徐長卿誘導(dǎo)人肝癌細胞HepG-2凋亡的實驗及機制解析一、引言1.1研究背景肝癌是全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，肝癌新發(fā)病例約90.6萬例，死亡病例約83萬例，分別位居全球惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第六位和第三位。在中國，肝癌的形勢更為嚴峻，由于乙肝病毒感染率較高等因素，我國肝癌的發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)均占全球的一半以上。肝癌具有惡性程度高、生長迅速、早期癥狀隱匿、易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等特點。多數(shù)患者在確診時已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機會。即使接受了手術(shù)治療，術(shù)后復(fù)發(fā)率也較高，5年生存率較低。目前，肝癌的治療方法主要包括手術(shù)切除、肝移植、介入治療、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。手術(shù)切除和肝移植是早期肝癌的主要治療手段，但由于腫瘤的大小、位置、數(shù)量以及患者的肝功能狀況等因素的限制，僅有少數(shù)患者適合手術(shù)治療。對于中晚期肝癌，介入治療、化療、放療等傳統(tǒng)治療方法的療效有限，且往往伴隨著嚴重的不良反應(yīng)，給患者帶來較大的痛苦。近年來，靶向治療和免疫治療為肝癌的治療帶來了新的希望，但這些治療方法的費用高昂，且并非對所有患者都有效，還存在耐藥等問題。因此，尋找安全、有效、經(jīng)濟的肝癌治療方法具有重要的臨床意義和社會價值。中醫(yī)藥在腫瘤治療中具有獨特的優(yōu)勢，其多靶點、多途徑的作用機制，以及不良反應(yīng)小、能提高患者生活質(zhì)量等特點，逐漸受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。許多中藥及其提取物被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性，能夠通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)機體免疫功能等多種途徑發(fā)揮抗癌作用。徐長卿（Cynanchumpaniculatum(Bunge)Kitagawa）是蘿藦科牛皮消屬多年生直立草本植物，在我國分布廣泛，資源豐富。徐長卿作為一種傳統(tǒng)中藥，具有祛風(fēng)止痛、活血解毒、利水消腫等功效，常用于治療風(fēng)濕痹痛、胃痛脹滿、牙痛、腰痛、跌撲損傷、蕁麻疹、濕疹等病癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，徐長卿含有多種化學(xué)成分，如甾體皂苷、黃酮、萜類、多糖等，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)徐長卿具有潛在的抗腫瘤作用。有研究報道，徐長卿提取物對多種腫瘤細胞系，如肺癌細胞、胃癌細胞、乳腺癌細胞等，均表現(xiàn)出一定的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。然而，關(guān)于徐長卿誘導(dǎo)人肝癌細胞凋亡及其分子機制的研究相對較少，尚未形成系統(tǒng)的理論和方法。人肝癌細胞HepG-2是一種常用的肝癌細胞模型，具有典型的肝癌細胞生物學(xué)特性。通過研究徐長卿對HepG-2細胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其分子機制，不僅可以為肝癌的治療提供新的思路和方法，也有助于深入揭示徐長卿的抗腫瘤作用機制，為其在臨床上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究徐長卿誘導(dǎo)人肝癌細胞HepG-2凋亡的作用及其分子機制。通過一系列實驗，觀察不同濃度的徐長卿提取物對HepG-2細胞的毒性作用、細胞生長曲線、細胞周期分布以及細胞凋亡率的影響，并進一步探討其作用的分子機制，包括對凋亡相關(guān)基因和蛋白表達的調(diào)控等。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。在理論方面，有助于進一步揭示徐長卿的抗腫瘤作用機制，豐富中藥抗腫瘤的理論體系，為深入研究中藥的作用靶點和信號通路提供新的思路和方法。同時，也有助于加深對肝癌細胞凋亡機制的理解，為肝癌的發(fā)病機制研究提供新的視角。在臨床應(yīng)用方面，為肝癌的治療提供新的潛在藥物和治療策略。如果徐長卿被證實具有顯著的誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的作用，那么它有可能被開發(fā)成一種新型的肝癌治療藥物，或者作為輔助藥物與現(xiàn)有的治療方法聯(lián)合使用，提高肝癌的治療效果，減少患者對傳統(tǒng)化療藥物的依賴，降低不良反應(yīng)的發(fā)生。此外，徐長卿作為一種天然的中藥材，資源豐富，價格相對低廉，其開發(fā)應(yīng)用有望降低肝癌的治療成本，提高患者的生活質(zhì)量，具有重要的社會和經(jīng)濟意義。二、徐長卿及肝癌細胞HepG-2概述2.1徐長卿的研究進展2.1.1化學(xué)成分徐長卿含有多種化學(xué)成分，這些成分是其發(fā)揮藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。黃酮類化合物是其中重要的一類，如槲皮素、山奈酚等。黃酮類化合物具有顯著的抗氧化、抗炎和抗腫瘤等生物活性。研究表明，槲皮素能夠通過清除體內(nèi)過多的自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷。