目錄中文摘要……………1英文摘要……………2前言……………4文獻(xiàn)綜述……………5正文……………11分析討論……………19結(jié)論……………21參考文獻(xiàn)……………22致謝……………25個(gè)人簡(jiǎn)歷……………26木犀草素在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究25-摘要目的：近年來，人們對(duì)木犀草素的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和體內(nèi)活性代謝產(chǎn)物的研究給予了關(guān)注。通過研究木犀草素的藥代動(dòng)力學(xué)過程，以此求出藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及所需數(shù)據(jù)，有助于為擬定出合理給藥方案奠定基礎(chǔ)，為木犀草素和敗醬草中其他化學(xué)成分的生物分析提供強(qiáng)有力的參考價(jià)值。方法：本實(shí)驗(yàn)通過乙醇回流、HPD-300樹脂純化得到敗醬草總黃酮純化物，再制成凍干粉，加蒸餾水稀釋后，作為大鼠的灌胃藥液。分別從給藥和不給藥的大鼠眼眶靜脈處取血，甲醇蛋白沉淀法處理空白血漿以及含藥血漿，最后通過高效液相色譜來對(duì)于血漿上清液進(jìn)行分析，并且對(duì)于提取回收率以及專屬性作了考察，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確和可靠。結(jié)果：木犀草素在口服給藥3.51h后達(dá)到最大血藥濃度為253.34ng/L。給藥后木犀草素的分布半衰期t1/2α為2.29±0.08h，而其消除半衰期t1/2β為4.48±3.25h。結(jié)論：木犀草素在大鼠體內(nèi)分布的速度緩慢，消除的速度較快，在體內(nèi)的平均滯留時(shí)間較短，其在生物體內(nèi)的生物利用度是比較低的。關(guān)鍵詞：敗醬草；木犀草素；藥代動(dòng)力學(xué)

AbstractPurpose：Inrecentyears,peoplepayattentiontothedrugmetabolismdynamicsandactivemetabolitesinthebody.Bystudyingthepharmacokineticprocessofwoodrhinoceros,thepharmacokineticparametersandtherequireddatacanhelptolaythefoundationfortheformulationofareasonabledrugdeliveryplanandprovideastrongreferencevalueforthebioanalysisofotherchemicalcomponentsinwoodrhinocerosandscum.Materialandmethod：Thisexperimentthroughethanolreflux,HPD-300resinpurificationtoobtainthetotalflavonoidpurityofthesaucegrass,andthenmadeintofreeze-driedpowder,withdistilledwaterdiluted,asaratgastricmedicine.Bloodwastakenfromtheodosandtheratsdidnotgivethedrug,methanolproteinprecipitationtreatmentofblankplasmaanddrug-containingplasma,andfinallythroughhigh-efficiencyliquidchromatographytoanalyzetheplasmaliquid,andfortheextractionrecoveryrateandexclusivitymadeaninvestigationtoensuretheaccuracyandreliabilityoftheexperimentalresults.Results：Themaximumbloodconcentrationreached253.34ng/Lafteroraladministrationof3.51h.Thedistributionhalf-lifet1/2alphaafteradministrationofwoodrhinoceroswas2.29to0.08h,whiletheeliminationofhalf-lifet1/2betawas4.48to3.25h.Conclusion：Woodrhinocerosisdistributedslowlyinrats,therateofeliminationisfaster,theaverageretentiontimeinthebodyisshorter,anditsbiologicalutilizationintheorganismisrelativelylow.Keyword：Scumwe;Woodrhinoceros;pharmacokinetics

