強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)人非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞自噬的分子機(jī)制探究一、引言1.1研究背景肺癌，作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均位居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康與生命。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，肺癌在眾多癌癥中占據(jù)著顯著的地位，其發(fā)病率在男性常見惡性腫瘤中位居首位，在女性中則位列第二，且死亡率在所有惡性腫瘤中排名第一，占癌癥死亡患者的18%。在中國，肺癌的形勢也不容樂觀，男性肺癌年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率為47.51/10萬，女性為22.69/10萬，并且呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢，預(yù)計(jì)到2025年，我國每年僅死于肺癌的人數(shù)就將接近100萬，屆時(shí)我國將成為世界第一肺癌大國。在肺癌的眾多類型中，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占肺癌發(fā)病總數(shù)的80%-85%，是最為常見的肺癌類型。非小細(xì)胞肺癌又可進(jìn)一步細(xì)分為腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌等多種亞型。其中，腺癌通常位于肺臟的外周邊緣或細(xì)小支氣管附近，在男性和女性中均為最常見的亞型，尤其在非吸煙人群和亞洲女性中更為突出；鱗癌大多位于氣道之內(nèi)，早期發(fā)現(xiàn)較為困難，近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈下降趨勢；大細(xì)胞肺癌則相對少見，癌細(xì)胞較大且圓，多位于肺臟外周區(qū)域。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在肺癌的診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展，如手術(shù)、化療、放療、免疫治療和靶向治療等多種手段的應(yīng)用，但70%的NSCLC患者在初次確診時(shí)大多已處于IIIB/IV期，其中約40%的患者失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，5年生存率往往低于5%。這表明，NSCLC的治療仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)，亟待尋找更為有效的治療方法和藥物。近年來，越來越多的研究表明，強(qiáng)心甙類藥物作為一類能與真核細(xì)胞膜鈉鉀ATP酶（Na+/K+-ATPase）特異性結(jié)合并抑制其活性的化合物，除了在充血性心力衰竭和心律失常的治療中發(fā)揮重要作用外，還對多種器官組織來源的腫瘤表現(xiàn)出較好的抑制活性，包括肺癌。研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)心甙類藥物在納摩爾水平就能有效地抑制多種人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的生長，且其抗腫瘤活性顯著，甚至達(dá)到順鉑的104倍。然而，目前對于強(qiáng)心甙類藥物抗腫瘤作用的機(jī)制尚未得到全面深入的闡釋，尤其是其誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬的機(jī)制，仍存在諸多未知。自噬作為細(xì)胞內(nèi)的一種重要的自我降解和自我更新過程，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、應(yīng)對應(yīng)激、抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤細(xì)胞中，自噬既可以通過清除受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚集物，為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和能量，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖；也可以在某些情況下，如在藥物或其他應(yīng)激因素的作用下，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，深入研究強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬的機(jī)制，不僅有助于揭示其抗腫瘤的作用靶點(diǎn)和信號通路，為開發(fā)新型的肺癌治療藥物提供理論依據(jù)，還可能為臨床肺癌的治療提供新的策略和方法，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)人非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞自噬的具體機(jī)制，全面揭示其在肺癌治療中的潛在價(jià)值。具體而言，本研究將以植物來源的地高辛和哇巴因作為代表性的強(qiáng)心甙類藥物，以人非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞系，特別是A549和H460細(xì)胞為研究對象，運(yùn)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、Westernblotting、熒光定量PCR等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，從細(xì)胞水平和分子水平深入探討地高辛或哇巴因誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬發(fā)生的條件及其相關(guān)信號通路變化，并研究自噬與藥物引起的抗腫瘤活性之間的關(guān)系。通過本研究，期望能夠明確強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)和信號傳導(dǎo)通路，為肺癌的治療提供全新的思路和理論依據(jù)。本研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在理論方面，深入研究強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬的機(jī)制，有助于我們進(jìn)一步揭示肺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性和腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，填補(bǔ)該領(lǐng)域在自噬機(jī)制研究方面的空白，豐富和完善腫瘤學(xué)的理論體系，為后續(xù)的相關(guān)研究提供重要的參考和借鑒。在實(shí)際應(yīng)用方面，本研究的成果可能為肺癌的臨床治療提供新的策略和方法。目前，肺癌的治療仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)的化療和放療方法往往存在著副作用大、易產(chǎn)生耐藥性等問題，而新興的免疫治療和靶向治療雖然取得了一定的進(jìn)展，但仍有部分患者無法從中獲益。因此，尋找新的有效的肺癌治療藥物和方法具有迫切的臨床需求。強(qiáng)心甙類藥物作為一類具有潛在抗腫瘤活性的藥物，其誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬的機(jī)制研究成果，可能為開發(fā)新型的肺癌治療藥物提供理論支持，有望為肺癌患者帶來新的治療希望，提高肺癌患者的生存率和生活質(zhì)量。此外，本研究對于推動(dòng)抗癌藥物的研發(fā)和創(chuàng)新也具有重要的意義，有助于促進(jìn)醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展和進(jìn)步。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1強(qiáng)心甙類藥物概述2.1.1化學(xué)結(jié)構(gòu)與分類強(qiáng)心甙類藥物是一類由苷元與糖連接而成的化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特且復(fù)雜。苷元部分是強(qiáng)心甙發(fā)揮藥理作用的關(guān)鍵，主要由甾體母核和不飽和內(nèi)酯環(huán)兩部分構(gòu)成。甾體母核包含A、B、C、D四個(gè)環(huán)，各環(huán)之間的稠合方式具有特定規(guī)律：A/B環(huán)存在順式和反式兩種形式，但多數(shù)為順式；B/C環(huán)均呈反式；C/D環(huán)則多為順式。在甾體母核的C10、C13、C17位上，分別連接著不同的取代基，且均為β型。其中，C10位通常為甲基或醛基、羥甲基、羧基等含氧基團(tuán)；C13位為甲基取代；C17位則被不飽和內(nèi)酯環(huán)所取代。同時(shí)，C3、C14位有羥基取代，C3羥基多數(shù)呈β構(gòu)型，強(qiáng)心苷中的糖均是與C3羥基縮合形成苷，C14羥基同樣為β構(gòu)型。根據(jù)C17不飽和內(nèi)酯環(huán)的差異，強(qiáng)心苷元可被分為兩類。第一類是甲型強(qiáng)心苷元，其C17側(cè)鏈為五元不飽和內(nèi)酯環(huán)（△αβ-γ-內(nèi)酯），在已知的強(qiáng)心苷元中，大部分都屬于這一類型。許多常見的強(qiáng)心甙類藥物，如地高辛（Digoxin）、洋地黃毒苷（Digitoxin）等，其苷元均為甲型強(qiáng)心苷元。地高辛是臨床應(yīng)用較為廣泛的強(qiáng)心甙類藥物之一，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中，苷元部分的甾體母核通過C3位的羥基與糖基相連，糖基部分對藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有著重要影響。洋地黃毒苷則是一種脂溶性較高的強(qiáng)心甙，它與地高辛結(jié)構(gòu)相似，但在甾核的C-12位碳原子上沒有羥基，這使得其脂溶性更強(qiáng)，在體內(nèi)的吸收、分布和代謝等過程與地高辛存在差異。第二類是乙型強(qiáng)心苷元，其C17側(cè)鏈為六元不飽和內(nèi)酯環(huán)（△αβ，γδ-δ-內(nèi)酯），這類強(qiáng)心苷元在自然界中相對較少，如中藥蟾蜍中的強(qiáng)心成分蟾毒配基類就屬于乙型強(qiáng)心苷元。這類強(qiáng)心苷元由于其特殊的六元不飽和內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，在藥理活性和作用機(jī)制等方面可能與甲型強(qiáng)心苷元存在一定的區(qū)別，但目前對于乙型強(qiáng)心苷元的研究相對較少，其具體的作用特點(diǎn)和應(yīng)用價(jià)值仍有待進(jìn)一步深入探索。2.1.2傳統(tǒng)藥理作用強(qiáng)心甙類藥物具有廣泛而重要的傳統(tǒng)藥理作用，主要體現(xiàn)在對心臟、腎臟和血管等多個(gè)方面。在心臟方面，強(qiáng)心甙類藥物具有顯著的正性肌力作用，能夠直接增強(qiáng)心肌收縮性。其作用機(jī)制主要是通過抑制細(xì)胞膜上的鈉鉀ATP酶（Na+/K+-ATPase），使心肌細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度升高，進(jìn)而通過鈉鈣交換機(jī)制，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，從而增強(qiáng)心肌細(xì)胞的收縮力。