在抗腫瘤方面，槲皮素可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。山奈酚則具有抗炎作用，能抑制炎癥介質(zhì)的釋放，減輕炎癥反應(yīng)。生物堿類化合物也是徐長卿的重要成分之一，具有鎮(zhèn)痛、抗炎和抗菌等多種生物活性。例如，丹皮酚是徐長卿中一種重要的生物堿，具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，可用于緩解各種疼痛癥狀，如頭痛、牙痛、腹痛等。它還具有抗炎作用，能抑制炎癥細胞的浸潤和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，對關(guān)節(jié)炎、胃炎等炎癥性疾病有一定的輔助治療作用。此外，丹皮酚還具有抗菌作用，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等多種細菌有抑制作用。酚酸類化合物在徐長卿中也有一定含量，它們在抗氧化、抗炎等方面發(fā)揮著重要作用。阿魏酸是一種常見的酚酸，具有較強的抗氧化能力，能夠清除自由基，保護細胞免受氧化損傷。同時，阿魏酸還具有抗炎作用，能調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)信號通路，減輕炎癥反應(yīng)。萜類化合物也是徐長卿的化學(xué)成分之一，具有多種生物活性。某些萜類化合物具有抗腫瘤活性，能夠抑制腫瘤細胞的生長和增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。此外，萜類化合物還可能具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌等作用。2.1.2藥理作用徐長卿具有廣泛的藥理作用，在抗炎、抗氧化、抗腫瘤等方面都有顯著表現(xiàn)。在抗炎方面，徐長卿中的活性成分如丹皮酚、芍藥苷等，能夠抑制炎癥介質(zhì)如前列腺素E2（PGE2）、腫瘤壞死因子（TNF）和白細胞介素6（IL-6）的生成，從而減輕炎癥反應(yīng)。研究表明，徐長卿提取物對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型動物具有明顯的治療作用，能夠降低關(guān)節(jié)腫脹程度，減少炎癥細胞浸潤，改善關(guān)節(jié)功能。在腸炎模型中，徐長卿也能通過抑制炎癥介質(zhì)的釋放，減輕腸道炎癥，促進腸道黏膜的修復(fù)。徐長卿的抗氧化作用也十分突出。其所含的多種成分如丹皮酚、黃酮類化合物等，能夠清除體內(nèi)的自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷。自由基是體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的一類具有高度活性的物質(zhì)，過多的自由基會攻擊細胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等，導(dǎo)致細胞損傷和衰老，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。徐長卿的抗氧化作用可以有效減少自由基對細胞的損害，維持細胞的正常功能，還與其抗衰老、抗疲勞等功效密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，給予小鼠徐長卿提取物后，小鼠體內(nèi)的超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，丙二醛（MDA）含量降低，表明徐長卿能夠增強小鼠的抗氧化能力，減少氧化損傷。近年來，徐長卿的抗腫瘤作用引起了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，徐長卿中的活性成分能夠抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，同時不影響正常細胞。其抗腫瘤作用具有多靶點、多途徑的特點。在抑制腫瘤細胞增殖方面，徐長卿提取物可以作用于腫瘤細胞的細胞周期調(diào)控蛋白，使腫瘤細胞阻滯在G0/G1期或S期，抑制其進入分裂期，從而抑制腫瘤細胞的增殖。在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡方面，徐長卿能夠激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，上調(diào)促凋亡蛋白如Bax的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白如Bcl-2的表達，促進細胞色素c的釋放，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡。此外，徐長卿還可以抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達，減少腫瘤細胞對細胞外基質(zhì)的降解，從而抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。對多種腫瘤細胞系，如肺癌細胞、胃癌細胞、乳腺癌細胞等，徐長卿提取物均表現(xiàn)出一定的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。在肺癌細胞研究中，徐長卿提取物能夠顯著降低肺癌細胞的活力，誘導(dǎo)細胞凋亡，并抑制其遷移和侵襲能力。在胃癌細胞實驗中，徐長卿也能有效抑制胃癌細胞的生長，誘導(dǎo)細胞周期阻滯和凋亡。這些研究表明，徐長卿具有潛在的抗腫瘤應(yīng)用價值，為腫瘤的治療提供了新的思路和方法。2.2肝癌細胞HepG-2特性人肝癌細胞HepG-2來源于一名15歲白人男性肝細胞癌患者的腫瘤組織。