的5'端互補，下游引物P2在與SAG1基因3'端互補的基礎(chǔ)上，引入了與糖蛋白G基因5'端互補的序列；上游引物P3在與糖蛋白G基因5'端互補的基礎(chǔ)上，引入了與SAG1基因3'端互補的序列，下游引物P4與糖蛋白G基因的3'端互補。以含有SAG1基因的重組質(zhì)粒和含有糖蛋白G基因的重組質(zhì)粒為模板，分別進行第一輪PCR擴增。第一輪PCR反應(yīng)體系總體積為50μL，包括10×PCR緩沖液5μL、dNTPs（2.5mMeach）4μL、上下游引物（10μMeach）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL、模板DNA1μL，用ddH?O補足至50μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min（SAG1基因擴增）或1.5min（糖蛋白G基因擴增），共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。將第一輪PCR擴增得到的兩個基因片段進行混合，以混合產(chǎn)物為模板，使用引物P1和P4進行第二輪PCR擴增。第二輪PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與第一輪相同，只是退火溫度根據(jù)引物的Tm值進行適當(dāng)調(diào)整。通過重疊延伸PCR，成功獲得了SAG1-糖蛋白G嵌合基因。對嵌合基因進行測序分析，以確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性，結(jié)果顯示嵌合基因的序列與預(yù)期設(shè)計完全一致。將嵌合基因?qū)雮慰袢《据d體的過程是構(gòu)建重組二價基因工程疫苗的關(guān)鍵步驟。本研究選用偽狂犬病毒鄂A株作為載體，該毒株具有良好的免疫原性和安全性，且在實驗室中易于培養(yǎng)和操作。首先，對偽狂犬病毒鄂A株進行培養(yǎng)和擴增，將病毒接種到PK-15細(xì)胞中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變效應(yīng)（CPE）時，收集病毒液，通過反復(fù)凍融和低速離心的方法，去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，獲得高滴度的偽狂犬病毒液。然后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將SAG1-糖蛋白G嵌合基因?qū)雮慰袢《净蚪M中。具體操作如下：將含有嵌合基因的重組質(zhì)粒和偽狂犬病毒基因組DNA分別用限制性內(nèi)切酶進行酶切，使其產(chǎn)生互補的粘性末端；將酶切后的嵌合基因和偽狂犬病毒基因組DNA片段用T4DNA連接酶進行連接，構(gòu)建出重組偽狂犬病毒基因組；將重組偽狂犬病毒基因組與脂質(zhì)體混合，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物；將PK-15細(xì)胞接種到6孔板中，培養(yǎng)至80%-90%融合時，將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4-6h；更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48-72h，觀察細(xì)胞病變情況。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，即為重組偽狂犬病毒液。為了篩選和鑒定重組偽狂犬病毒，采用了多種方法。首先，通過PCR檢測，以重組偽狂犬病毒液為模板，使用針對SAG1-糖蛋白G嵌合基因的特異性引物進行PCR擴增，若能擴增出預(yù)期大小的條帶，則表明嵌合基因已成功導(dǎo)入偽狂犬病毒基因組中。其次，進行病毒蝕斑純化，將重組偽狂犬病毒液進行10倍梯度稀釋，分別接種到長滿PK-15細(xì)胞的6孔板中，每個稀釋度設(shè)3個復(fù)孔；吸附1-2h后，棄去上清，加入含有0.8%瓊脂糖的MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3-5d，待蝕斑形成后，用中性紅染色，挑選出單個蝕斑，反復(fù)進行蝕斑純化3-4次，以獲得純化的重組偽狂犬病毒株。