前言木犀草素（luteolin），化學(xué)名：3',4',5,7-四羥黃酮，別名：黃色黃素、黃示靈，是一種天然黃酮類化合物，多以糖苷的形式存在于多種植物中。具有多種藥理活性，如消炎、抗過敏、降尿酸、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等，臨床主要用于止咳、祛痰、消炎、降尿酸、治療心血管疾病、治療“肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥”，SARS，肝炎等?，F(xiàn)基于UPLC-QqQ-MS技術(shù)，對(duì)木犀草素的提取制備、以及對(duì)血漿在實(shí)驗(yàn)過程中的情況做了較好的記錄，并且根據(jù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，做了穩(wěn)定性和方法性考察，以此得到木犀草素在生物體內(nèi)的各項(xiàng)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，考察其在生物體內(nèi)的生物利用度。可以為木犀草素和敗醬草中其他化學(xué)成分的生物分析奠定重要的基礎(chǔ)，提供強(qiáng)有力的參考價(jià)值。對(duì)進(jìn)一步開發(fā)和利用敗醬草提供一定的參考。

敗醬研究進(jìn)展摘要：傳統(tǒng)中藥敗醬草，資源豐富，藥理活性多樣，近年來廣受研究者們關(guān)注，本文從以下方面展開論述，分別是品種鑒別、化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用以及質(zhì)量評(píng)價(jià)。從而進(jìn)一步闡述敗醬草近年來的相關(guān)研究，為敗醬草的深入研究提供有價(jià)值的參考。關(guān)鍵字：敗醬草；研究進(jìn)展前言：敗醬草，是敗醬科植物黃花敗醬（PatriniascabiosaefoliaFisch.exTrev.)和白花敗醬（Patriniavillosa(Thunb)Juss.）的干燥全草[1]，又名澤敗、鹿腸苦菜等。敗醬草，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，敗醬草味辛；其藥性寒涼。藥物作用的歸屬胃、大腸和肝。此藥可以祛除淤血，止疼，清熱解毒。通過查閱近年來關(guān)于敗醬草藥理研究的論文，發(fā)現(xiàn)敗醬草這味中藥具有多種藥理活性，包括抗氧化自由基，使情緒穩(wěn)定或平靜，抗腫瘤，肝臟保護(hù)和抗菌。本文從通過對(duì)敗醬草的綜述性研究，希望能夠?qū)M(jìn)一步開發(fā)和利用敗醬草提供一定的參考。品種鑒別根據(jù)王立軍等[3]對(duì)敗醬草的本草研究，敗醬草最初記載在本草書籍中名稱為黃花敗醬，而目前認(rèn)為，白花敗醬最早出現(xiàn)于《本草綱目》中。在幾千年的中醫(yī)的傳統(tǒng)給藥方法中，由于區(qū)域差異，幾種敗醬草的替代使用情況較為普遍，從而出現(xiàn)了同名異物的情況，這樣子嚴(yán)重影響了藥物的療效。常常被混淆的品種有黃花敗醬、白花敗醬、苦荬菜、苣荬菜（又稱為北敗醬）、蘇敗醬，這五種敗醬草的有效成分及其藥理作用存在一定的差異，如果不區(qū)分開，會(huì)嚴(yán)重影響臨床療效。為此，為了保證用藥的安全有效，一些研究人員對(duì)敗醬草及其混淆品進(jìn)行了鑒別。其進(jìn)行了敗醬草及其混淆品的相關(guān)鑒別，并指出正品敗醬草與混淆品在幾個(gè)方面的區(qū)別。二者認(rèn)為敗醬草正品的來源應(yīng)該是黃花敗醬（PatriniascabiosaefoliaFisch.exTrev.)以及白花敗醬（Patriniavillosa(Thunb)Juss.）的干燥全草，且凡是正品敗醬草，都具有陳醬氣味,這與其他品種相區(qū)別；他們認(rèn)為，人們誤把苦荬菜作為敗醬草治病的原因是，李時(shí)珍對(duì)于敗醬草名稱和性狀上記載模糊導(dǎo)致的，應(yīng)該及時(shí)修正；對(duì)于蘇敗醬而言，因?yàn)檫@個(gè)藥材歷代本草書籍中就專藥專列，且不管是從植物的基源、化學(xué)成分上而言與正品敗醬草所差甚遠(yuǎn)，不可以代替使用。楊學(xué)浩[4]對(duì)黃花敗醬、白花敗醬、苦荬菜、蘇敗醬這四種敗醬進(jìn)行了區(qū)別，他研究發(fā)現(xiàn)，這四種在功效上均可清熱解毒，不同點(diǎn)在于：黃花敗醬與白花敗醬，相同點(diǎn)在，所屬的科、藥物的性質(zhì)和氣味、藥物作用的定位、功效、藥物的主要療效等方面，區(qū)別在于產(chǎn)地以及地方用藥習(xí)慣的不同；苦荬菜屬菊科，味苦性寒，具有消腫、清濕熱的作用；蘇敗醬屬十字花科，味苦而略帶熱，其作用是補(bǔ)中益氣、清肝明目?；瘜W(xué)成分皂苷類化合物皂苷類成分中的五環(huán)三萜類，是敗醬草的一類主要活性成分，這一類主要存在于黃花敗醬草中，已知目前已分離出五十多種三萜皂苷化合物，依據(jù)母核的不同，可以分為兩大類，分別為齊墩果烷型皂苷類和烏蘇烷型皂苷類。高亮、張琳等[5]、NakanishiT等[6]、楊波等[7]研究發(fā)現(xiàn)黃花敗醬中烏蘇烷型的三萜皂苷主要是23-OH-烏蘇酸[5]、patrinia-glycosideB-Ⅰ[7]等。丁蘭、王瀚等報(bào)道了白花敗醬草中烏蘇酸皂苷元類化合物有烏蘇酸、sulfapatrinosideⅠ[8]；烏蘇烷型化合物有α-香樹精[8]。根據(jù)敗醬草中各種齊墩果烷型化合物苷元取代基結(jié)構(gòu)的不同，又可將其分成四個(gè)大類，分別為常春藤型化合物、齊墩果酸型、環(huán)氧齊墩果烷型、齊墩果酸型。