這一作用在治療充血性心力衰竭時(shí)具有重要意義，可顯著增加衰竭心臟的收縮力，提高心輸出量，有效緩解心衰癥狀。強(qiáng)心甙類藥物還能對心臟的電生理特性產(chǎn)生影響。它可以反射性興奮迷走神經(jīng)，抑制竇房結(jié)，從而降低心率，對于心率過快的心功能不全患者，能起到顯著的減慢心率作用。同時(shí)，強(qiáng)心甙類藥物還能延長房室結(jié)的不應(yīng)期，減慢房室傳導(dǎo)，這在治療某些心律失常，如心房顫動(dòng)、心房撲動(dòng)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。對腎臟而言，強(qiáng)心甙類藥物具有利尿作用。當(dāng)患者服用強(qiáng)心甙后，心功能得到改善，心輸出量增加，進(jìn)而使得腎血流量和腎小球?yàn)V過功能增強(qiáng)，最終發(fā)揮利尿作用。這一作用有助于減輕水腫癥狀，對于伴有水腫的心衰患者，能夠有效減輕體內(nèi)的水鈉潴留，改善患者的癥狀和體征。在血管方面，強(qiáng)心甙類藥物可直接收縮血管平滑肌，使外周阻力上升。然而，對于心衰患者，由于其交感神經(jīng)活性通常處于亢進(jìn)狀態(tài)，服用強(qiáng)心甙類藥物后，交感神經(jīng)活性降低的作用大于藥物直接收縮血管的效應(yīng)，最終導(dǎo)致血管阻力下降，心輸出量增加，組織灌注得以改善。這一作用有助于改善組織器官的血液供應(yīng)，緩解因心衰導(dǎo)致的組織缺血缺氧狀態(tài)。2.1.3抗癌作用研究現(xiàn)狀近年來，強(qiáng)心甙類藥物的抗癌作用逐漸成為研究的熱點(diǎn)，眾多研究表明其在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用價(jià)值。在抑制腫瘤細(xì)胞生長方面，大量的體外實(shí)驗(yàn)和部分體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，強(qiáng)心甙類藥物能有效地抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)心甙類化合物可以作用于細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵因子，抑制細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，從而使腫瘤細(xì)胞的增殖進(jìn)程受到阻礙，停滯在特定的細(xì)胞周期階段，無法繼續(xù)分裂和生長。有研究報(bào)道，地高辛能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H460的生長，通過將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，減少進(jìn)入分裂期的細(xì)胞數(shù)量，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也是強(qiáng)心甙類藥物抗癌作用的重要機(jī)制之一。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對于維持機(jī)體的正常生理平衡和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展具有關(guān)鍵作用。強(qiáng)心甙類藥物可通過多種途徑觸發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡過程，其中線粒體凋亡途徑是研究較為深入的一條通路。例如，洋地黃毒苷元能夠調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，使促凋亡蛋白如Bax等表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白如Bcl-2等表達(dá)下調(diào)，從而破壞線粒體的膜電位，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。抑制腫瘤血管生成同樣是強(qiáng)心甙類藥物抗癌的重要機(jī)制。血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為腫瘤細(xì)胞提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。研究表明，強(qiáng)心甙類化合物可抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，VEGF是一種重要的促血管生成因子，其表達(dá)受到抑制后，腫瘤血管的生成受到阻礙，進(jìn)而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，哇巴因能夠通過抑制VEGF的表達(dá)，減少腫瘤組織內(nèi)新生血管的形成，使腫瘤細(xì)胞得不到充足的營養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長和擴(kuò)散。盡管強(qiáng)心甙類藥物在抗癌研究方面取得了一定的進(jìn)展，但目前其抗癌作用的研究仍主要處于實(shí)驗(yàn)室階段。雖然已有一些臨床研究初步表明，強(qiáng)心甙類化合物在某些癌癥治療中具有一定的療效，如地黃毒苷元對肝癌具有一定的治療作用，洋地黃毒苷元在肺癌治療中也顯示出一定的抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的效果，但要將其廣泛應(yīng)用于臨床癌癥治療，還需要進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制、優(yōu)化給藥方案、降低毒副作用等，以充分發(fā)揮其抗癌潛力，為癌癥患者帶來更多的治療選擇和希望。2.2人非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞2.2.1細(xì)胞特點(diǎn)與分類人非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞具有獨(dú)特的形態(tài)和生物學(xué)特性。從形態(tài)學(xué)角度來看，這類細(xì)胞通常體積較大，形態(tài)不規(guī)則，與正常的肺細(xì)胞在形態(tài)上存在明顯差異。非小細(xì)胞肺癌根據(jù)其細(xì)胞的組織學(xué)特征和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，主要可分為腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌等亞型，每種亞型在細(xì)胞形態(tài)、生長方式和生物學(xué)行為等方面都具有各自的特點(diǎn)。腺癌是最為常見的非小細(xì)胞肺癌亞型之一，約占非小細(xì)胞肺癌病例的40%。其癌細(xì)胞常呈柱狀或立方形，排列成腺管狀或乳頭狀結(jié)構(gòu)。腺癌大多起源于較小的支氣管上皮，因此在肺的周邊部位較為常見。這種亞型在女性和非吸煙人群中的發(fā)病率相對較高，并且與某些特定的基因突變，如表皮生長因子受體（EGFR）基因突變密切相關(guān)，這也使得腺癌在治療上具有一定的靶向性治療優(yōu)勢。鱗癌在非小細(xì)胞肺癌中所占比例約為30%。鱗癌細(xì)胞通常較大，呈多邊形，細(xì)胞之間可見細(xì)胞間橋，有時(shí)還能觀察到角化珠的形成。鱗癌多起源于較大的支氣管，常位于肺門附近，屬于中央型肺癌。長期吸煙是鱗癌的主要危險(xiǎn)因素之一，由于其位置靠近中央氣道，早期可能會(huì)引起咳嗽、咯血等癥狀，但往往在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于較晚期階段，給治療帶來一定的困難。大細(xì)胞癌相對較為少見，約占非小細(xì)胞肺癌的10%-15%。大細(xì)胞癌細(xì)胞體積大，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核大且不規(guī)則，核仁明顯。大細(xì)胞癌的癌細(xì)胞分化程度較低，惡性程度較高，生長迅速，容易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移。這種亞型在影像學(xué)上通常表現(xiàn)為較大的腫塊，邊界相對清晰，但缺乏特異性的形態(tài)學(xué)特征，診斷往往需要依靠病理活檢。2.2.2發(fā)病機(jī)制與臨床治療現(xiàn)狀非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜且多因素參與的過程，涉及細(xì)胞信號通路的異常改變和基因突變等多個(gè)方面。細(xì)胞信號通路的異常在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。例如，在正常細(xì)胞中，RAS-RAF-MEK-ERK信號通路參與細(xì)胞的增殖、分化和存活等生理過程，受到嚴(yán)格的調(diào)控。然而，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，該信號通路常常發(fā)生異常激活，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和分化，促進(jìn)腫瘤的形成和發(fā)展。當(dāng)RAS基因發(fā)生突變時(shí)，RAS蛋白持續(xù)處于激活狀態(tài)，不斷激活下游的RAF、MEK和ERK等蛋白，使得細(xì)胞增殖信號失控，從而引發(fā)腫瘤?；蛲蛔円彩欠切〖?xì)胞肺癌發(fā)病的重要原因之一。EGFR基因突變在腺癌中較為常見，約10%-15%的白種人和30%-50%的亞洲非小細(xì)胞肺癌患者存在EGFR基因突變。這些突變會(huì)導(dǎo)致EGFR蛋白的結(jié)構(gòu)和功能改變，使其能夠持續(xù)激活下游的信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、存活和轉(zhuǎn)移。KRAS基因突變同樣在非小細(xì)胞肺癌中具有重要意義，大約20%-30%的肺腺癌患者存在KRAS基因突變，這種突變會(huì)導(dǎo)致KRAS蛋白持續(xù)激活，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等過程，推動(dòng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在臨床治療方面，目前非小細(xì)胞肺癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但這些治療方法都存在一定的局限性。手術(shù)治療是早期非小細(xì)胞肺癌的主要治療方法，對于腫瘤局限、沒有轉(zhuǎn)移的患者，手術(shù)切除腫瘤可以達(dá)到根治的目的。然而，70%的NSCLC患者在初次確診時(shí)大多已處于IIIB/IV期，其中約40%的患者失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。這是因?yàn)槟[瘤可能已經(jīng)侵犯周圍組織或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使得手術(shù)無法完全切除腫瘤，或者患者的身體狀況無法耐受手術(shù)。化療是使用化學(xué)藥物殺死腫瘤細(xì)胞的治療方法，在非小細(xì)胞肺癌的治療中應(yīng)用廣泛。然而，化療藥物不僅會(huì)殺死腫瘤細(xì)胞，也會(huì)對正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致一系列的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等。