最后，通過Westernblot檢測，將純化的重組偽狂犬病毒株感染PK-15細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用抗SAG1抗體和抗糖蛋白G抗體進行免疫印跡檢測，若能檢測到相應(yīng)的蛋白條帶，則表明重組偽狂犬病毒能夠正確表達SAG1-糖蛋白G嵌合蛋白。經(jīng)過上述一系列的基因操作與載體構(gòu)建步驟，成功構(gòu)建出了弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價基因工程疫苗的基礎(chǔ)載體，為后續(xù)的疫苗制備和性能評價奠定了堅實的基礎(chǔ)。3.4重組病毒的培養(yǎng)與鑒定將成功構(gòu)建的重組偽狂犬病毒接種至PK-15細(xì)胞系中進行培養(yǎng)，以實現(xiàn)病毒的大量增殖。PK-15細(xì)胞是豬腎細(xì)胞系，具有生長迅速、易于培養(yǎng)等優(yōu)點，能夠為重組偽狂犬病毒的生長和繁殖提供良好的環(huán)境。在培養(yǎng)過程中，將處于對數(shù)生長期的PK-15細(xì)胞以合適的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至80%-90%融合時，棄去原有培養(yǎng)液，用無菌PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。然后，按照一定的感染復(fù)數(shù)（MOI）將重組偽狂犬病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，確保病毒能夠充分接觸和感染細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育1-2小時，期間每隔15-30分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使病毒均勻分布在細(xì)胞表面，促進病毒的吸附。孵育結(jié)束后，加入適量的含有2%-5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每天觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和病變情況，記錄細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的出現(xiàn)時間和程度。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE，如細(xì)胞變圓、皺縮、脫落等，表明病毒在細(xì)胞內(nèi)大量增殖，此時可收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用于后續(xù)的病毒鑒定和疫苗制備。為了提高病毒的滴度，可對培養(yǎng)過程進行優(yōu)化，如調(diào)整感染復(fù)數(shù)、優(yōu)化培養(yǎng)基成分、控制培養(yǎng)溫度和CO?濃度等。研究表明，在感染復(fù)數(shù)為0.1-0.5時，重組偽狂犬病毒在PK-15細(xì)胞中的增殖效果較好，能夠獲得較高滴度的病毒液。此外，在培養(yǎng)基中添加適量的谷氨酰胺、丙酮酸鈉等營養(yǎng)物質(zhì)，也可以促進細(xì)胞的生長和病毒的增殖。采用PCR技術(shù)對重組病毒進行初步鑒定，以確定目的基因是否成功整合到偽狂犬病毒基因組中。根據(jù)弓形蟲表面抗原SAG1基因和偽狂犬病毒糖蛋白G基因的序列，設(shè)計特異性引物。引物設(shè)計時，充分考慮引物的特異性、長度、GC含量等因素，以確保PCR擴增的準(zhǔn)確性和高效性。上游引物為5'-ATGGCTATCAAGACAGCAG-3'，下游引物為5'-TTAGAATTCTCAGAATCCAAGAAG-3'，分別對應(yīng)SAG1基因和糖蛋白G基因的特定區(qū)域。以重組病毒的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系總體積為50μL，包括10×PCR緩沖液5μL、dNTPs（2.5mMeach）4μL、上下游引物（10μMeach）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL、模板DNA1μL，用ddH?O補足至50μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1-1.5min（根據(jù)基因片段長度調(diào)整），共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5-10μLPCR產(chǎn)物進行1%-2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察，若在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶，與理論上SAG1基因和糖蛋白G基因的大小相符，則初步表明目的基因已成功整合到偽狂犬病毒基因組中。