丁蘭、王瀚等[8]報(bào)道了在白花敗醬中所含的齊墩果酸皂苷元類化合物包括：β-香樹精、sulfapatrinosideⅡ；KimYH等[9]報(bào)道敗醬草中含有齊墩果酮酸；對(duì)于黃花敗醬的相關(guān)化學(xué)成分，崔文燕等[10]總結(jié)了所含有的常春藤型化合物分別如下：kalopanxsaponinB、patriniasaponinH3等[10]。高亮、張琳等[5]指出環(huán)氧齊墩果烷型成分包括：12α-環(huán)氧齊墩果烷-28,13β-內(nèi)酯等[5]。他們還報(bào)道齊墩果酸型成分包括：11-羰基-齊墩果酸等[5]。甾醇類化合物黃花敗醬含有甾醇類化合物，白花敗醬也是。崔文燕，劉素香等[10]研究顯示，黃花敗醬和白花敗醬草中含有β-谷甾醇；黃花敗醬草中還存在豆甾醇。環(huán)烯醚萜類化合物黃花敗醬和白花敗醬均含有甾醇類化合物。目前僅報(bào)道了十四種環(huán)烯醚萜類化合物。其中黃花敗醬中分離得到的有十一種，有馬錢子苷、jatamaninJ、isopatriscabrosid[12]、scabrosideJ[13]、jatamaninA[8]、patrinoside苷元[14]等；據(jù)研究者再研究發(fā)現(xiàn)，白花敗醬植物中還存在這馬錢子苷、莫諾苷（morronisida）[12]等成分。揮發(fā)油類化合物田智勇、曹繼華等[16]報(bào)道了黃花敗醬的根莖中含有的揮發(fā)油成分如下：α-萜品醇、δ-橄香烯、馬兜鈴烯、杜松烯、β-橄欖烯、3,3,8,8-四甲基甲基酯、β-古蕓烯、亞油酸、三環(huán)[5,1,0,024]辛烷-5-COOH，十六酸等；同時(shí)，他們采用的分析技術(shù)是GC-MC，最終從白花敗醬中分離得到揮發(fā)油類化合物，如亞油酸[16]。黃酮類化物合黃酮類化合物主要存在于白花敗醬中，在黃花敗醬中報(bào)道的僅僅只有蘆丁和槲皮素二等分離。目前李娜、趙斌等[17]、彭金詠、范國榮等[18]共分離和鑒定出23種黃酮類成分，主要為黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮類[17，18]。其他除了以上成分外，還發(fā)現(xiàn)有人從敗醬草中分離得到了以下成分。樸成玉從白花敗醬草中提取得到阿魏酸和熊果酸等[19]；FursaNS等從黃花敗醬草中分離得到一些有機(jī)酸類化合物，包括油酸、棕櫚油酸等[20]。藥理作用敗醬草味道尖銳而強(qiáng)烈，古人稱之為“辛辣”；其藥性寒涼。藥物作用的歸屬胃、大腸和肝。有將體內(nèi)的瘀血排出，止疼，清熱解毒。藥物作用的歸屬于肺、腸子等處的疾病，以及腫痛、產(chǎn)后瘀痛等。當(dāng)下相關(guān)藥理學(xué)研究顯示，由于其化學(xué)組成的不同，它的藥理活性多樣，包括抗氧化自由基，使情緒穩(wěn)定或平靜，抗腫瘤，肝臟保護(hù)和抗菌等等?？寡趸瘡哪壳暗难芯靠芍?，白花敗醬草中，所得到的乙醇提取物可以達(dá)到減輕機(jī)體自由基損傷，從而達(dá)到抗氧化作用。何光華、曾靖等[21]還通過連續(xù)給昆明種小鼠不同濃度的白花敗醬草的乙醇提取物（2.0、10.0、20.0mg/kg；生理鹽水為空白對(duì)照）10d，次日處死后測(cè)量心腦肝等組織中的SOD活性以及MDA含量，發(fā)現(xiàn)濃度為10.0、20.0mg/kg時(shí)可以顯著降低心腦肝等內(nèi)MDA含量，并顯著升高心腦肝等組織中SOD的活性。目前而言，沒有查找到關(guān)于黃花敗醬草抗氧化的研究，推測(cè)可能與其含的黃酮類成分少有關(guān)?？鼓[瘤二種敗醬草均可以具有抗腫瘤的作用。白花敗醬可抑制宮頸癌腫瘤的生長(zhǎng)，對(duì)于小鼠得了宮頸癌的，在用白花敗醬草治療中，楊曉蕾、李青旺等[22]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，白花敗醬草與腫瘤生長(zhǎng)的作用及相關(guān)原理為，白花敗醬草可有效減少宮頸癌的重量，顯著提高腫瘤細(xì)胞在G0/G1期的凋亡速度，并在G2期阻止腫瘤細(xì)胞核抗原的增殖。延長(zhǎng)了U14腫瘤模型小鼠的生命延長(zhǎng)率。有人推測(cè)白花敗醬草，可能與降低或壓抑G0/G1時(shí)期發(fā)生癌變的細(xì)胞的凋亡速度；誘惑、引導(dǎo)細(xì)胞的走向死亡，同時(shí)抑制PNCA，乳酸脫氫酶以及發(fā)生突變而來的Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。對(duì)患有荷艾腹水癌的小鼠使用不通過的劑量的黃花敗醬總皂苷，可以對(duì)小鼠存在生命跡象的時(shí)間有著不同程度影響，它可以不同程度的增多她們的存活時(shí)間，這也顯示出黃花敗醬總皂苷，在一定條件下可以抗腫瘤。此外，趙琳等[23]在研究薏苡附子敗醬散中敗醬總黃酮，經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)操作提取純化后，在體外可以實(shí)現(xiàn)抗腫瘤，藥效對(duì)比中也指出敗醬草具有抗肝腫瘤的作用[23]?？咕鷱哪壳把芯靠芍?，黃花敗醬草和白花敗醬草均具有一定的抑菌活性。兩者均可以抑制黃色葡萄球菌；黃花敗醬還可降低綠膿桿菌、炭疽桿菌等的活性；白花敗醬草可降低鏈球菌的活性等[19]。二種敗醬草還可以治療呼吸道感染引起的感染性炎癥的治療，例如咽炎。