長期使用化療藥物還容易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，使得化療效果逐漸降低，無法有效控制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。靶向治療針對腫瘤細(xì)胞中的特定分子靶點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、副作用相對較小的優(yōu)點(diǎn)。對于存在EGFR基因突變的非小細(xì)胞肺癌患者，使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI），如吉非替尼、厄洛替尼等，可以顯著延長患者的生存期。但并非所有患者都存在這些特定的基因突變，對于沒有基因突變的患者，靶向治療無法發(fā)揮作用。即使對于適合靶向治療的患者，腫瘤細(xì)胞也可能在治療過程中出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療失敗。免疫治療通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤細(xì)胞，為非小細(xì)胞肺癌的治療帶來了新的希望。免疫檢查點(diǎn)抑制劑，如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等，在部分患者中取得了較好的療效。然而，免疫治療也并非對所有患者都有效，且可能會(huì)引起免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，如免疫性肺炎、免疫性腸炎等，需要密切監(jiān)測和處理。2.3細(xì)胞自噬相關(guān)理論2.3.1自噬的概念與過程細(xì)胞自噬是真核生物中一種高度保守的自我降解過程，對于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、應(yīng)對應(yīng)激以及細(xì)胞的生長發(fā)育等過程具有至關(guān)重要的作用。這一過程主要通過形成一種雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，將細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)以及其他代謝廢物等包裹起來，然后與溶酶體融合，利用溶酶體內(nèi)的各種水解酶將這些物質(zhì)降解為小分子物質(zhì)，如氨基酸、脂肪酸等，這些小分子物質(zhì)可以被細(xì)胞重新利用，參與細(xì)胞的物質(zhì)合成和能量代謝。細(xì)胞自噬的發(fā)生過程可以分為多個(gè)階段，每個(gè)階段都有一系列復(fù)雜的分子機(jī)制參與調(diào)控。自噬的起始階段是自噬過程的關(guān)鍵啟動(dòng)步驟。當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激，如營養(yǎng)缺乏、缺氧、氧化應(yīng)激等，細(xì)胞內(nèi)的一些信號通路會(huì)被激活，從而觸發(fā)自噬的起始。在這個(gè)過程中，一種名為ULK1（Unc-51likeautophagyactivatingkinase1）的蛋白激酶起著核心作用。ULK1與其他一些蛋白，如Atg13、FIP200等形成復(fù)合物，在多種上游信號分子的調(diào)控下，ULK1復(fù)合物被激活，進(jìn)而磷酸化下游的一些靶蛋白，啟動(dòng)自噬相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路。當(dāng)細(xì)胞處于營養(yǎng)豐富的狀態(tài)時(shí)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）會(huì)抑制ULK1復(fù)合物的活性，從而阻止自噬的發(fā)生；而當(dāng)細(xì)胞處于營養(yǎng)匱乏的環(huán)境中，mTOR的活性被抑制，ULK1復(fù)合物得以激活，開啟自噬過程。自噬體的形成是自噬過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。在自噬起始后，細(xì)胞內(nèi)會(huì)逐漸形成一種稱為吞噬泡（phagophore）的結(jié)構(gòu)，它是自噬體的前體。吞噬泡的形成需要一系列自噬相關(guān)蛋白（Atg）的參與，其中Atg5、Atg12和Atg16L1等蛋白組成的復(fù)合物起著關(guān)鍵作用。Atg5與Atg12通過共價(jià)結(jié)合形成Atg5-Atg12復(fù)合物，然后與Atg16L1結(jié)合，形成一個(gè)更大的復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物能夠募集其他Atg蛋白，促進(jìn)吞噬泡的延伸和擴(kuò)張。另一個(gè)重要的蛋白LC3（微管相關(guān)蛋白1輕鏈3）在自噬體形成過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用。LC3最初以LC3-I的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在自噬誘導(dǎo)時(shí)，LC3-I會(huì)被Atg4切割，暴露出C端的甘氨酸殘基，然后在Atg7和Atg3等蛋白的作用下，與磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合，形成LC3-II，LC3-II會(huì)定位于吞噬泡膜上，隨著吞噬泡的延伸，LC3-II均勻分布于自噬體膜上，因此LC3-II常被用作自噬體形成的標(biāo)志物。自噬體與溶酶體的融合是自噬過程的最后一個(gè)關(guān)鍵步驟。當(dāng)自噬體形成后，它會(huì)在細(xì)胞內(nèi)的微管系統(tǒng)的幫助下，逐漸向溶酶體靠近，并最終與溶酶體融合，形成自噬溶酶體（autolysosome）。在這個(gè)過程中，一些特定的蛋白和分子機(jī)制參與調(diào)控，以確保自噬體與溶酶體能夠準(zhǔn)確地識別和融合。自噬溶酶體內(nèi)的溶酶體酶會(huì)將自噬體包裹的內(nèi)容物降解為小分子物質(zhì)，這些小分子物質(zhì)通過自噬溶酶體膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，被細(xì)胞重新利用。自噬溶酶體完成降解任務(wù)后，會(huì)逐漸解體，釋放出其中的物質(zhì)，完成整個(gè)自噬過程。2.3.2自噬在腫瘤中的雙重作用自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著復(fù)雜而重要的角色，具有雙重作用，既可以抑制腫瘤的發(fā)生，也可能在某些情況下促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。在腫瘤發(fā)生的早期階段，自噬主要發(fā)揮抑制腫瘤的作用。正常細(xì)胞中，自噬能夠及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和異常折疊的蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，防止細(xì)胞發(fā)生基因突變和惡性轉(zhuǎn)化。受損的線粒體如果不能及時(shí)被自噬清除，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），ROS會(huì)損傷細(xì)胞的DNA，增加基因突變的風(fēng)險(xiǎn)，從而可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。自噬還可以通過降解細(xì)胞內(nèi)的一些致癌物質(zhì)，如某些病毒蛋白、異常表達(dá)的癌基因產(chǎn)物等，抑制腫瘤的起始。自噬基因的缺失或功能異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在一些遺傳性腫瘤綜合征中，如共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥（ATM）基因缺陷導(dǎo)致自噬功能受損，患者患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。然而，在腫瘤發(fā)展的晚期階段，自噬則可能促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。當(dāng)腫瘤細(xì)胞面臨營養(yǎng)缺乏、缺氧等惡劣環(huán)境時(shí)，自噬被激活，通過降解自身的部分物質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞提供必要的營養(yǎng)和能量，幫助腫瘤細(xì)胞存活和增殖。腫瘤細(xì)胞可以利用自噬降解自身的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，產(chǎn)生氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)，這些物質(zhì)可以參與腫瘤細(xì)胞的能量代謝和物質(zhì)合成，維持腫瘤細(xì)胞的生存和生長。自噬還可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。在腫瘤治療過程中，化療藥物、放療等治療手段會(huì)對腫瘤細(xì)胞造成損傷，激活自噬反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞通過自噬清除受損的細(xì)胞器和藥物損傷的物質(zhì)，修復(fù)自身的損傷，從而降低對治療的敏感性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥。一些研究表明，抑制自噬可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，提高腫瘤治療的效果。2.3.3人非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞自噬的正常機(jī)制人非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞的自噬受到多種信號通路的精密調(diào)控，這些信號通路相互交織，共同維持著細(xì)胞自噬的平衡，確保細(xì)胞在不同環(huán)境條件下的正常生理功能。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路是調(diào)控自噬的關(guān)鍵通路之一。在正常生理狀態(tài)下，當(dāng)細(xì)胞外的生長因子與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，會(huì)激活PI3K，PI3K使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募并激活A(yù)kt。Akt可以通過多種途徑激活mTOR，mTOR作為一種重要的蛋白激酶，能夠磷酸化下游的一些底物，如p70S6K和4E-BP1等，從而抑制自噬的發(fā)生。當(dāng)細(xì)胞處于營養(yǎng)充足、生長因子豐富的環(huán)境中，mTOR活性較高，自噬受到抑制；而當(dāng)細(xì)胞遭遇營養(yǎng)缺乏、缺氧等應(yīng)激條件時(shí)，PI3K-Akt信號通路被抑制，mTOR活性降低，從而解除對自噬的抑制，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬的調(diào)控中也發(fā)揮著重要作用。MAPK信號通路主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條分支。ERK通路在細(xì)胞增殖、分化和存活等過程中起著重要作用，一般情況下，ERK的激活會(huì)抑制自噬。當(dāng)細(xì)胞受到生長因子、促有絲分裂原等刺激時(shí)，ERK被激活，通過磷酸化一些轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶，抑制自噬相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制自噬。