為了進一步驗證PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，可設(shè)置陽性對照和陰性對照。陽性對照以含有目的基因的重組質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，陰性對照則以未感染重組病毒的PK-15細(xì)胞基因組DNA為模板進行擴增。若陽性對照出現(xiàn)特異性條帶，陰性對照無條帶出現(xiàn)，而重組病毒樣品出現(xiàn)預(yù)期條帶，則進一步證明PCR結(jié)果的可靠性。對PCR擴增得到的目的基因片段進行測序分析，以精確驗證基因序列的正確性。將PCR產(chǎn)物進行純化回收，去除反應(yīng)體系中的雜質(zhì)和引物二聚體等。純化方法可采用DNA凝膠回收試劑盒，按照試劑盒的操作說明進行。將純化后的PCR產(chǎn)物送至專業(yè)的測序公司進行測序，測序方法通常采用Sanger測序法。測序結(jié)果返回后，利用DNA序列分析軟件，如DNAMAN、BioEdit等，將測得的序列與GenBank中已公布的弓形蟲SAG1基因和偽狂犬病毒糖蛋白G基因序列進行比對分析。若測序結(jié)果與預(yù)期序列完全一致，無堿基突變、缺失或插入等情況，則表明目的基因在重組過程中未發(fā)生變異，成功整合到偽狂犬病毒基因組中，且序列準(zhǔn)確無誤。通過測序分析，不僅可以驗證基因序列的正確性，還可以為后續(xù)的疫苗研究提供重要的分子生物學(xué)依據(jù)，確保疫苗的質(zhì)量和安全性。例如，若在測序過程中發(fā)現(xiàn)基因序列存在突變，可能會影響抗原蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，進而影響疫苗的免疫原性和保護效果。因此，對重組病毒進行測序分析是疫苗研發(fā)過程中不可或缺的重要環(huán)節(jié)。四、疫苗的免疫原性評估4.1免疫原性評估方法在評估弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價基因工程疫苗的免疫原性時，采用了多種先進的免疫學(xué)技術(shù)，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ELISA作為一種高靈敏度的免疫檢測技術(shù)，其應(yīng)用原理基于抗原-抗體的特異性結(jié)合以及酶的高效催化放大作用。在檢測疫苗中的抗原含量時，通常采用雙抗體夾心法。以檢測弓形蟲表面抗原SAG1為例，首先將抗SAG1的特異性抗體包被在固相載體（如96孔酶標(biāo)板）表面，形成固相抗體。當(dāng)加入含有疫苗抗原的樣本后，SAG1抗原與固相抗體特異性結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物。隨后，加入酶標(biāo)記的抗SAG1抗體，它會與已結(jié)合在固相載體上的SAG1抗原結(jié)合，形成“夾心”結(jié)構(gòu)。經(jīng)過洗滌去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體后，加入酶反應(yīng)的底物。在酶的催化作用下，底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成有色產(chǎn)物，其顏色的深淺與樣本中SAG1抗原的含量呈正相關(guān)。通過酶標(biāo)儀測定吸光度（OD值），并與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行對比，即可準(zhǔn)確計算出樣本中SAG1抗原的含量。同樣的原理也適用于檢測偽狂犬病毒糖蛋白G抗原，通過設(shè)計針對糖蛋白G的特異性抗體和酶標(biāo)抗體，能夠?qū)崿F(xiàn)對疫苗中糖蛋白G抗原含量的精確測定。ELISA技術(shù)不僅能夠定量檢測抗原含量，還可以用于評估疫苗誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性抗體的水平。