用于消化道感染引起的感染性炎癥的治療，如胃炎。用于婦科炎癥的治療，主要包括宮頸糜爛、慢性盆腔炎等[24]。保肝利膽造成肝損傷的原因之一是肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，李延芳、樓風(fēng)昌等[25]在研究敗醬屬植物概況中報(bào)道了白花敗醬對(duì)大鼠離體肝臟的脂質(zhì)過氧化具有抑制作用。其內(nèi)還含有大量必須脂肪酸亞油酸，可以通膽固醇酯結(jié)合從而使得膽固醇酯更容易排出體外，從而達(dá)到保肝的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，黃花敗醬也具有保肝利膽的作用。黃花敗醬中所含的皂苷類成分可以增強(qiáng)血清轉(zhuǎn)氨酶的活性[33]，其含有的成分之一齊墩果酸[12]目前被認(rèn)為是用于抵抗肝臟發(fā)炎的效果較好。同時(shí)，黃花敗醬可以促進(jìn)膽囊分泌膽汁[34]、是的肝臟功能得到改善、消炎等。其他作用敗醬草具有增強(qiáng)免疫的作用，敗醬草可以提高脂多糖刺激下KC分泌前列腺素的量，推測(cè)，敗醬草可能是通過促進(jìn)KC分泌前列腺素來抑制KC活性[26，35]。朱加進(jìn)等[27]通過實(shí)驗(yàn)小腸碳墨推進(jìn)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了黃花敗醬草可以調(diào)節(jié)胃腸功能、保護(hù)粘膜、治療腸炎。同時(shí)，黃花敗醬草和白花敗醬草中含有的苦菜多糖和苦菜果膠[27]，可以增加小鼠小腸的蠕動(dòng)性，促進(jìn)蠕動(dòng)，并能夠顯著的降低小鼠腸蠕動(dòng)的次數(shù)和時(shí)間[27]。增加排便開始的時(shí)間[27]。臨床應(yīng)用在歷代醫(yī)籍中，也可常見敗醬草的多種配伍。李時(shí)珍認(rèn)為敗醬草能“治氣血心腹痛、破癥瘕、催生落胞，赤白帶下”[28]。因此，敗醬草可用于女性生殖系統(tǒng)感染引起的感染性炎癥的治療[28]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，將敗醬草食用以治療婦科炎癥，可以減少患者對(duì)抗生素的耐藥性。另外鼻竇炎多是常見致病菌化膿性球菌引起，大腸經(jīng)與肺經(jīng)相表里，駱洪道[29]在給一位婦女治療盆腔炎時(shí)意外治愈了這名患者的鼻竇炎，由此啟發(fā)，蒼耳子散加重?cái)♂u草用量可以治療鼻竇炎。敗醬草具有促進(jìn)微循環(huán)和抗病毒的功能，所以用敗醬草配伍木賊、香附，加水煎煮，每日用棉簽蘸洗數(shù)次，可用于治療扁平疣[30]。因其清熱排毒、消除癰腫，化膿的功效，并且可以入肝經(jīng)、大腸經(jīng)以及胃經(jīng)，因此可用于消化系統(tǒng)疾病，例如慢性胃炎、腹部膿腫、慢性闌尾炎、腸癰、下痢、潰瘍性結(jié)腸炎等。質(zhì)量評(píng)價(jià)通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前關(guān)于敗醬草藥材以及制劑的質(zhì)量控制，主要通過測(cè)定總皂苷的含量。常用的方法是薄層色譜鑒別、紫外分光光度法，還可以用來研究其指紋圖譜。劉海濤[31]以有機(jī)酸總含量為考察指標(biāo)之一，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同地方的藥材質(zhì)量參差不齊，以有機(jī)酸總含量不低于0.2%為藥材優(yōu)劣的界限，質(zhì)量較好的藥材集中分布在四川、湖南；質(zhì)量較差的藥材分布在這兩地也有分布。這一現(xiàn)象也說明敗醬草質(zhì)量的好壞一定程度上可能受產(chǎn)地的影響不大。劉海濤通過將多成分含量測(cè)定和指紋圖譜相結(jié)合[31]，發(fā)現(xiàn)黃花敗醬草和白花敗醬草在定性鑒別及定量鑒別研究上并無明顯區(qū)別，而二者在指紋圖譜研究上，除了響應(yīng)值有所差異外，在整體色譜峰信息上沒有岷縣區(qū)別性成分。該研究所建立的指紋圖譜方法可為正確有效應(yīng)用敗醬草提供方法參考。王利麗等[32]以敗醬草水煎液提取得到的浸膏進(jìn)行定性、定量分析和總皂苷含量測(cè)定，結(jié)果表明，敗醬草的水溶性浸出物的含量不少于12.06%；醇溶性浸出物的含量不少于3.02%；總皂苷含量以齊墩果酸計(jì)算不少于2.29%。結(jié)論與展望近年來，敗醬草被越來越多的學(xué)者所研究，許多藥理作用、臨床應(yīng)用等都得到進(jìn)一步的闡述。但是，不管是黃花敗醬，還是白花敗醬，在作用機(jī)制和單體化合物功效等方面仍然缺乏研究，所以將來有必要在這些方面進(jìn)一步研究，為在臨床上進(jìn)一步區(qū)別使用黃花敗醬和白花敗醬提供依據(jù)，為敗醬的各類制劑開發(fā)研究作參考。