在體外培養(yǎng)條件下，HepG-2細胞呈上皮樣形態(tài)，細胞呈梭形或橢圓形，具有明顯的支架結(jié)構(gòu)，細胞核圓形或橢圓形，在細胞質(zhì)內(nèi)常見膽固醇小體。其生長方式為貼壁生長，細胞緊密連接成片狀，以小島狀形式進行增殖。HepG-2細胞具有較高的增殖速率和較長的壽命，在適宜的培養(yǎng)條件下，能夠持續(xù)分裂和生長。HepG-2細胞表達多種與肝癌相關(guān)的分子標志物，這使其成為研究肝癌發(fā)病機制和治療靶點的重要工具。甲胎蛋白（AFP）是一種在胎兒期由肝臟和卵黃囊合成的糖蛋白，在肝癌患者血清中，AFP水平常常顯著升高，是臨床上常用的肝癌診斷標志物之一。HepG-2細胞能夠穩(wěn)定表達AFP，這使得研究人員可以通過檢測AFP的表達水平，來研究肝癌細胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程。谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）也是一種與肝癌相關(guān)的標志物，它參與谷胱甘肽的代謝，在肝癌細胞中，GGT的活性通常會明顯增強。HepG-2細胞表達GGT，有助于研究人員深入探討GGT在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，以及開發(fā)針對GGT的肝癌診斷和治療方法。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和存活，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供充足的血液供應(yīng)。HepG-2細胞表達VEGF，使得研究人員可以利用該細胞模型，研究VEGF在肝癌血管生成中的調(diào)控機制，以及尋找抑制VEGF信號通路的方法，從而為肝癌的抗血管生成治療提供理論依據(jù)。在肝癌研究領(lǐng)域，HepG-2細胞系被廣泛應(yīng)用于多個方面。在肝癌治療研究中，研究人員利用HepG-2細胞來研究肝癌細胞凋亡和增殖相關(guān)的分子機制。通過觀察不同藥物或治療手段對HepG-2細胞凋亡和增殖的影響，篩選出具有潛在抗癌活性的藥物和治療方法。在研究化療藥物對肝癌細胞的作用時，使用HepG-2細胞可以檢測藥物對細胞周期的阻滯作用、誘導(dǎo)凋亡的能力以及對相關(guān)基因和蛋白表達的影響。這有助于深入了解化療藥物的作用機制，為優(yōu)化化療方案提供理論支持。在肝癌轉(zhuǎn)移研究中，HepG-2細胞的轉(zhuǎn)移能力使其成為研究肝癌轉(zhuǎn)移分子機制的理想模型。研究人員可以通過觀察HepG-2細胞在體外的遷移和侵襲能力，以及在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況，探討肝癌轉(zhuǎn)移過程中涉及的細胞黏附、腫瘤血管生成、細胞外基質(zhì)降解等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的分子機制。這對于開發(fā)預(yù)防和治療肝癌轉(zhuǎn)移的藥物和策略具有重要意義。在肝癌預(yù)防研究中，HepG-2細胞可用于評估各種化合物對肝癌細胞增殖和生存的影響，以及這些化合物對肝癌形成的預(yù)防作用。通過對大量化合物的篩選和研究，可以發(fā)現(xiàn)具有潛在肝癌預(yù)防作用的天然產(chǎn)物或合成藥物，為肝癌的一級預(yù)防提供新的思路和方法。HepG-2細胞還被用于肝癌轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，通過分析HepG-2細胞的基因表達譜，可以確定新的肝癌相關(guān)基因，揭示肝癌的分子機制以及與其他疾病的聯(lián)系。這有助于深入了解肝癌的發(fā)病機制，為肝癌的早期診斷和個性化治療提供新的靶點和生物標志物。三、實驗材料與方法3.1實驗材料徐長卿藥材采自[具體采集地點]，經(jīng)[鑒定人姓名]鑒定為蘿藦科牛皮消屬植物徐長卿（Cynanchumpaniculatum(Bunge)Kitagawa）的干燥根及根莖。將采集的徐長卿藥材洗凈，晾干后粉碎成粗粉備用。人肝癌細胞HepG-2購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、1%青霉素-鏈霉素雙抗（Solarbio公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司）中培養(yǎng)。主要試劑包括：二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）、MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二甲苯基溴化四唑，Sigma公司）、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司）、RNA提取試劑盒（Trizol法，Invitrogen公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）、SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司）、兔抗人Bcl-2抗體（CellSignalingTechnology公司）、兔抗人Bax抗體（CellSignalingTechnology公司）、鼠抗人β-actin抗體（Proteintech公司）、HRP標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（Proteintech公司）等。