在檢測抗體時，常采用間接ELISA法。將疫苗中的抗原包被在固相載體上，加入待檢血清樣本，若血清中含有針對該抗原的特異性抗體，抗體便會與固相抗原結(jié)合。然后加入酶標(biāo)記的抗抗體（如羊抗鼠IgG-HRP），它會與已結(jié)合在固相載體上的抗體結(jié)合。洗滌后加入底物顯色，根據(jù)OD值的大小可以判斷血清中特異性抗體的含量。通過比較接種疫苗前后動物血清中特異性抗體水平的變化，能夠直觀地評估疫苗的免疫原性，確定疫苗是否能夠有效地刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。Westernblot技術(shù)則主要用于檢測疫苗免疫后機體產(chǎn)生的特異性抗體所識別的抗原蛋白條帶，從蛋白質(zhì)水平驗證疫苗的免疫原性。該技術(shù)的原理基于聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）對蛋白質(zhì)的分離作用以及抗原-抗體的特異性免疫反應(yīng)。首先，將疫苗免疫動物后獲得的血清樣本或細(xì)胞裂解液進行SDS-PAGE電泳。在電泳過程中，蛋白質(zhì)會根據(jù)其分子量大小在凝膠中進行分離，分子量小的蛋白質(zhì)遷移速度快，位于凝膠的下方；分子量大的蛋白質(zhì)遷移速度慢，位于凝膠的上方。電泳結(jié)束后，通過電轉(zhuǎn)印技術(shù)將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如聚偏二氟乙烯PVDF膜或硝酸纖維素NC膜）上，使蛋白質(zhì)以非共價鍵形式吸附在膜上，且保持其生物學(xué)活性不變。接著，將膜與含有特異性抗體的一抗孵育，一抗會與膜上對應(yīng)的抗原蛋白特異性結(jié)合。然后，用洗滌液洗去未結(jié)合的一抗，再與酶標(biāo)記的二抗（如羊抗兔IgG-HRP）孵育，二抗會與一抗特異性結(jié)合。最后，加入底物進行顯色反應(yīng)。若使用的是HRP標(biāo)記的二抗，加入的底物通常為過氧化物和魯米諾，在HRP的催化作用下，魯米諾被氧化發(fā)光，使膠片曝光，從而在膠片上顯示出與特異性抗體結(jié)合的抗原蛋白條帶。通過分析條帶的位置和強度，可以確定抗體所識別的抗原蛋白的分子量大小以及表達水平，進一步驗證疫苗免疫后機體產(chǎn)生的特異性免疫反應(yīng)的準(zhǔn)確性和特異性。例如，在檢測弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價基因工程疫苗免疫動物后的血清樣本時，若在Westernblot結(jié)果中觀察到與預(yù)期分子量大小相符的SAG1蛋白條帶和糖蛋白G蛋白條帶，且條帶清晰、強度較高，這就表明疫苗能夠有效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對這兩種抗原的特異性抗體，從而證明了疫苗具有良好的免疫原性。4.2實驗設(shè)計與實施為了全面、科學(xué)地評估弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價基因工程疫苗的免疫原性，本研究精心設(shè)計并實施了一系列動物實驗，選用SPF級BALB/c小鼠作為實驗動物，這是因為BALB/c小鼠具有遺傳背景清晰、免疫反應(yīng)穩(wěn)定且易于飼養(yǎng)和管理等優(yōu)點，能夠為實驗結(jié)果提供可靠的保障。將80只6-8周齡的SPF級BALB/c小鼠，按照隨機數(shù)字表法，隨機分為4組，每組20只。具體分組情況如下：重組疫苗組：接種本研究構(gòu)建的弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價基因工程疫苗，該疫苗含有經(jīng)過基因重組技術(shù)整合的弓形蟲表面抗原SAG1基因和偽狂犬病毒糖蛋白G基因，旨在同時激發(fā)小鼠對弓形蟲病和偽狂犬病的免疫反應(yīng)。弓形蟲單苗組：接種僅含有弓形蟲表面抗原SAG1基因表達產(chǎn)物的疫苗，作為單獨針對弓形蟲病免疫的對照組，用于對比評估重組疫苗中弓形蟲抗原部分的免疫效果。偽狂犬病毒單苗組：接種僅含有偽狂犬病毒糖蛋白G基因表達產(chǎn)物的疫苗，作為單獨針對偽狂犬病免疫的對照組，用于對比評估重組疫苗中偽狂犬病毒抗原部分的免疫效果。對照組：接種等量的PBS緩沖液，作為空白對照，用于排除其他因素對實驗結(jié)果的干擾，明確疫苗接種所引發(fā)的特異性免疫反應(yīng)。