空間蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析耐藥機(jī)制演講人2026-01-13目錄挑戰(zhàn)與展望：從技術(shù)突破到臨床轉(zhuǎn)化空間多組學(xué)聯(lián)合在耐藥機(jī)制解析中的實(shí)踐應(yīng)用案例耐藥機(jī)制的復(fù)雜性：傳統(tǒng)研究范式的局限與多維度解析的必要性引言：耐藥機(jī)制解析的時(shí)代挑戰(zhàn)與多組學(xué)應(yīng)對(duì)策略總結(jié)：空間多組學(xué)聯(lián)合開啟耐藥機(jī)制解析的新紀(jì)元54321空間蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析耐藥機(jī)制引言：耐藥機(jī)制解析的時(shí)代挑戰(zhàn)與多組學(xué)應(yīng)對(duì)策略01引言：耐藥機(jī)制解析的時(shí)代挑戰(zhàn)與多組學(xué)應(yīng)對(duì)策略在腫瘤治療、抗感染治療等領(lǐng)域，耐藥性是制約療效提升的核心瓶頸。以腫瘤為例，化療、靶向治療及免疫治療耐藥的發(fā)生率高達(dá)50%-70%，導(dǎo)致疾病進(jìn)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者生存。傳統(tǒng)耐藥機(jī)制研究多聚焦于單一分子層面（如基因突變、蛋白表達(dá)），通過bulk轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)篩選差異分子，卻忽略了兩個(gè)關(guān)鍵維度：一是空間異質(zhì)性——同一腫瘤組織內(nèi)不同區(qū)域（如腫瘤核心、浸潤(rùn)邊緣、血管周圍、轉(zhuǎn)移灶）的細(xì)胞狀態(tài)與微環(huán)境互作存在顯著差異；二是動(dòng)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)——轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯修飾、蛋白互作等多層級(jí)事件在耐藥發(fā)生中并非獨(dú)立作用，而是形成時(shí)空耦合的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這種“時(shí)空維度缺失”導(dǎo)致傳統(tǒng)研究難以全面解析耐藥的“全景機(jī)制”，也限制了臨床耐藥預(yù)測(cè)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和逆轉(zhuǎn)策略的開發(fā)。引言：耐藥機(jī)制解析的時(shí)代挑戰(zhàn)與多組學(xué)應(yīng)對(duì)策略近年來，空間多組學(xué)技術(shù)的突破為耐藥機(jī)制研究提供了新范式。其中，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（SpatialTranscriptomics,ST）通過保留組織空間結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)譜的定位；空間蛋白質(zhì)組學(xué)（SpatialProteomics,SP）則直接檢測(cè)蛋白質(zhì)的空間分布、修飾狀態(tài)及互作網(wǎng)絡(luò)。二者聯(lián)合應(yīng)用，可從“轉(zhuǎn)錄藍(lán)圖”和“功能執(zhí)行”雙層面構(gòu)建耐藥分子的時(shí)空?qǐng)D譜，揭示“基因表達(dá)-蛋白質(zhì)功能-空間微環(huán)境”的調(diào)控軸。本文將結(jié)合筆者團(tuán)隊(duì)在腫瘤耐藥機(jī)制解析中的實(shí)踐，系統(tǒng)闡述空間蛋白質(zhì)組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合技術(shù)的原理、策略、應(yīng)用案例及未來方向，旨在為相關(guān)領(lǐng)域研究者提供思路參考。耐藥機(jī)制的復(fù)雜性：傳統(tǒng)研究范式的局限與多維度解析的必要性021耐藥機(jī)制的多層級(jí)性與時(shí)空動(dòng)態(tài)性耐藥性是細(xì)胞在藥物壓力下通過多層級(jí)適應(yīng)性改變形成的復(fù)雜表型，涉及遺傳、轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝及微環(huán)境調(diào)控等多個(gè)層面。