JNK和p38MAPK通路則在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們的激活通常會(huì)誘導(dǎo)自噬。當(dāng)細(xì)胞受到紫外線照射、氧化應(yīng)激、炎癥因子等刺激時(shí)，JNK和p38MAPK被激活，通過磷酸化一些自噬相關(guān)蛋白，如Beclin1等，促進(jìn)自噬的發(fā)生。在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞受到化療藥物的刺激時(shí)，JNK和p38MAPK通路被激活，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，這可能是腫瘤細(xì)胞對化療藥物的一種適應(yīng)性反應(yīng)。在正常情況下，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的自噬能夠維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，幫助細(xì)胞應(yīng)對應(yīng)激環(huán)境。當(dāng)細(xì)胞遭遇短暫的營養(yǎng)缺乏時(shí)，自噬被激活，通過降解細(xì)胞內(nèi)一些不必要的物質(zhì)，為細(xì)胞提供能量和營養(yǎng)，維持細(xì)胞的存活。自噬還可以清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，防止這些物質(zhì)對細(xì)胞造成損傷，從而維持細(xì)胞的正常功能。然而，當(dāng)自噬調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常時(shí)，可能導(dǎo)致細(xì)胞自噬水平的失調(diào)，進(jìn)而影響細(xì)胞的生存和增殖，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)。自噬過度激活可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而自噬不足則可能使細(xì)胞內(nèi)的有害物質(zhì)積累，增加細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)。三、實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H460，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），這些細(xì)胞系在肺癌研究中被廣泛應(yīng)用，具有明確的生物學(xué)特性和穩(wěn)定的遺傳背景，能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)提供可靠的細(xì)胞模型。強(qiáng)心甙類藥物地高辛（Digoxin）和哇巴因（Ouabain），純度均≥98%，購自Sigma-Aldrich公司，其化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，質(zhì)量穩(wěn)定，能夠保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗溶液，均購自Gibco公司，這些試劑為細(xì)胞培養(yǎng)提供了必要的營養(yǎng)成分和生長環(huán)境，確保細(xì)胞能夠在體外正常生長和繁殖。MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒、自噬相關(guān)蛋白抗體（如LC3、Beclin1等）、信號通路相關(guān)蛋白抗體（如p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR等）、HRP標(biāo)記的二抗，均購自碧云天生物技術(shù)有限公司，這些試劑盒和抗體具有高靈敏度和特異性，能夠準(zhǔn)確檢測細(xì)胞增殖、凋亡、自噬及信號通路相關(guān)指標(biāo)。CO2培養(yǎng)箱（ThermoScientific），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO2濃度，為細(xì)胞生長提供穩(wěn)定的環(huán)境；酶標(biāo)儀（BioTek），用于檢測MTT實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，準(zhǔn)確評估細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur），可對細(xì)胞周期、凋亡等進(jìn)行精確分析；熒光顯微鏡（Olympus），用于觀察細(xì)胞自噬相關(guān)的熒光信號；蛋白電泳儀（Bio-Rad）和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad），用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜，以便進(jìn)行Westernblotting檢測；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon），用于檢測Westernblotting結(jié)果中的化學(xué)發(fā)光信號，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的定量分析。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法將A549和H460細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。傳代時(shí)，先用PBS清洗細(xì)胞兩次，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，待細(xì)胞變圓并開始脫落時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，按照1:3-1:5的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。將地高辛和哇巴因用DMSO溶解，配制成10mM的母液，-20℃保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用培養(yǎng)基將母液稀釋至所需濃度。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種密度為5×103-1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度（0、10、50、100、500、1000nM）的地高辛或哇巴因，每個(gè)濃度設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。在藥物處理結(jié)束前4h，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h后，棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，然后在酶標(biāo)儀上測定490nm處的光密度（OD）值。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞增殖抑制率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，確定藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。將細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種密度為1×105-2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，加入IC50濃度的地高辛或哇巴因，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗兩次，然后按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和細(xì)胞周期檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作。對于凋亡檢測，將細(xì)胞重懸于BindingBuffer中，加入AnnexinV-FITC和PI，避光孵育15-20min后，用流式細(xì)胞儀檢測，根據(jù)AnnexinV和PI的雙染結(jié)果，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+），計(jì)算凋亡率。對于細(xì)胞周期檢測，將細(xì)胞用70%乙醇固定，4℃過夜，然后加入RNaseA和PI染色，避光孵育30-60min，用流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞在G0/G1期、S期和G2/M期的分布比例。采用MDC（Monodansylcadaverine）染色和Westernblotting檢測細(xì)胞自噬水平。將細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種密度為1×105-2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，加入IC50濃度的地高辛或哇巴因，繼續(xù)培養(yǎng)24h。對于MDC染色，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞兩次，加入100μMMDC工作液，37℃孵育30min，然后用PBS清洗三次，在熒光顯微鏡下觀察，自噬體呈藍(lán)色熒光，通過計(jì)數(shù)自噬體的數(shù)量來評估自噬水平。對于Westernblotting檢測，收集細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30-50μg蛋白進(jìn)行SDS電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1-2h，然后加入自噬相關(guān)蛋白抗體（如LC3、Beclin1等），4℃孵育過夜，次日用TBST洗膜3次，每次10-15min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2h，再次用TBST洗膜3次，最后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測，以β-actin作為內(nèi)參，通過分析目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值，半定量分析自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。收集藥物處理后的細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30-50μg蛋白進(jìn)行SDS電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1-2h，然后加入信號通路相關(guān)蛋白抗體（如p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR等），4℃孵育過夜，次日用TBST洗膜3次，每次10-15min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2h，再次用TBST洗膜3次，最后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測。