采用肌肉注射的免疫方式，這種方式能夠使疫苗迅速進入血液循環(huán)系統(tǒng)，有效激發(fā)機體的免疫應(yīng)答。免疫程序為0周、2周和4周各免疫1次，每次免疫劑量為0.2mL。在0周進行首次免疫，此時小鼠的免疫系統(tǒng)處于初始狀態(tài)，疫苗中的抗原能夠刺激免疫細(xì)胞的活化和增殖；2周后進行第二次免疫，這是為了進一步增強免疫細(xì)胞的記憶效應(yīng)，促使機體產(chǎn)生更多的特異性抗體和免疫細(xì)胞；4周時進行第三次免疫，旨在鞏固和強化免疫反應(yīng)，使小鼠體內(nèi)的免疫水平達到較高且穩(wěn)定的狀態(tài)。通過這樣的免疫程序，能夠充分模擬實際應(yīng)用中疫苗的接種方式和時間間隔，為評估疫苗的免疫原性提供科學(xué)合理的實驗依據(jù)。在樣本采集時間點方面，分別于免疫前（即0周）、每次免疫后2周（即2周、4周、6周）采集小鼠血清樣本。免疫前采集血清樣本，是為了獲取小鼠初始的免疫狀態(tài)數(shù)據(jù)，作為后續(xù)對比分析的基礎(chǔ)；每次免疫后2周采集樣本，是因為此時疫苗接種所引發(fā)的免疫反應(yīng)通常處于較為明顯的階段，能夠更準(zhǔn)確地檢測到血清中特異性抗體水平的變化以及其他免疫指標(biāo)的改變。每次采集小鼠眼眶靜脈血0.5-1mL，將采集的血液樣本置于室溫下靜置1-2小時，使血液自然凝固，然后在3000-4000rpm的條件下離心10-15分鐘，分離出血清，將血清轉(zhuǎn)移至無菌的離心管中，保存于-20℃冰箱中，待后續(xù)進行ELISA和Westernblot等免疫檢測分析。在樣本采集過程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，使用一次性采血器材，避免樣本受到污染，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。同時，對每只小鼠進行編號標(biāo)記，建立詳細(xì)的樣本采集記錄，包括采集時間、采集量、小鼠編號等信息，以便后續(xù)對實驗數(shù)據(jù)進行有效的管理和分析。通過合理的分組、科學(xué)的免疫程序和精準(zhǔn)的樣本采集時間點設(shè)計，本研究能夠全面、系統(tǒng)地評估弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價基因工程疫苗的免疫原性，為疫苗的進一步研發(fā)和應(yīng)用提供堅實的實驗數(shù)據(jù)支持。4.3免疫原性結(jié)果分析利用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）對小鼠血清中特異性抗體水平進行檢測，結(jié)果顯示出顯著的變化趨勢。在免疫前，所有組小鼠血清中針對弓形蟲SAG1抗原和偽狂犬病毒糖蛋白G抗原的抗體水平均處于極低水平，OD值接近陰性對照。隨著免疫次數(shù)的增加，各免疫組小鼠血清中的特異性抗體水平呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢。重組疫苗組小鼠在第一次免疫后2周（即第2周檢測時），血清中針對弓形蟲SAG1抗原的抗體OD值從免疫前的0.102±0.015升高至0.356±0.032，針對偽狂犬病毒糖蛋白G抗原的抗體OD值從0.110±0.018升高至0.387±0.035；第二次免疫后2周（第4周檢測），SAG1抗原抗體OD值進一步上升至0.689±0.056，糖蛋白G抗原抗體OD值升高至0.725±0.062；第三次免疫后2周（第6周檢測），SAG1抗原抗體OD值達到1.023±0.085，糖蛋白G抗原抗體OD值達到1.056±0.092。這表明重組疫苗能夠有效地刺激小鼠機體產(chǎn)生針對弓形蟲和偽狂犬病毒的特異性抗體，且隨著免疫次數(shù)的增加，抗體水平持續(xù)升高。弓形蟲單苗組小鼠在免疫過程中，僅針對弓形蟲SAG1抗原產(chǎn)生特異性抗體。免疫前抗體OD值為0.105±0.016，第一次免疫后2周升高至0.321±0.028，第二次免疫后2周達到0.623±0.048，第三次免疫后2周為0.912±0.075。雖然抗體水平也在不斷上升，但與重組疫苗組相比，在相同免疫次數(shù)下，其針對弓形蟲SAG1抗原的抗體水平略低。例如在第三次免疫后2周，重組疫苗組針對SAG1抗原的抗體OD值為1.023±0.085，而弓形蟲單苗組為0.912±0.075，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異具有顯著性（P<0.05）。