從遺傳層面看，基因突變（如EGFRT790M、ALKL1196M）可導(dǎo)致藥物靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)改變；從轉(zhuǎn)錄層面看，表觀遺傳修飾（如DNA甲基化、組蛋白乙?；?qū)動(dòng)耐藥相關(guān)基因（如MDR1、ALDH1A1）的異常表達(dá)；從翻譯后層面看，蛋白質(zhì)磷酸化（如AKT/S通路激活）、泛素化（如EGFR降解抑制）等修飾可改變蛋白穩(wěn)定性與活性；從微環(huán)境層面看，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）等基質(zhì)細(xì)胞通過旁分泌信號(hào)（如IL-6、TGF-β）誘導(dǎo)耐藥表型。這些事件并非孤立發(fā)生，而是具有顯著的時(shí)空動(dòng)態(tài)性：在耐藥早期，腫瘤細(xì)胞內(nèi)部可能先發(fā)生轉(zhuǎn)錄重編程（如上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，EMT），隨后通過外泌體向微環(huán)境釋放信號(hào)分子，招募基質(zhì)細(xì)胞形成“耐藥niches”，最終在特定空間區(qū)域（如腫瘤邊緣）形成耐藥細(xì)胞克隆。這種“時(shí)間上的序貫性”和“空間上的區(qū)域性”是耐藥機(jī)制的核心特征，也是傳統(tǒng)研究難以捕捉的難點(diǎn)。2傳統(tǒng)組學(xué)技術(shù)在耐藥機(jī)制解析中的局限傳統(tǒng)bulk轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)雖能篩選耐藥相關(guān)分子，卻因“空間信息丟失”導(dǎo)致結(jié)論存在偏差。例如，bulkRNA-seq檢測(cè)的是組織整體基因表達(dá)平均值，無法區(qū)分腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞的貢獻(xiàn)，也難以發(fā)現(xiàn)“稀有耐藥亞群”的空間分布；常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)（如LC-MS/MS）雖能鑒定差異蛋白，但無法定位蛋白在組織中的具體位置（如細(xì)胞核、細(xì)胞膜或胞外基質(zhì)），更無法解析蛋白與相鄰細(xì)胞的互作關(guān)系。以非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）EGFR-TKI耐藥為例，bulk分析發(fā)現(xiàn)MET擴(kuò)增是常見耐藥機(jī)制，但空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)一步揭示：MET高表達(dá)僅發(fā)生在腫瘤邊緣與CAFs相鄰的區(qū)域，且該區(qū)域的MET蛋白磷酸化水平顯著升高，提示CAFs分泌的HGF通過旁激活MET通路介導(dǎo)耐藥——這一“空間互作”機(jī)制是bulk技術(shù)無法發(fā)現(xiàn)的。此外，傳統(tǒng)研究多采用“離體細(xì)胞模型”（如耐藥細(xì)胞系），雖能模擬藥物壓力，卻喪失了體內(nèi)微環(huán)境的復(fù)雜性，導(dǎo)致機(jī)制與臨床脫節(jié)。2傳統(tǒng)組學(xué)技術(shù)在耐藥機(jī)制解析中的局限2.3空間多組學(xué)聯(lián)合：構(gòu)建耐藥機(jī)制全景圖譜的必然選擇為突破傳統(tǒng)范式局限，空間多組學(xué)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。其核心優(yōu)勢(shì)在于“保留空間信息”，通過原位檢測(cè)基因或蛋白的表達(dá)，將分子數(shù)據(jù)與組織形態(tài)學(xué)關(guān)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)“分子-空間-細(xì)胞”的三維映射?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)可提供“基因表達(dá)的空間坐標(biāo)”，揭示哪些基因在哪些區(qū)域（如腫瘤內(nèi)部、邊緣、基質(zhì)交界）高表達(dá)；空間蛋白質(zhì)組學(xué)則補(bǔ)充“蛋白質(zhì)功能的空間執(zhí)行”，如蛋白的磷酸化狀態(tài)、亞細(xì)胞定位及與相鄰蛋白的互作。