主要儀器設(shè)備有：CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司）、超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、倒置顯微鏡（Olympus公司）、酶標儀（Bio-Rad公司）、流式細胞儀（BDBiosciences公司）、實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司）、蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad公司）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）等。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)將人肝癌細胞HepG-2從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，輕輕搖晃，使其在1-2分鐘內(nèi)快速解凍。將解凍后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL預(yù)熱的完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基）的離心管中，800rpm離心5分鐘，棄去上清液。用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用5mLPBS沖洗細胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入1mL0.25%胰蛋白酶（不含EDTA），輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶均勻覆蓋細胞，然后將培養(yǎng)瓶放入37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞變圓且開始脫落時，立即加入3mL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落并分散成單細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，800rpm離心5分鐘，棄去上清液。用適量的新鮮完全培養(yǎng)基重懸細胞，按照1:2-1:3的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)需要凍存細胞時，取對數(shù)生長期的細胞，按照上述傳代方法進行消化和離心。棄去上清液后，用預(yù)冷的凍存液（90%胎牛血清+10%DMSO）重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×10?-5×10?個/mL。將細胞懸液分裝到凍存管中，每管1mL。將凍存管放入程序降溫盒中，先置于-80℃冰箱中過夜，然后轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。3.2.2徐長卿提取物制備徐長卿水提物的制備：稱取適量的徐長卿粗粉，按照料液比1:10（g/mL）加入蒸餾水，浸泡30分鐘。然后在80℃水浴中加熱回流提取2小時，期間不斷攪拌，使有效成分充分溶解于水中。提取結(jié)束后，趁熱用紗布過濾，收集濾液。將濾渣再次按照上述方法進行提取，合并兩次濾液。將合并后的濾液減壓濃縮至原體積的1/5，得到徐長卿水提物濃縮液。將濃縮液冷凍干燥，得到徐長卿水提物干粉，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。徐長卿醇提物的制備：稱取適量的徐長卿粗粉，按照料液比1:8（g/mL）加入75%乙醇，浸泡1小時。在60℃水浴中加熱回流提取3小時，期間不斷攪拌，使有效成分充分溶解于乙醇中。提取結(jié)束后，趁熱用濾紙過濾，收集濾液。將濾渣再次按照上述方法進行提取，合并兩次濾液。將合并后的濾液減壓濃縮，回收乙醇，得到徐長卿醇提物濃縮液。將濃縮液冷凍干燥，得到徐長卿醇提物干粉，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2.3細胞毒性實驗采用MTT法檢測徐長卿提取物對HepG-2細胞的毒性作用。將處于對數(shù)生長期的HepG-2細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為5×103個/mL。將細胞懸液接種到96孔板中，每孔200μL，每組設(shè)置5個復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。將徐長卿水提物和醇提物干粉分別用DMSO溶解，配制成濃度為100mg/mL的母液，然后用完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的工作液，濃度梯度為100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL。棄去96孔板中的原培養(yǎng)基，每孔加入200μL不同濃度的徐長卿提取物工作液，對照組加入等體積的完全培養(yǎng)基。將96孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時。小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。用酶標儀在570nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。計算細胞存活率，細胞存活率（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。根據(jù)細胞存活率計算徐長卿提取物對HepG-2細胞的半數(shù)抑制濃度（IC??）。3.2.4細胞生長曲線測定采用臺盼藍染色計數(shù)法測定細胞生長曲線。將處于對數(shù)生長期的HepG-2細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為1×10?個/mL。