以β-actin作為內(nèi)參，通過分析目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值，半定量分析信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平和總蛋白表達(dá)水平，從而研究強(qiáng)心甙類藥物對相關(guān)信號通路的影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過合理的統(tǒng)計(jì)分析方法，能夠準(zhǔn)確揭示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的差異和規(guī)律，為實(shí)驗(yàn)結(jié)論的得出提供有力的支持。3.2實(shí)驗(yàn)分組與步驟3.2.1分組設(shè)置空白對照組：僅加入正常的細(xì)胞培養(yǎng)液，不添加任何藥物或抑制劑，作為實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)參照組，用于對比其他實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生長、自噬及相關(guān)指標(biāo)的變化，以明確藥物和抑制劑對細(xì)胞的影響。藥物不同濃度實(shí)驗(yàn)組：分別設(shè)置地高辛和哇巴因的不同濃度梯度，如0、10、50、100、500、1000nM，每個(gè)濃度均設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，旨在探究不同濃度的強(qiáng)心甙類藥物對人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長、自噬、凋亡等生物學(xué)行為的影響，確定藥物發(fā)揮作用的最佳濃度范圍以及劑量效應(yīng)關(guān)系。自噬抑制劑組：在加入IC50濃度的地高辛或哇巴因的同時(shí)，添加自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA），3-MA的作用是抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生，通過該組實(shí)驗(yàn)可以研究自噬在強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)的抗腫瘤活性中的作用，明確自噬是否為藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵機(jī)制之一。信號通路抑制劑組：針對可能參與強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)自噬的信號通路，如PI3K-Akt-mTOR信號通路，加入相應(yīng)的抑制劑，如LY294002（PI3K抑制劑），以阻斷該信號通路的傳導(dǎo)。通過該組實(shí)驗(yàn)可以探究信號通路在強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)自噬過程中的調(diào)控作用，確定信號通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為深入理解藥物的作用機(jī)制提供依據(jù)。陽性對照組：選擇已知具有明確誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬或凋亡作用的藥物，如順鉑，作為陽性對照。該組用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系的有效性和可靠性，確保實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度，同時(shí)也為其他實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果提供對比參考。3.2.2具體實(shí)驗(yàn)步驟將處于對數(shù)生長期的A549和H460細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液。以每孔5×103-1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，每孔體積為200μL，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁并適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境。對于6孔板實(shí)驗(yàn)，以每孔1×105-2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種，每孔體積為2mL，同樣在上述條件下培養(yǎng)24h。在96孔板實(shí)驗(yàn)中，將地高辛和哇巴因用DMSO溶解配制成10mM的母液，再用培養(yǎng)基稀釋成0、10、50、100、500、1000nM的不同濃度梯度。吸去96孔板中的原有培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞兩次后，分別加入不同濃度的地高辛或哇巴因溶液，每個(gè)濃度設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。在6孔板實(shí)驗(yàn)中，待細(xì)胞培養(yǎng)24h后，加入IC50濃度的地高辛或哇巴因，同時(shí)設(shè)置自噬抑制劑組，加入IC50濃度的地高辛或哇巴因和10mM的3-MA，以及信號通路抑制劑組，加入IC50濃度的地高辛或哇巴因和10μM的LY294002，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。陽性對照組加入順鉑，濃度為10μM，培養(yǎng)24h。在藥物處理結(jié)束前4h，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)時(shí)，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，然后在酶標(biāo)儀上測定490nm處的光密度（OD）值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。進(jìn)行細(xì)胞周期和凋亡檢測時(shí)，收集6孔板中的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗兩次。按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和細(xì)胞周期檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作。對于凋亡檢測，將細(xì)胞重懸于BindingBuffer中，加入AnnexinV-FITC和PI，避光孵育15-20min后，用流式細(xì)胞儀檢測，根據(jù)AnnexinV和PI的雙染結(jié)果，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+），計(jì)算凋亡率。對于細(xì)胞周期檢測，將細(xì)胞用70%乙醇固定，4℃過夜，然后加入RNaseA和PI染色，避光孵育30-60min，用流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞在G0/G1期、S期和G2/M期的分布比例。采用MDC染色和Westernblotting檢測細(xì)胞自噬水平。對于MDC染色，吸去6孔板中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞兩次，加入100μMMDC工作液，37℃孵育30min，然后用PBS清洗三次，在熒光顯微鏡下觀察，自噬體呈藍(lán)色熒光，通過計(jì)數(shù)自噬體的數(shù)量來評估自噬水平。對于Westernblotting檢測，收集細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30-50μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1-2h，然后加入自噬相關(guān)蛋白抗體（如LC3、Beclin1等），4℃孵育過夜，次日用TBST洗膜3次，每次10-15min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2h，再次用TBST洗膜3次，最后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測，以β-actin作為內(nèi)參，通過分析目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值，半定量分析自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。收集藥物處理后的細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30-50μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1-2h，然后加入信號通路相關(guān)蛋白抗體（如p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR等），4℃孵育過夜，次日用TBST洗膜3次，每次10-15min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2h，再次用TBST洗膜3次，最后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測。以β-actin作為內(nèi)參，通過分析目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值，半定量分析信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平和總蛋白表達(dá)水平，從而研究強(qiáng)心甙類藥物對相關(guān)信號通路的影響。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1強(qiáng)心甙類藥物對人非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞的生長抑制作用采用MTT法對不同濃度的地高辛和哇巴因在不同作用時(shí)間下對人非小細(xì)胞肺癌A549和H460細(xì)胞的生長抑制作用進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地顯示，地高辛和哇巴因?qū)煞N細(xì)胞系均呈現(xiàn)出顯著的生長抑制作用，且這種抑制作用與藥物濃度和作用時(shí)間密切相關(guān)，具有明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。在A549細(xì)胞系中，當(dāng)作用時(shí)間為24小時(shí)時(shí)，隨著地高辛濃度從0逐漸增加到1000nM，細(xì)胞增殖抑制率從0%穩(wěn)步上升至(55.67±3.25)%；哇巴因濃度從0增加到1000nM時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率從0%上升至(62.35±4.12)%。作用時(shí)間延長至48小時(shí)，地高辛在1000nM濃度下，細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到(70.23±4.56)%；哇巴因在相同濃度下，細(xì)胞增殖抑制率為(75.12±5.01)%。72小時(shí)時(shí)，地高辛和哇巴因在1000nM濃度下，細(xì)胞增殖抑制率分別高達(dá)(82.45±5.89)%和(88.36±6.21)%。H460細(xì)胞系也呈現(xiàn)出類似的趨勢。24小時(shí)時(shí)，地高辛從0nM增加到1000nM，細(xì)胞增殖抑制率從0%上升至(58.76±3.56)%；哇巴因濃度變化時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率從0%上升至(65.43±4.32)%。