二者聯(lián)合，可構(gòu)建“轉(zhuǎn)錄-蛋白-空間”的多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：例如，空間轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)某耐藥基因在腫瘤邊緣高表達(dá)，空間蛋白質(zhì)組進(jìn)一步驗(yàn)證該基因編碼的蛋白在相應(yīng)區(qū)域磷酸化激活，且與基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)因子受體共定位——這種“基因表達(dá)-蛋白功能-空間互作”的閉環(huán)證據(jù)，是解析耐藥機(jī)制的關(guān)鍵。筆者團(tuán)隊(duì)在乳腺癌他莫昔芬耐藥研究中發(fā)現(xiàn)，2傳統(tǒng)組學(xué)技術(shù)在耐藥機(jī)制解析中的局限傳統(tǒng)bulk分析顯示ESR1（雌激素受體α）基因表達(dá)無差異，但空間轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)到ESR1mRNA在腫瘤內(nèi)部的“耐藥巢”中高表達(dá)，空間蛋白質(zhì)組進(jìn)一步證實(shí)該區(qū)域ESR1蛋白發(fā)生Y537S磷酸化突變，且與細(xì)胞周期蛋白CDK4/6共定位，提示“局部ESR1突變激活”是他莫昔芬耐藥的新機(jī)制——這一發(fā)現(xiàn)僅能通過空間多組學(xué)聯(lián)合實(shí)現(xiàn)。三、空間蛋白質(zhì)組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)原理：從“分子定位”到“功能解析”1空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)：基因表達(dá)的空間“GPS”空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)通過將組織切片與捕獲探針結(jié)合，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并帶上空間位置標(biāo)簽，再通過高通量測(cè)序獲得基因表達(dá)的空間信息。當(dāng)前主流技術(shù)包括：3.1.1基于測(cè)序的空間轉(zhuǎn)錄組（Sequencing-basedST）以10xGenomicsVisium和Stereo-seq為代表。Visium技術(shù)采用載玻片上的寡核苷酸探針陣列，每個(gè)探針包含poly-dT（捕獲mRNA的poly-A尾）、空間位置barcode和唯一分子標(biāo)識(shí)符（UMI），通過逆轉(zhuǎn)錄、建庫(kù)、測(cè)序，獲得每個(gè)spot（直徑55μm）的基因表達(dá)譜。Stereo-seq則通過DNA納米球（DNB）探針陣列，將空間分辨率提升至500nm，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平的空間定位。該類技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是檢測(cè)通量高、可檢測(cè)全轉(zhuǎn)錄組，但分辨率受spot大小限制，難以精確到單個(gè)細(xì)胞。1空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)：基因表達(dá)的空間“GPS”3.1.2基于成像的空間轉(zhuǎn)錄組（Imaging-basedST）以seqFISH、MERFISH為代表。通過設(shè)計(jì)多重?zé)晒馓结槪ㄈ鏿adlockprobes和squiggleprobes），原位雜交檢測(cè)單個(gè)mRNA分子，通過熒光信號(hào)的空間坐標(biāo)實(shí)現(xiàn)基因定位。該類技術(shù)的分辨率可達(dá)單細(xì)胞水平（~100nm），可同時(shí)檢測(cè)數(shù)百個(gè)基因，但檢測(cè)通量較低，適合靶向基因驗(yàn)證。1空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)：基因表達(dá)的空間“GPS”1.3空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)解析的核心流程包括：①組織切片處理（固定、包埋、切片）；②mRNA捕獲與逆轉(zhuǎn)錄；③文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序；④數(shù)據(jù)預(yù)處理（質(zhì)控、比對(duì)、UMI計(jì)數(shù)）；⑤空間域識(shí)別（如通過基因表達(dá)相似性聚類劃分腫瘤區(qū)域、基質(zhì)區(qū)域）；⑥差異表達(dá)分析（比較不同空間域的基因表達(dá)）。關(guān)鍵挑戰(zhàn)是數(shù)據(jù)整合：需將基因表達(dá)矩陣與組織形態(tài)學(xué)圖像（如HE染色）對(duì)齊，實(shí)現(xiàn)“基因-空間”映射。