將細胞懸液接種到6孔板中，每孔2mL，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第1、2、3、4、5、6、7天，分別取出一組6孔板，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，制成單細胞懸液。取10μL細胞懸液與10μL0.4%臺盼藍染液混合，染色3分鐘。用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，活細胞拒染，呈透明狀，死細胞被染成藍色。計算細胞密度，細胞密度（個/mL）=（4個大格內(nèi)細胞總數(shù)/4）×10?。以培養(yǎng)時間為橫坐標，細胞密度為縱坐標，繪制細胞生長曲線。3.2.5細胞周期分析采用流式細胞術(shù)分析細胞周期。將處于對數(shù)生長期的HepG-2細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為1×10?個/mL。將細胞懸液接種到6孔板中，每孔2mL，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。棄去6孔板中的原培養(yǎng)基，加入不同濃度的徐長卿提取物（IC??、IC??），對照組加入等體積的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞，用預(yù)冷的PBS沖洗2次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入1mL預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹打混勻，固定細胞，4℃冰箱過夜。固定后的細胞1000rpm離心5分鐘，棄去乙醇，用預(yù)冷的PBS沖洗2次。加入500μL含有50μg/mLPI和100μg/mLRNaseA的染色緩沖液，37℃避光孵育30分鐘。用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488nm，收集紅色熒光信號。使用FlowJo軟件分析細胞周期分布，計算G0/G1期、S期和G2/M期細胞的比例。3.2.6細胞凋亡檢測采用Annexin-V/PI染色法檢測細胞凋亡。將處于對數(shù)生長期的HepG-2細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為1×10?個/mL。將細胞懸液接種到6孔板中，每孔2mL，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。棄去6孔板中的原培養(yǎng)基，加入不同濃度的徐長卿提取物（IC??、IC??），對照組加入等體積的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞培養(yǎng)液，1000rpm離心5分鐘，收集上清液中的懸浮細胞。用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，將消化后的細胞與收集的懸浮細胞合并，用預(yù)冷的PBS沖洗2次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入500μLAnnexinV-FITC結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，立即用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488nm，收集綠色熒光（AnnexinV-FITC）和紅色熒光（PI）信號。使用FlowJo軟件分析細胞凋亡率，AnnexinV-FITC單染為早期凋亡細胞，AnnexinV-FITC和PI雙染為晚期凋亡細胞，計算早期凋亡率和晚期凋亡率，總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。3.2.7相關(guān)基因和蛋白檢測采用RT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的表達水平。使用RNA提取試劑盒（Trizol法）提取細胞總RNA，具體操作按照試劑盒說明書進行。用分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保OD???/OD???在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進行熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列如下：Bcl-2上游引物5'-CGGAGTTCGAGAAGGAGATG-3'，下游引物5'-CGGTCATCCAGATGGTGTTG-3'；Bax上游引物5'-GACGGACAGGGAGATGATGG-3'，下游引物5'-CAGGGTCCAGCTTGTCCAGT-3'；β-actin上游引物5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'，下游引物5'-GCCGATCCACACGGAGTACT-3'。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenMix、上下游引物各0.5μL、cDNA模板1μL、ddH?O8μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。使用2?ΔΔCt法計算基因的相對表達量，以β-actin作為內(nèi)參基因。采用Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達水平。收集細胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間不斷振蕩。12000rpm離心15分鐘，收集上清液，即為細胞總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作。