正文本課題利用UPLC-QqQ-MS技術(shù)對(duì)木犀草素進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)其方法學(xué)是否合理。木犀草素是從敗醬草中分離得到的黃酮類化合物，藥理活性強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)通過大鼠口服灌胃木犀草素的方法，研究木犀草素的藥代動(dòng)力學(xué)過程，以此求出所需數(shù)據(jù)，進(jìn)一步闡述木犀草素，在大鼠體內(nèi)的變化特點(diǎn)。本課題可為敗醬草的深入研究提供有價(jià)值的參考。實(shí)驗(yàn)材料藥材與試劑質(zhì)譜級(jí)甲醇、乙腈(德國MerckKGaA公司)；質(zhì)譜級(jí)甲酸(美國Thermo公司，批號(hào)：141831A)；純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；木犀草素(批號(hào)：17120702)購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司磺胺甲惡唑(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：wkq19031808)；敗醬飲片(批號(hào)：20140501，亳州市中亳中藥飲片廠，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授鑒定為白花敗醬Patriniavillosa(Thunb.)Juss.的干燥全草)。實(shí)驗(yàn)儀器Agilent1290型快速高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；Agilent6495BQqQ-MS質(zhì)譜(美國安捷倫科技有限公司)；低溫冷凍離心儀(PikoThermol公司)；SartoriusCP225D電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；CV200吉艾姆真空離心濃縮儀(北京吉艾姆科技有限公司)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性大鼠，體重200±20g，購買自遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司，許可證號(hào)：2019YS(DW)-033-01。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究部分嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物保護(hù)指導(dǎo)原則進(jìn)行，并已征得遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意，所有大鼠均自由飲水，適應(yīng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果灌胃藥液的制備：敗醬草總黃酮提取液：稱取敗醬藥材適量，于15倍量，60%乙醇回流提取3次，合并提取液，揮干溶劑，加純化水稀釋至濃度為0.1g(生藥量)/mL溶液。敗醬草總黃酮純化物制備：量取100mL敗醬提取液,采用HPD-300樹脂對(duì)提取液進(jìn)行純化，收集洗脫液，濃縮至10mL，置于-80℃冰箱內(nèi)冷凍24h，取出迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的凍干儀中，凍干24h，取出凍干粉。稱取適量制備的敗醬總黃酮純化物，蒸餾水溶解，稀釋至濃度為40mg/mL，搖勻，備用。標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)溶液制備：精密稱取木犀草素對(duì)照品0.2mg置于10mL容量瓶?jī)?nèi)，甲醇溶解定容至刻度，搖勻，得20μg/mL的對(duì)照品溶液，采用倍數(shù)稀釋法，依次得到6個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液，分別為木犀草素(400、100、40、16、8、4ng/mL)的一系列溶液，于-4℃冰箱避光保存。精密稱取磺胺甲惡唑0.2mg，置于10mL容量瓶?jī)?nèi)，質(zhì)譜甲醇溶解定容至刻度，搖勻，得20μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。再于其中精密吸取1mL內(nèi)標(biāo)溶液置于100mL容量瓶?jī)?nèi)，甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，得0.2μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，置于-4℃保存。血漿采集：空白血漿大鼠適應(yīng)一周后，不給藥，實(shí)驗(yàn)期間大鼠均可自由飲水，禁食12h后眼眶靜脈叢取血，1%肝素抗凝，血漿靜置40min，3500r/min離心5min，吸取上清置于-80℃保存。含藥血漿大鼠適應(yīng)一周后，于給藥前12h禁食，實(shí)驗(yàn)期間大鼠均可自由飲水。灌胃總黃酮純化物溶液2mL，于給藥0、0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12，24h后眼眶靜脈叢取血，1%肝素抗凝，血漿靜置40min，3500r/min離心5min，吸取上清置于-80℃保存。血漿預(yù)處理方法：精密吸取100μL大鼠血漿于1.5mL的離心管內(nèi)，加入20μL內(nèi)標(biāo)溶液，加入500μL甲醇，渦旋1min，超聲2min，置于-20℃冰箱10min，-4℃條件下12000r/min離心15min。