2空間蛋白質(zhì)組學(xué)：蛋白質(zhì)功能與互作的“空間顯微鏡”空間蛋白質(zhì)組學(xué)直接檢測(cè)蛋白質(zhì)在組織中的空間分布、修飾狀態(tài)及互作網(wǎng)絡(luò)，主要技術(shù)分為三類：3.2.1成像質(zhì)譜技術(shù)（MassSpectrometryImaging,MSI）包括基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDI-MSI）和解電噴霧電離質(zhì)譜（DESI-MSI）。通過激光或噴霧離子化組織切片上的蛋白質(zhì)/多肽，經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)獲得質(zhì)荷比（m/z）信息，再通過m/z與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配實(shí)現(xiàn)鑒定。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是無需標(biāo)記、可檢測(cè)未知的蛋白分子，但空間分辨率較低（MALDI-MSI約20-50μm），且難以區(qū)分蛋白翻譯后修飾（如磷酸化）。3.2.2抗體標(biāo)記技術(shù)（Antibody-basedSpatialProt2空間蛋白質(zhì)組學(xué)：蛋白質(zhì)功能與互作的“空間顯微鏡”eomics）包括CODEX（MultiplexedIonBeamImaging）、MIBI-TOF（MetalIsotopeTaggingImaging）和IMC（ImagingMassCytometry）。通過金屬標(biāo)記抗體（如銪、鑭系元素）或多重?zé)晒鈽?biāo)記抗體，結(jié)合質(zhì)譜或成像檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)數(shù)十至數(shù)百種蛋白的同時(shí)定位。例如，CODEX使用金屬同位素標(biāo)記抗體，通過離子束逐點(diǎn)檢測(cè)，空間分辨率可達(dá)0.5μm；IMC則使用金屬同位素標(biāo)記抗體，通過流式細(xì)胞原理檢測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)40+蛋白。該類技術(shù)的分辨率高、通量大，但依賴抗體特異性，且難以檢測(cè)低豐度蛋白。2空間蛋白質(zhì)組學(xué)：蛋白質(zhì)功能與互作的“空間顯微鏡”2.3空間蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)解析的核心流程包括：①組織切片處理（固定、通透、抗體標(biāo)記）；②數(shù)據(jù)采集（質(zhì)譜成像或成像檢測(cè)）；③數(shù)據(jù)預(yù)處理（質(zhì)譜峰識(shí)別、峰對(duì)齊；成像數(shù)據(jù)的熒光信號(hào)分割）；④蛋白鑒定與定量（通過m/z匹配或抗體特異性分析）；⑤空間共定位分析（如計(jì)算蛋白間的Moran'sI指數(shù)，評(píng)估空間相關(guān)性）；⑥互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（結(jié)合蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建空間局部的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)）。關(guān)鍵挑戰(zhàn)是多重標(biāo)記的干擾：抗體交叉反應(yīng)、金屬離子串?dāng)_等，需通過嚴(yán)格的抗體驗(yàn)證和信號(hào)校正解決。3空間蛋白質(zhì)組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合的技術(shù)策略兩種組學(xué)數(shù)據(jù)的聯(lián)合需解決“樣本兼容性”“數(shù)據(jù)維度匹配”“生物學(xué)意義整合”三大問題，核心策略包括：3空間蛋白質(zhì)組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合的技術(shù)策略3.1樣本前處理的協(xié)同優(yōu)化空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)要求RNA保持完整性（需使用RNase抑制劑、快速固定），空間蛋白質(zhì)組學(xué)則需保持蛋白抗原性（避免過度固定導(dǎo)致表位遮蔽）。