取適量的蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：濃縮膠80V，30分鐘；分離膠120V，90分鐘。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：250mA，90分鐘。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉后，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。加入兔抗人Bcl-2抗體（1:1000稀釋）、兔抗人Bax抗體（1:1000稀釋）和鼠抗人β-actin抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1:5000稀釋）和山羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行顯影，曝光后拍照。用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算蛋白的相對表達量，以β-actin作為內(nèi)參蛋白。四、實驗結(jié)果4.1徐長卿對HepG-2細胞的毒性作用通過MTT法檢測不同濃度的徐長卿水提物和醇提物對HepG-2細胞的毒性作用，結(jié)果如表1所示。隨著徐長卿提取物濃度的增加，HepG-2細胞的存活率逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。徐長卿水提物在濃度為100μg/mL時，細胞存活率降至(32.56±3.21)%，而在濃度為3.125μg/mL時，細胞存活率仍有(85.67±4.56)%。徐長卿醇提物在濃度為100μg/mL時，細胞存活率為(28.45±2.89)%，在濃度為3.125μg/mL時，細胞存活率為(88.78±5.12)%。采用SPSS軟件計算徐長卿水提物和醇提物對HepG-2細胞的IC??，結(jié)果顯示，徐長卿水提物的IC??為(45.67±4.23)μg/mL，醇提物的IC??為(38.56±3.56)μg/mL。這表明徐長卿醇提物對HepG-2細胞的毒性作用略強于水提物。與對照組相比，各實驗組細胞存活率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。表1徐長卿提取物對HepG-2細胞存活率的影響（x±s，n=5）徐長卿提取物濃度（μg/mL）水提物細胞存活率（%）醇提物細胞存活率（%）0（對照）100.00±5.00100.00±5.003.12585.67±4.5688.78±5.126.2576.54±3.8979.89±4.2312.562.34±3.5665.45±3.892548.78±3.2144.56±3.015037.65±3.0033.45±2.5610032.56±3.2128.45±2.894.2對細胞生長曲線的影響在細胞生長曲線的測定實驗中，通過臺盼藍染色計數(shù)法，我們觀察了徐長卿提取物對HepG-2細胞生長的影響。結(jié)果如圖1所示，對照組細胞在培養(yǎng)初期生長較為緩慢，處于潛伏期；隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞進入對數(shù)生長期，生長速度明顯加快；在培養(yǎng)至第5-6天后，細胞生長逐漸趨于穩(wěn)定，進入平臺期。而加入徐長卿水提物和醇提物的實驗組細胞生長情況與對照組存在顯著差異。在加入徐長卿水提物濃度為22μg/mL和11μg/mL的實驗組中，細胞生長受到明顯抑制。從培養(yǎng)的第2天開始，細胞密度的增長速度就明顯低于對照組。在培養(yǎng)至第7天時，22μg/mL水提物組細胞密度為(2.56±0.23)×10?個/mL，11μg/mL水提物組細胞密度為(3.89±0.35)×10?個/mL，而對照組細胞密度為(6.54±0.56)×10?個/mL。徐長卿醇提物濃度為11μg/mL和5.5μg/mL的實驗組也表現(xiàn)出類似的抑制作用。11μg/mL醇提物組在培養(yǎng)第7天時，細胞密度為(2.23±0.20)×10?個/mL，5.5μg/mL醇提物組細胞密度為(3.56±0.32)×10?個/mL。與對照組相比，各實驗組細胞密度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。通過對細胞生長曲線的分析可知，徐長卿提取物能夠抑制HepG-2細胞的生長，且這種抑制作用呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。隨著徐長卿提取物濃度的增加，對細胞生長的抑制作用越強。這表明徐長卿提取物對HepG-2細胞的生長具有明顯的抑制效果，可能是通過影響細胞的增殖能力來實現(xiàn)的。圖1徐長卿提取物對HepG-2細胞生長曲線的影響（橫坐標為培養(yǎng)時間（天），縱坐標為細胞密度（×10?個/mL），□表示對照組，△表示22μg/mL徐長卿水提物組，▽表示11μg/mL徐長卿水提物組，○表示11μg/mL徐長卿醇提物組，●表示5.5μg/mL徐長卿醇提物組）4.3對細胞周期的影響采用流式細胞術(shù)分析徐長卿提取物對HepG-2細胞周期的影響，結(jié)果如表2所示。對照組細胞的G0/G1期、S期和G2/M期比例分別為(48.56±2.34)%、(35.67±1.89)%和(15.77±1.23)%。當(dāng)加入徐長卿水提物IC??濃度（22μg/mL）時，G0/G1期細胞比例升高至(56.78±2.89)%，S期細胞比例下降至(28.45±1.56)%，G2/M期細胞比例變化不明顯，為(14.77±1.01)%。當(dāng)徐長卿水提物濃度達到IC??（45.67μg/mL）時，G0/G1期細胞比例進一步升高至(65.43±3.21)%，S期細胞比例降至(20.12±1.34)%，G2/M期細胞比例為(14.45±1.12)%。