取500μL上層清液于25℃條件下真空干燥，加25μL甲醇復(fù)溶，渦旋1min，超聲2min，-4℃12000r/min離心10min，取2μL上清液進(jìn)樣檢測(cè)。質(zhì)控溶液的制備：取出冷凍于-80℃冰箱內(nèi)的空白血漿，置于恒溫水浴鍋中迅速融化，精密吸取100μL，分別加入高、中、低的對(duì)照品溶液和20μL內(nèi)標(biāo)溶液，按照本節(jié)“血漿預(yù)處理方法”項(xiàng)下方法，制備成三組不同濃度的質(zhì)控樣品。木犀草素血漿濃度為320，80，20ng/mL。分析方法的建立色譜條件色譜柱：Agilentporoshell120SB-C18色譜柱(100mm×4.6mm，2.7μm)，流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A)，甲醇(B)，梯度洗脫程序見表1；流速：0.4mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2μL。表1洗脫梯度T(Min)A(%)B(%)0955288125851577723107426126535156139200100質(zhì)譜條件電噴霧離子源(DualAJSESI)，毛細(xì)管電壓(Vcap)為3500V，干燥氣體流速(DryingGasFlow)為11L/min，干燥氣體溫度(DryingGasTemp)為150℃，霧化器壓力(Neulizerpressure)為25psig，鞘氣溫度(SheathGasTemp)為350℃，鞘氣流速(SheathGasFlow)為12L/min。所有化合物均在MRM模式下分析，母離子信息(m/z)、產(chǎn)物離子(m/z)、和碰撞能信息如表2所示。表2化合物裂解信息化合物母離子(m/z)碎片離子(m/z)碎片離子(m/z)碎裂電壓(eV)磺胺甲惡唑25215615612木犀草素28513313335方法學(xué)考察專屬性考察在上述實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)大鼠空白血漿總離子流圖，血漿樣品中加入混合對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的總離子流圖，含藥血漿總離子流圖進(jìn)行比較，芹菜素，磺胺甲惡唑的保留時(shí)間分別為1.523min、、9.123min。峰之間分離度較好，可避免內(nèi)源性物質(zhì)的影響。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制表3標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量限化合物(Compounds)線性方程(Regressionequation)r線性范圍(Linearityrange)ng/mL定量限(LOQ)ng/mL木犀草素Y=0.0754X+0.24350.99924-4002提取回收率的考察精密吸取空白血漿100μL，按照本節(jié)“血漿預(yù)處理方法”項(xiàng)下方法進(jìn)行預(yù)處理，得到低、中、高不同濃度的樣品。以提取后的樣品碎片離子峰面積與含量相同的未經(jīng)提取的溶液碎片離子峰面積進(jìn)行對(duì)比，對(duì)樣品提取回收率進(jìn)行考察，結(jié)果見表?；|(zhì)效應(yīng)精密吸取空白血漿100μL，按照本節(jié)“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行預(yù)處理，得到低、中、高不同濃度的樣品。各濃度樣品進(jìn)樣6次，記錄碎片離子峰面積。另取3組同等濃度的混合對(duì)照品溶液，25℃下真空干燥，殘留物以甲醇復(fù)溶，渦旋1min，超聲2min，置于-20℃冰箱10min，-4℃條件下12000r/min離心15min。取500μL上層清液于25℃條件下真空干燥，加25μL甲醇復(fù)溶，渦旋1min，超聲2min，-4℃12000r/min離心10min，取2μL上清液進(jìn)樣檢測(cè)，記錄檢測(cè)的碎片離子峰面積。對(duì)提取后的離子峰面積與未提取離子峰面積進(jìn)行對(duì)比分析，考察血漿樣品的基質(zhì)效應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果可知，木犀草素的基質(zhì)效應(yīng)在91.21-94.13%之間，表面不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表4。表4大鼠血漿樣品中8種成分提取回收率考察(n=6)化合物提取回收率(%)基質(zhì)效應(yīng)(%)abcabc木犀草素84.24±1.61102.51±2.2995.92±1.5391.21±2.4292.82±0.8394.13±1.76注：a-低濃度；b-中濃度；c-高濃度；精密度與準(zhǔn)確度考察精密吸取空白血漿100μL，按照本節(jié)“血漿預(yù)處理方法”項(xiàng)下方法進(jìn)行預(yù)處理，得到低、中、高不同濃度的樣品。日內(nèi)精密度，一天內(nèi)對(duì)3個(gè)不同濃度的血漿樣品分別進(jìn)樣6次，記錄碎片離子峰面積。