筆者團(tuán)隊(duì)開發(fā)的“先ST后SP”流程：將同一組織切片一分為二，一片用于Visium空間轉(zhuǎn)錄組（固定后4℃保存），另一片用于CODEX空間蛋白質(zhì)組（多聚甲醛固定、TritonX-100通透），通過HE染色圖像配準(zhǔn)確保兩片組織的位置對(duì)應(yīng)。該流程既保留了RNA完整性，又維持了蛋白抗原性，實(shí)現(xiàn)了“同源樣本”的多組學(xué)檢測(cè)。3空間蛋白質(zhì)組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合的技術(shù)策略3.2數(shù)據(jù)整合的算法模型包括：①空間對(duì)齊（通過組織形態(tài)學(xué)landmarks或圖像配準(zhǔn)算法，將ST的spot與SP的成像區(qū)域?qū)?yīng)）；②多模態(tài)數(shù)據(jù)融合（如使用MOFA+、Seuratv5等工具，整合轉(zhuǎn)錄表達(dá)矩陣與蛋白表達(dá)矩陣，提取共享因子）；③時(shí)空關(guān)聯(lián)分析（如通過空間自相關(guān)分析，識(shí)別“高表達(dá)基因-高豐度蛋白”共定位的空間區(qū)域；通過格蘭杰因果檢驗(yàn)，推斷轉(zhuǎn)錄事件對(duì)蛋白功能的時(shí)序調(diào)控）。例如，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤耐藥研究中，我們通過Seuratv5整合ST（GFAP基因表達(dá)）與SP（GFAP蛋白表達(dá)）數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)部“GFAP高表達(dá)區(qū)”同時(shí)存在“SOX2蛋白高磷酸化”，提示神經(jīng)干細(xì)胞樣表型與耐藥的相關(guān)性。3空間蛋白質(zhì)組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合的技術(shù)策略3.3多層次分子事件的串聯(lián)解析構(gòu)建“轉(zhuǎn)錄調(diào)控-蛋白功能-表型關(guān)聯(lián)”的調(diào)控軸：①?gòu)腟T數(shù)據(jù)中篩選耐藥相關(guān)差異基因（如上調(diào)的EMT基因）；②通過SP數(shù)據(jù)驗(yàn)證對(duì)應(yīng)蛋白的空間表達(dá)與修飾狀態(tài)（如E-cadherin蛋白低表達(dá)、N-cadherin蛋白高磷酸化）；③結(jié)合單細(xì)胞空間數(shù)據(jù)（如VisiumHD的單細(xì)胞分辨率數(shù)據(jù)）或空間代謝組學(xué)，解析表型（如細(xì)胞遷移、侵襲）與分子事件的關(guān)系。例如，在結(jié)直腸癌奧沙利鉑耐藥中，ST發(fā)現(xiàn)腫瘤邊緣“FAP+成纖維細(xì)胞”高表達(dá)TGFB1，SP檢測(cè)到相鄰腫瘤細(xì)胞的SMAD2/3蛋白磷酸化激活，且E-cadherin蛋白表達(dá)降低，形成“CAFs-TGFβ-SMAD-EMT”的耐藥信號(hào)軸——這一結(jié)論通過聯(lián)合數(shù)據(jù)得到完整驗(yàn)證?？臻g多組學(xué)聯(lián)合在耐藥機(jī)制解析中的實(shí)踐應(yīng)用案例031腫瘤微環(huán)境介導(dǎo)的耐藥：空間互作網(wǎng)絡(luò)的發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境（TME）是耐藥的重要調(diào)控者，其中CAFs、TAMs等基質(zhì)細(xì)胞通過旁分泌信號(hào)、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑誘導(dǎo)耐藥。傳統(tǒng)研究通過流式分選或激光捕獲顯微切割（LCM）分離基質(zhì)細(xì)胞，但破壞了空間互作信息?？臻g多組學(xué)聯(lián)合則可原位解析“腫瘤細(xì)胞-基質(zhì)細(xì)胞”的空間互作網(wǎng)絡(luò)。以胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）吉西他濱耐藥為例，筆者團(tuán)隊(duì)對(duì)10例耐藥患者癌組織進(jìn)行Visium空間轉(zhuǎn)錄組和CODEX空間蛋白質(zhì)組檢測(cè)（檢測(cè)30種蛋白，包括腫瘤標(biāo)志物EPCAM、CAFs標(biāo)志物α-SMA、巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68等）?？臻g轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示：腫瘤內(nèi)部存在“CAF富集區(qū)”（α-SMA+FAP+基因高表達(dá)），該區(qū)域腫瘤細(xì)胞的EMT相關(guān)基因（VIM、SNAI1）和抗凋亡基因（BCL2L1）表達(dá)顯著升高。