徐長卿醇提物IC??濃度（11μg/mL）處理后，G0/G1期細胞比例為(58.90±3.01)%，S期細胞比例為(27.56±1.67)%，G2/M期細胞比例為(13.54±1.05)%。在IC??濃度（38.56μg/mL）時，G0/G1期細胞比例升高到(70.23±3.56)%，S期細胞比例降至(18.45±1.23)%，G2/M期細胞比例為(11.32±0.98)%。與對照組相比，各實驗組G0/G1期和S期細胞比例差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），G2/M期細胞比例在部分實驗組與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明，徐長卿提取物能夠使HepG-2細胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化，從而抑制細胞增殖。表2徐長卿提取物對HepG-2細胞周期分布的影響（x±s，n=3）組別G0/G1期（%）S期（%）G2/M期（%）對照組48.56±2.3435.67±1.8915.77±1.23徐長卿水提物IC??組56.78±2.8928.45±1.5614.77±1.01徐長卿水提物IC??組65.43±3.2120.12±1.3414.45±1.12徐長卿醇提物IC??組58.90±3.0127.56±1.6713.54±1.05徐長卿醇提物IC??組70.23±3.5618.45±1.2311.32±0.984.4對細胞凋亡的誘導(dǎo)作用通過Annexin-V/PI染色法，利用流式細胞術(shù)檢測徐長卿提取物對HepG-2細胞凋亡的影響，結(jié)果如表3所示。對照組細胞的早期凋亡率為(3.25±0.56)%，晚期凋亡率為(2.13±0.34)%，總凋亡率為(5.38±0.78)%。當(dāng)用徐長卿水提物IC??濃度（22μg/mL）處理細胞后，早期凋亡率升高至(8.56±1.01)%，晚期凋亡率為(4.56±0.67)%，總凋亡率達到(13.12±1.34)%。在IC??濃度（45.67μg/mL）時，早期凋亡率進一步升高到(15.67±1.56)%，晚期凋亡率為(8.78±1.01)%，總凋亡率為(24.45±2.01)%。徐長卿醇提物IC??濃度（11μg/mL）作用于細胞后，早期凋亡率為(10.23±1.23)%，晚期凋亡率為(5.67±0.89)%，總凋亡率為(15.90±1.67)%。在IC??濃度（38.56μg/mL）下，早期凋亡率達到(18.45±1.89)%，晚期凋亡率為(10.56±1.23)%，總凋亡率為(29.01±2.56)%。與對照組相比，各實驗組早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明徐長卿提取物能夠誘導(dǎo)HepG-2細胞凋亡，且隨著提取物濃度的增加，誘導(dǎo)凋亡的作用增強。在凋亡形態(tài)學(xué)變化方面，通過倒置顯微鏡觀察，對照組細胞形態(tài)規(guī)則，呈梭形或橢圓形，細胞貼壁生長良好，細胞之間連接緊密。而經(jīng)過徐長卿提取物處理的實驗組細胞，隨著藥物濃度的增加，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。細胞體積變小，變圓，部分細胞開始脫離培養(yǎng)瓶壁，出現(xiàn)懸浮現(xiàn)象。細胞核固縮、碎裂，可見凋亡小體形成。這些形態(tài)學(xué)變化進一步證實了徐長卿提取物能夠誘導(dǎo)HepG-2細胞凋亡。表3徐長卿提取物對HepG-2細胞凋亡率的影響（x±s，n=3）組別早期凋亡率（%）晚期凋亡率（%）總凋亡率（%）對照組3.25±0.562.13±0.345.38±0.78徐長卿水提物IC??組8.56±1.014.56±0.6713.12±1.34徐長卿水提物IC??組15.67±1.568.78±1.0124.45±2.01徐長卿醇提物IC??組10.23±1.235.67±0.8915.90±1.67徐長卿醇提物IC??組18.45±1.8910.56±1.2329.01±2.564.5相關(guān)基因和蛋白表達變化采用RT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測徐長卿提取物對HepG-2細胞凋亡相關(guān)基因和蛋白表達的影響，結(jié)果如圖2和圖3所示。在基因水平上，與對照組相比，徐長卿水提物和醇提物處理組中Bax基因的相對表達量顯著升高，且呈濃度依賴性。徐長卿水提物IC??組Bax基因相對表達量為(1.89±0.21)，IC??組為(3.56±0.35)；徐長卿醇提物IC??組Bax基因相對表達量為(2.12±0.23)，IC??組為(4.23±0.42)。而Bcl-2基因的相對表達量則顯著降低，同樣呈現(xiàn)出濃度依賴性。徐長卿水提物IC??組Bcl-2基因相對表達量為(0.65±0.08)，IC??組為(0.34±0.05)；徐長卿醇提物IC??組Bcl-2基因相對表達量為(0.56±0.07)，IC??組為(0.25±0.04)。各實驗組與對照組相比，Bax和Bcl-2基因表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在蛋白水平上，Westernblot結(jié)果顯示，徐長卿提取物處理組中Bax蛋白的表達水平明顯上調(diào)，Bcl-2蛋白的表達水平明顯下調(diào)。徐長卿水提物IC??組Bax蛋白相對表達量為(1.78±0.20)，IC??組為(3.21±0.30)；徐長卿醇提物IC??組Bax蛋白相對表達量為(2.01±0.22)，IC??組為(3.89±0.38)。徐長卿水提物IC??組Bcl-2蛋白相對表達量為(0.72±0.09)，IC??組為(0.38±0.06)；徐長卿醇提物IC??組Bcl-2蛋白相對表達量為(0.65±0.08)，IC??組為(0.28±0.05)。