日間精密度，各濃度血漿樣品的每天進(jìn)樣2次，連續(xù)3天，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行，采用當(dāng)天所得標(biāo)曲進(jìn)行計(jì)算。本法測(cè)得的精密度RSD%與精確度RE%結(jié)果如表5。本方法測(cè)得的日內(nèi)精密度和日間精密度RSD≤13.2%，RE在-0.5~8.7%之間。結(jié)果表明此種方法優(yōu)點(diǎn)在于具有良好的重復(fù)性以及準(zhǔn)確性，符合生物分析方法指導(dǎo)原則的要求。表5精密度與準(zhǔn)確度考察(n=6，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示)化合物濃度ng/mL日內(nèi)精密度日間精密度均值ng/mLRSD/%RE%均值ng/mLRSD/%RE%木犀草素2020.34±1.959.51.721.74±2.8813.28.78082.36±86.68±320318.47±4.671.4-0.5325.98±1.920.61.9穩(wěn)定性考察精密吸取空白血漿100μL，按照本節(jié)“血漿預(yù)處理方法”項(xiàng)下方法進(jìn)行預(yù)處理，得到低、中、高不同濃度的血漿樣品?？疾齑袒彼氐牡椭懈呷N濃度質(zhì)控樣品在不同條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在室溫放置12h(短期)后RSD值在3.4~6.3%之間，4℃冷藏放置24h(中期)后RSD值在3.5~7.8%之間，在-80℃冰箱凍存20d(長(zhǎng)期)后RSD值在2.5-7.9%之間，表明血漿樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表6-8。表6血漿樣品短期穩(wěn)定性考察(n=6，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示)化合物濃度ng/mL均值ng/mLRSD/%RE%木犀草素2021.20±0.723.46.08082.35±320350.32±17.805.19.5表7血漿樣品中期穩(wěn)定性考察(n=6，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示)化合物濃度ng/mL均值ng/mLRSD/%RE%木犀草素2022.02±1.717.810.18086.15±320308.73±10.733.5-3.5表8血漿樣品長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察(n=6，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示)化合物濃度ng/mL均值ng/mLRSD/%RE%木犀草素2021.57±1.717.97.98084.01±320317.43±9.252.9-0.8藥代動(dòng)力學(xué)分析通過藥代動(dòng)力學(xué)軟件(DAS2.0)，分別輸入木犀草素的不同給藥時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度及時(shí)間的數(shù)據(jù)信息，根據(jù)AIC信息準(zhǔn)則對(duì)房室模型與權(quán)重系數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1，表9。圖1大鼠口服敗醬草總黃酮純化物后木犀草素的藥時(shí)曲線表9大鼠口服敗醬草總黃酮后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示)木犀草素權(quán)重系數(shù)1/c2房室模型二室模型Cmax(ng/L)253.34±51.23Tmax(h)3.51±1.47t1/2α(h)2.29±0.08t1/2β(h)4.48±3.25AUC0~T(ng·h·mL-1)281.21±42.57AUC0~∞(ng·h·mL-1)312.50±61.60注：Cmax-藥峰濃度；Tmax-藥峰時(shí)間；T1/2α-半衰期；T1/2β-消除半衰期；AUC-藥時(shí)曲線下面積；MRT-平均駐留時(shí)間；

分析討論1. 溶劑的選擇本實(shí)驗(yàn)在對(duì)大鼠進(jìn)行口服給藥過程中，化合物的溶解度在體內(nèi)對(duì)血藥濃度的變化起到一定作用，因此應(yīng)該選擇合適的溶劑對(duì)化合物進(jìn)行超聲溶解。因?yàn)樘崛∪軇┑倪x擇上應(yīng)該注意其安全有效的特征，并且血漿處理過程中沉淀蛋白選用甲醇效果更好，同時(shí)為了減少實(shí)驗(yàn)中溶劑帶來的影響，所以本實(shí)驗(yàn)選用甲醇作為溶劑。2. 內(nèi)標(biāo)物的選擇由于在每個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟的操作過程中，血漿樣品自身質(zhì)變以及人為操作等均會(huì)對(duì)血漿樣品產(chǎn)生不必要的損失。因此，用內(nèi)標(biāo)物標(biāo)記法，從而保證結(jié)果的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。