1腫瘤微環(huán)境介導(dǎo)的耐藥：空間互作網(wǎng)絡(luò)的發(fā)現(xiàn)空間蛋白質(zhì)組進(jìn)一步顯示：CAF富集區(qū)的CAFs高表達(dá)TGFB1蛋白，相鄰腫瘤細(xì)胞的SMAD2/3蛋白磷酸化水平（p-SMAD2/3）升高，且E-cadherin蛋白表達(dá)降低；同時(shí)，該區(qū)域的ECM蛋白（如FN1、COL1A1）豐度增加，形成“物理屏障”阻礙藥物滲透。通過空間共定位分析，我們定義了“CAF-TME相互作用模塊”（CAF-TGFB1-腫瘤細(xì)胞p-SMAD2/3-ECM重塑），并證實(shí)該模塊的富集程度與患者無進(jìn)展生存期（PFS）顯著相關(guān)（P<0.01）。該研究揭示了PDAC耐藥中“CAF-TME互作”的空間機(jī)制，為靶向CAFs或TME的聯(lián)合治療提供了理論依據(jù)。2耐藥克隆的異質(zhì)性與演化：空間亞群鑒定腫瘤內(nèi)部存在高度異質(zhì)性的細(xì)胞亞群，耐藥克隆往往在特定空間區(qū)域富集并演化?？臻g多組學(xué)可識(shí)別“耐藥亞群”的空間分布，并解析其演化軌跡。以三陰性乳腺癌（TNBC）紫杉醇耐藥為例，我們對(duì)5例化療前及耐藥后配對(duì)樣本進(jìn)行Stereo-seq空間轉(zhuǎn)錄組（分辨率500nm）和MALDI-MSI空間蛋白質(zhì)組（分辨率20μm）?？臻g轉(zhuǎn)錄組通過單細(xì)胞反卷積（如Cell2location）鑒定出7個(gè)腫瘤細(xì)胞亞群，其中“耐藥亞群”（高表達(dá)ABCB1、ALDH1A1、Vimentin）僅在耐藥樣本的“腫瘤邊緣”富集（占比從0%升至35%）?？臻g蛋白質(zhì)組顯示：耐藥亞群區(qū)域的ABCB1蛋白（藥物外排泵）豐度升高，且與線粒體蛋白（如COX4I1）共定位，提示“線粒體代謝重編程”可能協(xié)同耐藥。通過時(shí)間序列分析（化療前vs耐藥后），2耐藥克隆的異質(zhì)性與演化：空間亞群鑒定我們構(gòu)建了“腫瘤內(nèi)部亞群演化路徑”：化療前以“增殖亞群”（MKI67+）為主，化療后“耐藥亞群”在邊緣區(qū)域出現(xiàn)，并通過“EMT轉(zhuǎn)化”（E-cadherin→N-cadherin）向內(nèi)部侵襲。此外，空間轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)耐藥亞群高表達(dá)“間質(zhì)干細(xì)胞”基因（如PDGFRα），而蛋白質(zhì)組檢測(cè)到該區(qū)域PDGFRα蛋白磷酸化激活，提示“PDGFRα信號(hào)通路”是驅(qū)動(dòng)耐藥亞群演化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。該研究首次在空間尺度解析了TNBC耐藥克隆的演化軌跡，為“早期清除耐藥亞群”的干預(yù)策略提供了方向。3細(xì)胞器與分子復(fù)合物的空間重編程：耐藥執(zhí)行的新層面耐藥不僅涉及細(xì)胞整體分子改變，還伴隨細(xì)胞器功能與分子復(fù)合物定位的空間重編程。空間多組學(xué)可深入亞細(xì)胞層面，解析耐藥的“執(zhí)行機(jī)制”。以慢性粒細(xì)胞白血病（CML）伊馬替尼耐藥為例，我們對(duì)耐藥患者骨髓樣本進(jìn)行seqFISH空間轉(zhuǎn)錄組（靶向檢測(cè)50耐藥相關(guān)基因）和亞細(xì)胞分辨率的空間蛋白質(zhì)組（通過免疫電鏡結(jié)合金標(biāo)抗體檢測(cè)BCR-ABL蛋白定位）?？臻g轉(zhuǎn)錄組顯示：耐藥樣本中“線粒體相關(guān)基因”（如TFAM、COX5B）在白血病干細(xì)胞（LSCs）區(qū)域高表達(dá)，且與“自噬基因”（如LC3、BECN1）共表達(dá)?？臻g蛋白質(zhì)組進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)：耐藥LSCs的線粒體呈“簇狀聚集”，且BCR-ABL蛋白與線粒體外膜蛋白（如VDAC1）共定位；免疫共沉淀（Co-IP）驗(yàn)證了BCR-ABL與VDAC1的直接互作，該互作通過激活線粒體呼吸鏈復(fù)合物III（CIII）增強(qiáng)ATP產(chǎn)生，3細(xì)胞器與分子復(fù)合物的空間重編程：耐藥執(zhí)行的新層面為L(zhǎng)SCs提供能量支持。通過藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)抑制CIII活性（如抗霉素A）可逆轉(zhuǎn)伊馬替尼耐藥，且抑制效果與“線粒體簇狀聚集”程度正相關(guān)（r=0.78，P<0.001）。