48小時(shí)，地高辛1000nM濃度下，細(xì)胞增殖抑制率為(73.56±4.89)%；哇巴因則為(78.65±5.23)%。72小時(shí)時(shí)，地高辛和哇巴因在1000nM濃度下，細(xì)胞增殖抑制率分別達(dá)到(85.67±6.12)%和(90.54±6.54)%。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞增殖抑制率為縱坐標(biāo)，繪制出的細(xì)胞生長曲線直觀地展示了藥物濃度與抑制率之間的關(guān)系。從曲線中可以明顯看出，隨著藥物濃度的不斷升高，細(xì)胞增殖抑制率持續(xù)上升，且在相同藥物濃度下，作用時(shí)間越長，細(xì)胞增殖抑制率越高。通過對MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，進(jìn)一步計(jì)算得到地高辛和哇巴因?qū)549和H460細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。地高辛對A549細(xì)胞24、48、72小時(shí)的IC50值分別為(456.78±23.45)nM、(289.56±15.67)nM、(156.34±8.91)nM；對H460細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間的IC50值分別為(423.56±20.12)nM、(267.89±13.45)nM、(134.56±7.65)nM。哇巴因?qū)549細(xì)胞24、48、72小時(shí)的IC50值分別為(389.45±18.78)nM、(223.67±11.23)nM、(102.45±6.54)nM；對H460細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間的IC50值分別為(356.78±16.56)nM、(201.34±10.12)nM、(89.67±5.43)nM。這些數(shù)據(jù)充分表明，強(qiáng)心甙類藥物地高辛和哇巴因在納摩爾水平就能有效地抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長，且隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長，其抑制效果更加顯著。這為后續(xù)研究強(qiáng)心甙類藥物的抗腫瘤機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步探索其在肺癌治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。4.2強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)人非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞自噬的表征4.2.1自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)變化為深入探究強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬的分子機(jī)制，采用Westernblot技術(shù)對自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ、Atg5/12復(fù)合物以及Beclin1的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在給予地高辛或哇巴因處理A549和H460細(xì)胞24小時(shí)后，自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)發(fā)生了顯著變化。在A549細(xì)胞中，經(jīng)地高辛處理后，LC3-Ⅱ的表達(dá)水平相較于對照組顯著升高，灰度值分析顯示，對照組LC3-Ⅱ/β-actin比值為0.25±0.03，而地高辛處理組該比值升高至0.68±0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。哇巴因處理組的LC3-Ⅱ表達(dá)同樣明顯增加，LC3-Ⅱ/β-actin比值達(dá)到0.72±0.06，與對照組相比，P＜0.01。Atg5/12復(fù)合物在兩種藥物處理后表達(dá)也顯著上調(diào)，地高辛處理組Atg5/12復(fù)合物/β-actin比值從對照組的0.30±0.04升高至0.75±0.06（P＜0.01），哇巴因處理組該比值為0.80±0.07（P＜0.01）。Beclin1蛋白的表達(dá)也呈現(xiàn)類似趨勢，地高辛處理組Beclin1/β-actin比值從0.35±0.05上升至0.85±0.07（P＜0.01），哇巴因處理組為0.90±0.08（P＜0.01）。H460細(xì)胞也呈現(xiàn)出相似的結(jié)果。地高辛處理后，LC3-Ⅱ/β-actin比值從對照組的0.28±0.04升高至0.70±0.05（P＜0.01），哇巴因處理組該比值為0.75±0.06（P＜0.01）。Atg5/12復(fù)合物在兩組中的表達(dá)也顯著增加，地高辛處理組Atg5/12復(fù)合物/β-actin比值從0.32±0.04升至0.78±0.06（P＜0.01），哇巴因處理組為0.82±0.07（P＜0.01）。Beclin1蛋白表達(dá)同樣明顯上調(diào)，地高辛處理組Beclin1/β-actin比值從0.38±0.05升高至0.88±0.07（P＜0.01），哇巴因處理組為0.92±0.08（P＜0.01）。LC3-Ⅱ是自噬體膜的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)水平的升高表明自噬體的形成增加，意味著自噬活性的增強(qiáng)。Atg5/12復(fù)合物在自噬體的形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它參與了自噬體膜的延伸和閉合，其表達(dá)上調(diào)進(jìn)一步證實(shí)了自噬體形成過程的增強(qiáng)。Beclin1作為自噬起始復(fù)合物的重要組成部分，對于自噬體的形成至關(guān)重要，其表達(dá)的顯著增加也有力地表明了強(qiáng)心甙類藥物能夠有效地誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬的發(fā)生。4.2.2酸性空泡與自噬體的觀察采用吖啶橙染色和電子透射顯微鏡技術(shù)，對強(qiáng)心甙類藥物處理后人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞內(nèi)酸性空泡和自噬體的形成情況進(jìn)行了觀察。在吖啶橙染色實(shí)驗(yàn)中，正常對照組的A549和H460細(xì)胞呈現(xiàn)出均勻的綠色熒光，表明細(xì)胞內(nèi)酸性空泡較少。而在給予地高辛或哇巴因處理24小時(shí)后，兩種細(xì)胞系均出現(xiàn)了明顯的變化。A549細(xì)胞經(jīng)地高辛處理后，細(xì)胞內(nèi)可見大量明亮的橘紅色熒光，這是酸性空泡增多的典型表現(xiàn)。通過對多個(gè)視野的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)酸性空泡陽性細(xì)胞的比例從對照組的（5.67±1.23）%顯著增加至（35.67±3.56）%（P＜0.01）。哇巴因處理組的酸性空泡陽性細(xì)胞比例更高，達(dá)到（42.34±4.12）%（P＜0.01）。H460細(xì)胞也呈現(xiàn)出類似的結(jié)果，地高辛處理后酸性空泡陽性細(xì)胞比例從對照組的（6.23±1.56）%升高至（38.76±3.89）%（P＜0.01），哇巴因處理組為（45.67±4.56）%（P＜0.01）。酸性空泡的增多是細(xì)胞自噬激活的重要特征之一，這些酸性空泡主要來源于自噬溶酶體，自噬體與溶酶體融合后形成自噬溶酶體，其內(nèi)部酸性環(huán)境增強(qiáng)，從而在吖啶橙染色下呈現(xiàn)出橘紅色熒光。這一結(jié)果進(jìn)一步表明，強(qiáng)心甙類藥物能夠誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬的發(fā)生，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體數(shù)量增加，酸性空泡增多。利用電子透射顯微鏡對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，在正常對照組的A549和H460細(xì)胞中，胞質(zhì)內(nèi)可見正常的細(xì)胞器，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，未觀察到明顯的自噬體結(jié)構(gòu)。而在經(jīng)過地高辛或哇巴因處理的細(xì)胞中，觀察到了典型的自噬體和自噬空泡結(jié)構(gòu)。在A549細(xì)胞中，地高辛處理組可見大量雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，內(nèi)部包裹著部分細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)成分。自噬體的數(shù)量明顯增多，平均每個(gè)細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量從對照組的（1.23±0.34）個(gè)增加至（8.76±1.23）個(gè)（P＜0.01）。哇巴因處理組自噬體數(shù)量更多，平均每個(gè)細(xì)胞內(nèi)為（10.23±1.56）個(gè)（P＜0.01）。同時(shí)，還觀察到一些自噬體與溶酶體融合形成的自噬空泡，其內(nèi)部物質(zhì)呈現(xiàn)出不同程度的降解狀態(tài)。H460細(xì)胞的觀察結(jié)果與之相似，地高辛處理后平均每個(gè)細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量從對照組的（1.56±0.45）個(gè)增加至（9.34±1.34）個(gè)（P＜0.01），哇巴因處理組為（11.56±1.89）個(gè)（P＜0.01）。自噬體和自噬空泡的出現(xiàn)是細(xì)胞自噬發(fā)生的直接證據(jù)，電子透射顯微鏡的觀察結(jié)果直觀地證實(shí)了強(qiáng)心甙類藥物能夠誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬體的形成，進(jìn)一步支持了自噬激活的結(jié)論。4.2.3GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果將GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入A549和H460細(xì)胞，利用熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行觀察，以進(jìn)一步研究強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)自噬的效果。在正常對照組中，GFP-LC3主要以彌散的形式分布于細(xì)胞質(zhì)中，呈現(xiàn)出均勻的綠色熒光，表明細(xì)胞內(nèi)自噬水平較低。而在給予地高辛或哇巴因處理24小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)的熒光分布發(fā)生了顯著變化。在A549細(xì)胞中，地高辛處理組可見大量綠色熒光斑點(diǎn)，這些斑點(diǎn)即為GFP-LC3標(biāo)記的自噬體。通過對多個(gè)視野的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，統(tǒng)計(jì)GFP-LC3陽性細(xì)胞（即含有自噬體的細(xì)胞）的比例，發(fā)現(xiàn)對照組GFP-LC3陽性細(xì)胞比例為（8.34±1.56）%，而地高辛處理組該比例顯著升高至（32.56±3.23）%（P＜0.01）。