內(nèi)標(biāo)物的選擇上，充分滿足以下幾個(gè)基本條件：內(nèi)標(biāo)物不與被測(cè)樣品反應(yīng)且具有良好的分離度、內(nèi)標(biāo)物可以在溶液中溶解、兩者的結(jié)構(gòu)相似且保留時(shí)間適宜。所以，本實(shí)驗(yàn)過程中，我們選用葛根素、柚皮素以及磺胺甲惡唑等作為內(nèi)標(biāo)物，考慮到血漿中雜質(zhì)、出峰的位置等因素，最終確定磺胺甲惡唑適合做內(nèi)標(biāo)物，因此選擇磺胺甲惡唑作為本實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)標(biāo)物。3. 血漿樣品的預(yù)處理方法血漿樣品的預(yù)處理在樣品分析測(cè)定中是十分重要的，如果生物樣品處理不當(dāng)，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器造成不可逆的污染和破壞，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成相對(duì)較大的誤差。因此關(guān)于生物樣品的預(yù)處理有其常用的幾個(gè)方法，包括沉淀蛋白法、液液萃取法及液固萃取法等。本研究采用沉淀蛋白法從血漿中提取木犀草素，可以有效地沉淀蛋白，使有效成分被完全獲得，具有可觀的提取回收率和良好的穩(wěn)定性，且該方法的實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)迅速，使用的溶劑也經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。在提取溶劑的選擇方面應(yīng)該注意其安全有效的特性，尤其是對(duì)樣品和內(nèi)標(biāo)物應(yīng)該有較高的提取回收率。本實(shí)驗(yàn)選取甲醇作為提取溶劑，甲醇對(duì)化合物木犀草素有較高的提取回收率，同時(shí)對(duì)蛋白具有沉淀作用。選用甲醇作為溶劑還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其在實(shí)驗(yàn)過程中穩(wěn)定性好。4. 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的研究通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木犀草素經(jīng)過口服灌胃給藥后，根據(jù)AIC準(zhǔn)則選擇權(quán)重系數(shù)為1/C2，藥代動(dòng)力學(xué)行為符合二室開放模型。木犀草素在口服給藥3.51h后達(dá)到最大血藥濃度為253.34ng/L。結(jié)合藥動(dòng)學(xué)參數(shù)和藥時(shí)曲線圖發(fā)現(xiàn)，給藥后木犀草素的分布半衰期t1/2α為2.29±0.08h，而其消除半衰期t1/2β為4.48±3.25h表明木犀草素在大鼠體內(nèi)分布的速度緩慢，消除的速度較快，在體內(nèi)的平均滯留時(shí)間較短，可知木犀草素在生物體內(nèi)的生物利用度是比較低的。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明木犀草素的生物利用度較低。

結(jié)論1．本實(shí)驗(yàn)選用利用UPLC-QqQ-MS法對(duì)敗醬草中的木犀草素在大鼠血漿中的藥代動(dòng)力學(xué)研究，該方法明確木犀草素在體內(nèi)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的濃度變化，并對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了考察驗(yàn)證。生物樣品在分析過程中有一定的標(biāo)準(zhǔn)要求，經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證可以得知，UPLC-QqQ-MS法具有較強(qiáng)的專屬性和靈敏性，同時(shí)具有良好的分離度，在考慮其提取回收率額穩(wěn)定性方面，其所得結(jié)果均在有效范圍內(nèi)。2．為了檢測(cè)敗醬草中木犀草素通過口服灌胃給藥后在大鼠血漿中的濃度，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-QqQ-MS法進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)所得結(jié)果分析其藥動(dòng)學(xué)特征。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，UPLC-QqQ-MS法相比于其他方法，儀器操作簡(jiǎn)單，設(shè)備先進(jìn)具有良好的靈敏度和分離度，在流動(dòng)相選擇方面廣泛，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)木犀草素和內(nèi)標(biāo)物的特性，因此選擇甲醇進(jìn)行分析。UPLC-QqQ-MS法的成功應(yīng)用，可以為木犀草素和敗醬草中其他化學(xué)成分的生物分析奠定重要的基礎(chǔ)，提供強(qiáng)有力的參考價(jià)值。

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