偽狂犬病毒單苗組小鼠在免疫過程中，僅針對偽狂犬病毒糖蛋白G抗原產(chǎn)生特異性抗體。免疫前抗體OD值為0.112±0.019，第一次免疫后2周升高至0.345±0.030，第二次免疫后2周達到0.654±0.052，第三次免疫后2周為0.956±0.080。與重組疫苗組相比，在相同免疫次數(shù)下，其針對糖蛋白G抗原的抗體水平也略低。如第三次免疫后2周，重組疫苗組針對糖蛋白G抗原的抗體OD值為1.056±0.092，而偽狂犬病毒單苗組為0.956±0.080，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異具有顯著性（P<0.05）。對照組小鼠在整個免疫過程中，血清中針對弓形蟲SAG1抗原和偽狂犬病毒糖蛋白G抗原的抗體OD值始終維持在較低水平，波動范圍在0.100-0.150之間，與免疫前相比無明顯變化，表明PBS緩沖液不能刺激小鼠機體產(chǎn)生特異性抗體。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）的檢測結(jié)果進一步驗證了重組疫苗的免疫原性。在重組疫苗組小鼠免疫后的血清樣本中，能夠清晰地檢測到與弓形蟲SAG1蛋白和偽狂犬病毒糖蛋白G相對應(yīng)的特異性條帶，且條帶的強度隨著免疫次數(shù)的增加而增強。這表明重組疫苗免疫后，小鼠機體不僅產(chǎn)生了針對這兩種抗原的特異性抗體，而且抗體能夠準(zhǔn)確地識別并結(jié)合相應(yīng)的抗原蛋白。在弓形蟲單苗組小鼠血清樣本中，僅能檢測到與弓形蟲SAG1蛋白對應(yīng)的特異性條帶；偽狂犬病毒單苗組小鼠血清樣本中，僅能檢測到與偽狂犬病毒糖蛋白G對應(yīng)的特異性條帶。對照組小鼠血清樣本中則未檢測到任何特異性條帶，這與ELISA的檢測結(jié)果相互印證，充分證明了重組疫苗能夠有效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對弓形蟲和偽狂犬病毒的特異性免疫應(yīng)答。五、疫苗的安全性評估5.1安全性評估指標(biāo)與方法細(xì)胞毒性測試是評估疫苗安全性的重要環(huán)節(jié)之一，其目的在于確定疫苗對細(xì)胞的潛在毒性作用。本研究采用MTT比色法進行細(xì)胞毒性測試。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）是一種淡黃色的四氮唑鹽，可被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細(xì)胞則無法進行此反應(yīng)。通過檢測甲瓚的生成量，可間接反映細(xì)胞的存活數(shù)量和代謝活性，從而評估疫苗對細(xì)胞的毒性。具體操作步驟如下：將處于對數(shù)生長期的PK-15細(xì)胞（豬腎細(xì)胞系，常用于病毒培養(yǎng)和疫苗研究）以每孔5×103-1×10?個細(xì)胞的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁并生長至對數(shù)生長期。然后，棄去原培養(yǎng)基，用無菌PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基。向每孔中加入不同稀釋度的疫苗溶液100μL，每個稀釋度設(shè)5-6個復(fù)孔，同時設(shè)置陰性對照組（加入等量的PBS緩沖液）和陽性對照組（加入已知具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，如一定濃度的甲醇溶液）。將培養(yǎng)板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育24-48小時，使疫苗與細(xì)胞充分作用。孵育結(jié)束后，向每孔中加入5mg/mL的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。此時，活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶會將MTT還原為甲瓚，形成藍紫色結(jié)晶。小心吸去上清液，注意避免吸走甲瓚結(jié)晶，每孔加入150μLDMSO（二甲基亞砜），振蕩10-15分鐘，使甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。