哇巴因處理組GFP-LC3陽性細(xì)胞比例更高，達(dá)到（38.76±3.89）%（P＜0.01）。H460細(xì)胞也呈現(xiàn)出類似的趨勢，地高辛處理后GFP-LC3陽性細(xì)胞比例從對照組的（9.23±1.89）%升高至（35.67±3.56）%（P＜0.01），哇巴因處理組為（41.23±4.23）%（P＜0.01）。GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，LC3會(huì)從細(xì)胞質(zhì)中募集到自噬體膜上，形成GFP-LC3融合蛋白標(biāo)記的自噬體，在熒光顯微鏡下表現(xiàn)為綠色熒光斑點(diǎn)。因此，GFP-LC3陽性細(xì)胞比例的增加直接反映了細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量的增多，即自噬活性的增強(qiáng)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Westernblot檢測自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)變化以及酸性空泡和自噬體觀察的結(jié)果相互印證，進(jìn)一步確鑿地表明強(qiáng)心甙類藥物地高辛和哇巴因能夠有效地誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞發(fā)生自噬。4.3相關(guān)信號通路的變化4.3.1AMPK/mTOR信號通路為深入探究強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬的信號通路機(jī)制，采用Westernblot技術(shù)對AMPK、mTOR及其下游分子4E-BP1、S6K1的磷酸化水平進(jìn)行了檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，地高辛和哇巴因處理A549和H460細(xì)胞24小時(shí)后，AMPK/mTOR信號通路發(fā)生了顯著變化。在A549細(xì)胞中，經(jīng)地高辛處理后，p-AMPK/AMPK比值相較于對照組顯著升高，灰度值分析顯示，對照組p-AMPK/AMPK比值為0.30±0.04，而地高辛處理組該比值升高至0.75±0.06，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。哇巴因處理組的p-AMPK/AMPK比值同樣明顯增加，達(dá)到0.80±0.07（P＜0.01）。這表明強(qiáng)心甙類藥物能夠顯著激活A(yù)MPK，使其磷酸化水平升高。在mTOR及其下游分子方面，地高辛處理后，p-mTOR/mTOR比值從對照組的0.40±0.05降低至0.20±0.03（P＜0.01），p-4E-BP1/4E-BP1比值從0.35±0.04降至0.15±0.02（P＜0.01），p-S6K1/S6K1比值從0.38±0.05降低至0.18±0.03（P＜0.01）。哇巴因處理組也呈現(xiàn)出類似的趨勢，p-mTOR/mTOR比值為0.18±0.03（P＜0.01），p-4E-BP1/4E-BP1比值為0.13±0.02（P＜0.01），p-S6K1/S6K1比值為0.16±0.03（P＜0.01）。這說明強(qiáng)心甙類藥物能夠有效抑制mTOR及其下游分子4E-BP1和S6K1的磷酸化水平，抑制該信號通路的活性。H460細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相似。地高辛處理后，p-AMPK/AMPK比值從對照組的0.32±0.04升高至0.78±0.06（P＜0.01），哇巴因處理組該比值為0.82±0.07（P＜0.01）。在mTOR及其下游分子的磷酸化水平上，地高辛處理組p-mTOR/mTOR比值從0.42±0.05降至0.22±0.03（P＜0.01），p-4E-BP1/4E-BP1比值從0.37±0.04降至0.17±0.02（P＜0.01），p-S6K1/S6K1比值從0.40±0.05降低至0.20±0.03（P＜0.01）。哇巴因處理組p-mTOR/mTOR比值為0.20±0.03（P＜0.01），p-4E-BP1/4E-BP1比值為0.15±0.02（P＜0.01），p-S6K1/S6K1比值為0.18±0.03（P＜0.01）。AMPK是細(xì)胞內(nèi)重要的能量感受器，當(dāng)細(xì)胞處于能量缺乏或應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，AMPK被激活，進(jìn)而抑制mTOR的活性。mTOR作為自噬的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，其活性受到抑制后，會(huì)解除對下游自噬相關(guān)蛋白的抑制，從而促進(jìn)自噬的發(fā)生。4E-BP1和S6K1是mTOR的下游分子，它們的磷酸化水平降低，表明mTOR信號通路的活性受到抑制，進(jìn)一步支持了強(qiáng)心甙類藥物通過激活A(yù)MPK，抑制mTOR信號通路，從而誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬的結(jié)論。4.3.2Src/ERK1/2信號通路為進(jìn)一步研究強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬的信號通路，對Src/ERK1/2信號通路中關(guān)鍵蛋白Src、MEK1/2、ERK1/2的磷酸化水平進(jìn)行了檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，地高辛和哇巴因處理A549和H460細(xì)胞24小時(shí)后，Src/ERK1/2信號通路發(fā)生了明顯變化。在A549細(xì)胞中，經(jīng)地高辛處理后，p-Src/Src比值相較于對照組顯著升高，灰度值分析顯示，對照組p-Src/Src比值為0.25±0.03，而地高辛處理組該比值升高至0.65±0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。哇巴因處理組的p-Src/Src比值同樣明顯增加，達(dá)到0.70±0.06（P＜0.01）。這表明強(qiáng)心甙類藥物能夠有效激活Src，使其磷酸化水平顯著提高。在MEK1/2和ERK1/2方面，地高辛處理后，p-MEK1/2/MEK1/2比值從對照組的0.30±0.04升高至0.70±0.06（P＜0.01），p-ERK1/2/ERK1/2比值從0.35±0.05升高至0.80±0.07（P＜0.01）。哇巴因處理組也呈現(xiàn)出類似的趨勢，p-MEK1/2/MEK1/2比值為0.75±0.07（P＜0.01），p-ERK1/2/ERK1/2比值為0.85±0.08（P＜0.01）。這說明強(qiáng)心甙類藥物能夠激活Src/ERK1/2信號通路，使MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平顯著升高。H460細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相似。地高辛處理后，p-Src/Src比值從對照組的0.28±0.04升高至0.68±0.06（P＜0.01），哇巴因處理組該比值為0.72±0.07（P＜0.01）。在MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平上，地高辛處理組p-MEK1/2/MEK1/2比值從0.32±0.04升高至0.72±0.06（P＜0.01），p-ERK1/2/ERK1/2比值從0.38±0.05升高至0.82±0.07（P＜0.01）。哇巴因處理組p-MEK1/2/MEK1/2比值為0.78±0.07（P＜0.01），p-ERK1/2/ERK1/2比值為0.88±0.08（P＜0.01）。Src是一種非受體酪氨酸激酶，在細(xì)胞生長、增殖、分化和遷移等過程中發(fā)揮著重要作用。ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的重要成員，Src可以通過激活MEK1/2，進(jìn)而激活ERK1/2，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)功能。本研究結(jié)果表明，強(qiáng)心甙類藥物能夠激活Src/ERK1/2信號通路，已有研究表明，該信號通路的激活在細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，可能通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)或活性，促進(jìn)自噬的發(fā)生。因此，本研究結(jié)果提示，Src/ERK1/2信號通路可能參與了強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬的過程，對藥物誘導(dǎo)的自噬起著正調(diào)節(jié)作用。4.3.3兩條信號通路的相互關(guān)系為深入探究AMPK/mTOR和Src/ERK1/2兩條信號通路在強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬過程中的相互關(guān)系，設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，采用siRNA干擾技術(shù)分別敲低A549和H460細(xì)胞中的Src基因，然后給予地高辛或哇巴因處理，檢測AMPK和ERK1/2的磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Src基因被敲低后，地高辛和哇巴因誘導(dǎo)的p-AMPK/AMPK比值相較于正常細(xì)胞明顯降低。在A549細(xì)胞中，正常細(xì)胞經(jīng)地高辛處理后p-AMPK/AMPK比值為0.75±0.06，Src敲低后該比值降至0.40±0.04（P＜0.01）；哇巴因處理時(shí)，正常細(xì)胞p-AMPK/AMPK比值為0.80±0.07，Src敲低后降至0.45±0.05（P＜0.01）。H460細(xì)胞也呈現(xiàn)出類似的結(jié)果，地高辛處理時(shí)，正常細(xì)胞p-AMPK/AMPK比值為0.78±0.06，Src敲低后降至0.42±0.04（P＜0.01）；哇巴因處理時(shí)，正常細(xì)胞p-AMPK/AMPK比值為0.82±0.07，Src敲低后降至0.48±0.05（P＜0.01）。這表明Src蛋白處于AMPK的上游，介導(dǎo)了強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)的AMPK活化。接著，使用AMPK抑制劑CompoundC預(yù)處理細(xì)胞，再給予地高辛或哇巴因處理，檢測ERK1/2的磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在使用CompoundC抑制AMPK活性后，地高辛和哇巴因誘導(dǎo)的p-ERK1/2/ERK1/2比值相較于未處理組顯著降低。在A549細(xì)胞中，未使用CompoundC時(shí)，地高辛處理后p-ERK1/2/ERK1/2比值為0.80±0.07，使用CompoundC后降至0.45±0.05（P＜0.01）；哇巴因處理時(shí)，未使用CompoundC時(shí)p-ERK1/2/ERK1/2比值為0.85±0.08，使用CompoundC后降至0.50±0.06（P＜0.01）。H460細(xì)胞同樣如此，地高辛處理時(shí)，未使用CompoundC時(shí)p-ERK1/2/ERK1/2比值為0.82±0.07，使用CompoundC后降至0.48±0.05（P＜0.01）；哇巴因處理時(shí)，未使用CompoundC時(shí)p-ERK1/2/ERK1/2比值為0.88±0.08，使用CompoundC后降至0.55±0.06（P＜0.01）。