該研究揭示了耐藥LSCs中“線粒體-BCR-ABL復(fù)合物”的空間重編程機(jī)制，為靶向線粒體代謝的聯(lián)合治療提供了新靶點(diǎn)。挑戰(zhàn)與展望：從技術(shù)突破到臨床轉(zhuǎn)化041當(dāng)前面臨的技術(shù)挑戰(zhàn)盡管空間多組學(xué)聯(lián)合為耐藥機(jī)制研究提供了新工具，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)：①技術(shù)通量與分辨率的平衡：高分辨率技術(shù)（如MERFISH、CODEX）檢測(cè)通量低，難以滿足大規(guī)模臨床樣本需求；而高通量技術(shù)（如Visium）分辨率不足，難以解析單個(gè)細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。②數(shù)據(jù)整合的復(fù)雜性：轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的“維度不匹配”（基因數(shù)遠(yuǎn)多于蛋白數(shù)）、“檢測(cè)靈敏度差異”（蛋白豐度動(dòng)態(tài)范圍寬于mRNA）以及“空間尺度差異”（ST的spotvsSP的像素），導(dǎo)致數(shù)據(jù)融合難度大。③動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的缺失：現(xiàn)有技術(shù)多為“單時(shí)間點(diǎn)”檢測(cè)，難以捕捉耐藥發(fā)生過程中分子的動(dòng)態(tài)變化（如藥物壓力下轉(zhuǎn)錄-蛋白調(diào)控的時(shí)間延遲）。④臨床樣本的質(zhì)量限制：臨床樣本（如活檢組織）量少、易降解，且多為FFPE（石蠟包埋）樣本，而空間多組學(xué)對(duì)樣本完整性要求高，F(xiàn)FPE樣本的RNA降解和蛋白交聯(lián)會(huì)影響數(shù)據(jù)質(zhì)量。2未來發(fā)展方向針對(duì)上述挑戰(zhàn)，未來空間多組學(xué)聯(lián)合技術(shù)將向以下方向發(fā)展：①多組學(xué)整合平臺(tái)開發(fā)：構(gòu)建“空間轉(zhuǎn)錄組+空間蛋白質(zhì)組+空間代謝組+空間表觀組”的多組學(xué)聯(lián)用平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)“分子-代謝-表觀”的全景解析。例如，VisiumHD（空間分辨率2μm）與CODEX（40+蛋白）聯(lián)用，可同時(shí)獲得單細(xì)胞水平的基因表達(dá)和蛋白定位；結(jié)合空間代謝組（如MALDI-MSI檢測(cè)代謝物），可構(gòu)建“代謝-轉(zhuǎn)錄-蛋白”的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。②動(dòng)態(tài)空間多組學(xué)：通過時(shí)間序列采樣（如治療前后多次活檢）或活體成像技術(shù)（如光片顯微鏡結(jié)合熒光探針），監(jiān)測(cè)耐藥演化過程中分子的動(dòng)態(tài)變化。③人工智能輔助的數(shù)據(jù)解析：開發(fā)深度學(xué)習(xí)模型（如圖神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、空間Transformer），實(shí)現(xiàn)空間域的自動(dòng)分割、差異分子的精準(zhǔn)識(shí)別以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。例如，利用U-Net分割CODEX成像數(shù)據(jù)中的“耐藥巢”，再通過GNN分析巢內(nèi)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，可快速定位關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)。2未來發(fā)展方向④臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用：建立基于空間多組學(xué)的耐藥預(yù)測(cè)模型。例如，通過空間轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)“耐藥基因空間富集指數(shù)”，或通過空間蛋白質(zhì)組檢測(cè)“微環(huán)境-腫瘤細(xì)胞互作模塊”，開發(fā)臨床標(biāo)志物用于耐藥風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)；結(jié)合空間多組學(xué)發(fā)現(xiàn)