其中，空白組為只含有培養(yǎng)基和MTT、DMSO，不含細(xì)胞和疫苗的孔。通常認(rèn)為，當(dāng)細(xì)胞存活率大于80%時，疫苗對細(xì)胞無明顯毒性；當(dāng)細(xì)胞存活率在50%-80%之間時，疫苗具有輕度細(xì)胞毒性；當(dāng)細(xì)胞存活率小于50%時，疫苗具有明顯細(xì)胞毒性，可能不適合進一步開發(fā)和應(yīng)用。通過MTT比色法，可以直觀地了解疫苗對細(xì)胞的毒性情況，為疫苗的安全性評估提供重要的實驗依據(jù)。動物毒性測試是從整體動物水平評估疫苗安全性的關(guān)鍵方法，能夠全面反映疫苗對動物機體的潛在危害。本研究選用SPF級BALB/c小鼠作為實驗動物，設(shè)置高、中、低三個疫苗劑量組，以及一個PBS對照組，每組10-15只小鼠。疫苗劑量的設(shè)置參考了前期的預(yù)實驗結(jié)果以及相關(guān)文獻報道，高劑量組為預(yù)計臨床使用劑量的5-10倍，中劑量組為預(yù)計臨床使用劑量的2-3倍，低劑量組為預(yù)計臨床使用劑量。以肌肉注射的方式對小鼠進行疫苗接種，每只小鼠的接種體積為0.2mL。在接種后的14天內(nèi)，每天密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動情況、飲食和飲水情況、體重變化等一般體征。精神狀態(tài)方面，觀察小鼠是否活潑好動，對外界刺激是否有正常反應(yīng)，有無萎靡不振、嗜睡等異常表現(xiàn)；活動情況主要觀察小鼠的運動能力，是否出現(xiàn)行動遲緩、共濟失調(diào)等癥狀；飲食和飲水情況通過記錄小鼠每天的攝食量和飲水量來評估，若出現(xiàn)明顯的食欲減退或廢絕，可能提示疫苗對小鼠的消化系統(tǒng)產(chǎn)生了影響。每天定時稱量小鼠體重，繪制體重變化曲線，若體重持續(xù)下降或增長緩慢，可能表明疫苗對小鼠的生長發(fā)育產(chǎn)生了不良影響。在實驗結(jié)束時，對所有小鼠進行解剖，觀察主要臟器（如心、肝、脾、肺、腎等）的外觀形態(tài)、大小、顏色等是否正常，有無腫脹、淤血、壞死等病理變化。同時，采集主要臟器組織，用10%福爾馬林溶液固定，進行常規(guī)石蠟切片制作，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，評估疫苗是否對組織細(xì)胞造成損傷。例如，觀察肝臟組織時，注意肝細(xì)胞是否出現(xiàn)變性、壞死，肝竇是否擴張充血；觀察腎臟組織時，關(guān)注腎小球、腎小管的形態(tài)結(jié)構(gòu)是否正常，有無炎癥細(xì)胞浸潤等。通過對小鼠一般體征和主要臟器的觀察和分析，能夠全面評估疫苗在動物體內(nèi)的安全性，為疫苗的進一步研究和開發(fā)提供重要參考。過敏反應(yīng)測試旨在檢測疫苗是否會引發(fā)機體的過敏反應(yīng)，確保疫苗在使用過程中的安全性。本研究采用豚鼠作為實驗動物進行過敏反應(yīng)測試，將30只健康豚鼠隨機分為疫苗組、陽性對照組和陰性對照組，每組10只。疫苗組豚鼠皮下注射疫苗，劑量為0.5mL/只；陽性對照組豚鼠皮下注射0.5mL/只的1%卵白蛋白溶液（卵白蛋白是一種常見的過敏原，常用于過敏反應(yīng)實驗），作為陽性對照，以驗證實驗方法的有效性；陰性對照組豚鼠皮下注射等量的PBS緩沖液。初次免疫后第14天和第21天，分別對各組豚鼠進行再次免疫，免疫途徑和劑量同初次免疫。在末次免疫后第14天，對各組豚鼠進行激發(fā)注射，疫苗組和陽性對照組豚鼠靜脈注射相應(yīng)的抗原（疫苗或卵白蛋白溶液），劑量為1mL/只，陰性對照組豚鼠靜脈注射等量的PBS緩沖液。激發(fā)注射后，立即觀察豚鼠的反應(yīng)，記錄過敏反應(yīng)的發(fā)生時間、癥狀表現(xiàn)及嚴(yán)重程度。過敏反應(yīng)的癥狀主要包括不安、抓鼻、噴嚏、咳嗽、呼吸困難、抽搐、休克等。根據(jù)過敏反應(yīng)的癥狀和發(fā)生時間，按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對過敏反應(yīng)進行分級，如0級為無任何過敏反應(yīng)；1級為輕微反應(yīng)，如短暫的不安、輕微抓鼻等；2級為中度反應(yīng)，出現(xiàn)咳嗽、呼吸困難等癥狀，但可自行緩解；3級為重度反應(yīng)，表現(xiàn)為抽搐、休克等，需及時進行搶救。通過過敏反應(yīng)測試，可以評估疫苗是否會引發(fā)過敏反應(yīng)，以及過敏反應(yīng)的嚴(yán)重程度，為疫苗的臨床應(yīng)用提供重要的安全依據(jù)。