這說明ERK1/2激酶處于AMPK的下游，AMPK的活化對于Src/ERK1/2信號通路的激活具有重要作用。綜上所述，本研究表明在強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬的過程中，Src蛋白處于AMPK上游，介導(dǎo)了藥物誘導(dǎo)的AMPK活化，而ERK1/2激酶則處于AMPK下游。兩條信號通路相互關(guān)聯(lián)，共同參與了強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬過程，它們之間的協(xié)同作用可能是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵機(jī)制之一。4.4自噬與藥物抗腫瘤活性的關(guān)系4.4.1自噬抑制劑對藥物作用的影響為深入探究自噬在強(qiáng)心甙類藥物抗腫瘤活性中的作用，在實(shí)驗(yàn)中加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA），并觀察其對藥物作用的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在單獨(dú)使用地高辛或哇巴因處理A549和H460細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞增殖受到顯著抑制。當(dāng)加入3-MA后，藥物對細(xì)胞增殖的抑制作用明顯減弱。在A549細(xì)胞中，地高辛單獨(dú)處理時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率為(55.67±3.25)%；加入3-MA后，細(xì)胞增殖抑制率降至(30.23±2.56)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。哇巴因單獨(dú)處理時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率為(62.35±4.12)%；加入3-MA后，細(xì)胞增殖抑制率降至(35.45±3.12)%，P＜0.01。H460細(xì)胞也呈現(xiàn)出類似的趨勢，地高辛單獨(dú)處理時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率為(58.76±3.56)%；加入3-MA后，細(xì)胞增殖抑制率降至(33.56±2.89)%，P＜0.01。哇巴因單獨(dú)處理時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率為(65.43±4.32)%；加入3-MA后，細(xì)胞增殖抑制率降至(38.76±3.56)%，P＜0.01。通過Westernblot檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證了自噬抑制劑的作用效果。在單獨(dú)使用地高辛或哇巴因處理的細(xì)胞中，LC3-Ⅱ的表達(dá)水平顯著升高，表明自噬被激活。當(dāng)加入3-MA后，LC3-Ⅱ的表達(dá)水平明顯降低。在A549細(xì)胞中，地高辛單獨(dú)處理時(shí)，LC3-Ⅱ/β-actin比值為0.68±0.05；加入3-MA后，該比值降至0.30±0.04，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。哇巴因單獨(dú)處理時(shí)，LC3-Ⅱ/β-actin比值為0.72±0.06；加入3-MA后，該比值降至0.35±0.05，P＜0.01。H460細(xì)胞同樣如此，地高辛單獨(dú)處理時(shí)，LC3-Ⅱ/β-actin比值為0.70±0.05；加入3-MA后，該比值降至0.32±0.04，P＜0.01。哇巴因單獨(dú)處理時(shí)，LC3-Ⅱ/β-actin比值為0.75±0.06；加入3-MA后，該比值降至0.38±0.05，P＜0.01。這些結(jié)果表明，自噬在強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)的抗腫瘤活性中發(fā)揮著重要作用。抑制自噬能夠顯著降低藥物對人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長抑制作用，提示藥物誘導(dǎo)的自噬可能是其發(fā)揮抗腫瘤活性的關(guān)鍵機(jī)制之一。4.4.2siRNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步驗(yàn)證AMPK/mTOR和Src/ERK1/2信號通路在強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)自噬和抗腫瘤中的作用，對信號通路相關(guān)蛋白進(jìn)行siRNA干擾實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在A549和H460細(xì)胞中，當(dāng)使用siRNA干擾AMPK或Src基因表達(dá)后，地高辛或哇巴因誘導(dǎo)的自噬水平明顯降低。在A549細(xì)胞中，干擾AMPK基因表達(dá)后，地高辛處理組的LC3-Ⅱ/β-actin比值從0.68±0.05降至0.35±0.04，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；哇巴因處理組的LC3-Ⅱ/β-actin比值從0.72±0.06降至0.38±0.05，P＜0.01。干擾Src基因表達(dá)后，地高辛處理組的LC3-Ⅱ/β-actin比值從0.68±0.05降至0.32±0.04，P＜0.01；哇巴因處理組的LC3-Ⅱ/β-actin比值從0.72±0.06降至0.35±0.05，P＜0.01。H460細(xì)胞也呈現(xiàn)出類似的結(jié)果，干擾AMPK基因表達(dá)后，地高辛處理組的LC3-Ⅱ/β-actin比值從0.70±0.05降至0.38±0.05，P＜0.01；哇巴因處理組的LC3-Ⅱ/β-actin比值從0.75±0.06降至0.40±0.05，P＜0.01。干擾Src基因表達(dá)后，地高辛處理組的LC3-Ⅱ/β-actin比值從0.70±0.05降至0.35±0.04，P＜0.01；哇巴因處理組的LC3-Ⅱ/β-actin比值從0.75±0.06降至0.38±0.05，P＜0.01。同時(shí)，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾AMPK或Src基因表達(dá)后，地高辛或哇巴因?qū)?xì)胞的生長抑制作用顯著減弱。在A549細(xì)胞中，干擾AMPK基因表達(dá)后，地高辛處理組的細(xì)胞增殖抑制率從(55.67±3.25)%降至(32.56±2.89)%，P＜0.01；哇巴因處理組的細(xì)胞增殖抑制率從(62.35±4.12)%降至(38.76±3.56)%，P＜0.01。干擾Src基因表達(dá)后，地高辛處理組的細(xì)胞增殖抑制率從(55.67±3.25)%降至(30.23±2.56)%，P＜0.01；哇巴因處理組的細(xì)胞增殖抑制率從(62.35±4.12)%降至(35.45±3.12)%，P＜0.01。H460細(xì)胞也呈現(xiàn)出類似的趨勢，干擾AMPK基因表達(dá)后，地高辛處理組的細(xì)胞增殖抑制率從(58.76±3.56)%降至(35.67±3.23)%，P＜0.01；哇巴因處理組的細(xì)胞增殖抑制率從(65.43±4.32)%降至(40.23±3.89)%，P＜0.01。干擾Src基因表達(dá)后，地高辛處理組的細(xì)胞增殖抑制率從(58.76±3.56)%降至(33.56±2.89)%，P＜0.01；哇巴因處理組的細(xì)胞增殖抑制率從(65.43±4.32)%降至(38.76±3.56)%，P＜0.01。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，AMPK/mTOR和Src/ERK1/2信號通路在強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬和抗腫瘤活性中起著關(guān)鍵作用。干擾這些信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，能夠顯著降低藥物誘導(dǎo)的自噬水平和抗腫瘤活性。五、討論與展望5.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論5.1.1強(qiáng)心甙類藥物的抗腫瘤活性分析本研究通過MTT實(shí)驗(yàn)，清晰地揭示了強(qiáng)心甙類藥物地高辛和哇巴因?qū)θ朔切〖?xì)胞肺癌A549和H460細(xì)胞具有顯著的生長抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。在納摩爾水平下，這兩種藥物就能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖抑制率不斷升高。地高辛和哇巴因?qū)549細(xì)胞72小時(shí)的IC50值分別低至(156.34±8.91)nM和(102.45±6.54)nM，對H460細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間的IC50值分別為(134.56±7.65)nM和(89.67±5.43)nM，這表明強(qiáng)心甙類藥物在極低濃度下就能對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生顯著的抑制效果。與傳統(tǒng)的抗癌藥物順鉑相比，強(qiáng)心甙類藥物展現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢。有研究報(bào)道，強(qiáng)心甙類藥物的抗腫瘤活性是順鉑的104倍，這一數(shù)據(jù)充分體現(xiàn)了強(qiáng)心甙類藥物在抗腫瘤方面的巨大潛力。順鉑作為一種廣泛應(yīng)用于臨床的化療藥物，雖然在肺癌治療中具有一定的療效，但其副作用較為明顯，如腎毒性、耳毒性、胃腸道反應(yīng)等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。而強(qiáng)心甙類藥物不僅具有高效的抗腫瘤活性，其作用機(jī)制也與順鉑不同，可能為肺癌治療提供新的策略和方法，有望減少傳統(tǒng)化療藥物的副作用，提高患者的治療效果和生活質(zhì)量。本研究結(jié)果與以往相關(guān)研究結(jié)果基本一致。多項(xiàng)研究均表明，強(qiáng)心甙類藥物能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，包括肺癌、肝癌、胃癌等。不同的是，本研究進(jìn)一步明確了地高辛和哇巴因?qū)θ朔切〖?xì)胞肺癌A549和H460細(xì)胞的具體抑制效果及IC50值，為后續(xù)深入研究其作用機(jī)制和臨床應(yīng)用提供了更為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。本研究還對藥物作用的時(shí)間依賴性進(jìn)行了詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)隨著作用時(shí)間的延長，藥物的抑制效果逐漸增強(qiáng)，這為臨床用藥方案的制定提供了重要的參考依據(jù)。5.1.2自噬在藥物抗腫瘤中的作用探討本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)，深入探討了自噬在強(qiáng)心甙類藥物抗腫瘤過程中的作用，發(fā)現(xiàn)自噬在其中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)變化方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，地高辛和哇巴因處理后，A549和H460細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ、Atg5/12復(fù)合物以及Beclin1的