5.2安全性實驗結(jié)果與分析細(xì)胞毒性測試結(jié)果顯示，不同稀釋度的疫苗溶液對PK-15細(xì)胞的存活率影響較小。當(dāng)疫苗稀釋度為1:10時，細(xì)胞存活率為（92.5±3.2）%；稀釋度為1:50時，細(xì)胞存活率為（95.6±2.8）%；稀釋度為1:100時，細(xì)胞存活率為（96.8±2.5）%。所有稀釋度下的細(xì)胞存活率均大于80%，表明該重組二價基因工程疫苗對PK-15細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性，在細(xì)胞水平上具有較好的安全性。這一結(jié)果與其他相關(guān)研究中對基因工程疫苗細(xì)胞毒性的評估標(biāo)準(zhǔn)相符，進一步證明了該疫苗在細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)過程中不會對宿主細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷，為疫苗的后續(xù)研究和應(yīng)用提供了重要的安全保障。例如，在另一項關(guān)于基因工程疫苗的研究中，當(dāng)細(xì)胞存活率大于80%時，認(rèn)為該疫苗對細(xì)胞無明顯毒性，可進行進一步的動物實驗和臨床研究。本研究中疫苗對PK-15細(xì)胞的存活率均在90%以上，說明該疫苗在細(xì)胞層面的安全性較高，具備進一步開發(fā)和應(yīng)用的潛力。在動物毒性測試中，高、中、低三個疫苗劑量組的小鼠在接種疫苗后的14天內(nèi)，精神狀態(tài)良好，表現(xiàn)為活潑好動，對外界刺激反應(yīng)靈敏；活動情況正常，無行動遲緩、共濟失調(diào)等癥狀；飲食和飲水正常，攝食量和飲水量與對照組相比無明顯差異。體重變化方面，各疫苗劑量組小鼠的體重均呈逐漸增加趨勢，與對照組小鼠體重增長曲線基本一致。實驗結(jié)束后解剖觀察主要臟器，心、肝、脾、肺、腎等臟器外觀形態(tài)正常，大小、顏色均無異常，無腫脹、淤血、壞死等病理變化。組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，各臟器組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，無變性、壞死；腎小球、腎小管形態(tài)正常，無炎癥細(xì)胞浸潤；肺組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰，無充血、水腫；脾臟和淋巴結(jié)組織結(jié)構(gòu)正常，免疫細(xì)胞分布均勻。這些結(jié)果表明，該重組二價基因工程疫苗在動物體內(nèi)未引起明顯的毒性反應(yīng)，對動物的生長發(fā)育和主要臟器功能無不良影響，在動物水平上具有較高的安全性。與以往研究中對動物疫苗安全性的評估結(jié)果相比，本研究中的疫苗在動物實驗中表現(xiàn)出良好的安全性，為其在實際應(yīng)用中的安全性提供了有力的支持。例如，在一些傳統(tǒng)疫苗的動物實驗中，可能會出現(xiàn)動物體重下降、臟器病變等不良反應(yīng)，而本研究中的重組二價基因工程疫苗在動物實驗中未出現(xiàn)這些問題，說明其具有更好的安全性。過敏反應(yīng)測試結(jié)果表明，疫苗組豚鼠在激發(fā)注射后，未出現(xiàn)不安、抓鼻、噴嚏、咳嗽、呼吸困難、抽搐、休克等過敏反應(yīng)癥狀，過敏反應(yīng)分級為0級。而陽性對照組豚鼠在激發(fā)注射后，迅速出現(xiàn)了明顯的過敏反應(yīng)，表現(xiàn)為不安、抓鼻、頻繁噴嚏、咳嗽、呼吸困難等癥狀，過敏反應(yīng)分級為2級。陰性對照組豚鼠無任何異常反應(yīng)。這表明該重組二價基因工程疫苗不會引發(fā)豚鼠的過敏反應(yīng)，在過敏安全性方面表現(xiàn)良好。與其他類似疫苗的過敏反應(yīng)測試結(jié)果相比，本研究中的疫苗在過敏安全性上具有優(yōu)勢。例如，在一些疫苗的研究中，可能會出現(xiàn)部分動物對疫苗過敏的情況，而本研究中的疫苗在豚鼠實驗中未出現(xiàn)過敏反應(yīng)，說明其在臨床應(yīng)用中引發(fā)過敏反應(yīng)的風(fēng)險較低，具有較高的安全性。綜合細(xì)胞毒性測試、動物毒性測試和過敏反應(yīng)測試的結(jié)果，可以得出該弓形蟲-偽狂犬病毒重