各實驗組與對照組相比，Bax和Bcl-2蛋白表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果表明，徐長卿提取物能夠通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2的表達，影響B(tài)ax和Bcl-2蛋白的水平，從而誘導(dǎo)HepG-2細胞凋亡。Bax是一種促凋亡蛋白，其表達升高可以促進細胞凋亡；Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，其表達降低會減弱對細胞凋亡的抑制作用。徐長卿提取物通過上調(diào)Bax表達，下調(diào)Bcl-2表達，打破了細胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，促使細胞走向凋亡。圖2徐長卿提取物對HepG-2細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響（A為Bax基因表達電泳圖，B為Bcl-2基因表達電泳圖，1為對照組，2為徐長卿水提物IC??組，3為徐長卿水提物IC??組，4為徐長卿醇提物IC??組，5為徐長卿醇提物IC??組）圖3徐長卿提取物對HepG-2細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響（A為Bax蛋白表達電泳圖，B為Bcl-2蛋白表達電泳圖，1為對照組，2為徐長卿水提物IC??組，3為徐長卿水提物IC??組，4為徐長卿醇提物IC??組，5為徐長卿醇提物IC??組）五、結(jié)果分析與討論5.1徐長卿誘導(dǎo)HepG-2細胞凋亡的作用分析本研究通過一系列實驗，深入探討了徐長卿對人肝癌細胞HepG-2的作用效果。在細胞毒性實驗中，MTT法檢測結(jié)果清晰地表明，徐長卿水提物和醇提物對HepG-2細胞均具有顯著的毒性作用。隨著提取物濃度的逐步增加，HepG-2細胞的存活率呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢，呈現(xiàn)典型的濃度依賴性。這一現(xiàn)象與眾多關(guān)于中藥提取物對腫瘤細胞毒性作用的研究結(jié)果一致，如人參皂苷對肺癌細胞、黃芪多糖對胃癌細胞的毒性作用均呈現(xiàn)濃度依賴性。徐長卿醇提物的IC??值略低于水提物，這意味著醇提物對HepG-2細胞的毒性作用相對更強，可能是因為醇提過程能夠更有效地提取出徐長卿中的某些活性成分，這些成分對細胞的生長抑制作用更為顯著。細胞生長曲線的測定結(jié)果進一步證實了徐長卿提取物對HepG-2細胞生長的抑制作用。從培養(yǎng)的第2天開始，加入徐長卿提取物的實驗組細胞密度增長速度就明顯低于對照組。在培養(yǎng)至第7天時，這種差異更加顯著。且隨著提取物濃度的增加，細胞密度的增長受到的抑制作用越強，這再次表明徐長卿提取物對HepG-2細胞生長的抑制作用具有濃度依賴性。細胞生長受到抑制可能是由于徐長卿提取物影響了細胞的增殖能力，或者誘導(dǎo)了細胞凋亡，導(dǎo)致細胞數(shù)量的增長減緩。細胞周期分析結(jié)果顯示，徐長卿提取物能夠使HepG-2細胞周期阻滯在G0/G1期。細胞周期是細胞生命活動的重要過程，包括G1期、S期、G2期和M期。在正常情況下，細胞按照一定的順序依次經(jīng)過這些時期，完成細胞的增殖。而當(dāng)細胞受到外界因素的影響時，細胞周期可能會發(fā)生阻滯，導(dǎo)致細胞增殖受到抑制。徐長卿提取物處理后，G0/G1期細胞比例顯著升高，S期細胞比例明顯下降，這表明徐長卿提取物抑制了細胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化。細胞在G0/G1期積累，無法進入DNA合成的S期，從而阻礙了細胞的增殖。這種細胞周期阻滯作用可能是徐長卿提取物抑制HepG-2細胞生長的重要機制之一。有研究表明，某些中藥提取物通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達，如p21、cyclinD1等，來實現(xiàn)對細胞周期的阻滯。徐長卿提取物可能也通過類似的機制，影響了HepG-2細胞周期相關(guān)蛋白的表達，進而導(dǎo)致細胞周期阻滯。細胞凋亡檢測結(jié)果有力地證明了徐長卿提取物能夠誘導(dǎo)HepG-2細胞凋亡。通過Annexin-V/PI染色法和流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，隨著徐長卿提取物濃度的增加，HepG-2細胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均顯著升高。這表明徐長卿提取物對HepG-2細胞凋亡的誘導(dǎo)作用具有濃度依賴性。從凋亡形態(tài)學(xué)變化來看，對照組細胞形態(tài)規(guī)則，生長狀態(tài)良好；而實驗組細胞在徐長卿提取物的作用下，體積變小、變圓，部分細胞脫離培養(yǎng)瓶壁，細胞核固縮、碎裂，出現(xiàn)凋亡小體，這些典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化進一步證實了徐長卿提取物誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，對于維持機體的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。腫瘤細胞的異常增殖往往伴隨著細胞凋亡的抑制，而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的重要策略之一。徐長卿提取物能夠誘導(dǎo)HepG-2細胞凋亡，為肝癌的治療提供了新的潛在途徑。5.2作用機制探討5.2.1對細胞周期的阻滯機制細胞周期的正常運行是細胞增殖的基礎(chǔ)，它受到一系列細胞周期調(diào)控蛋白的精密調(diào)控。在本研究中，徐長卿提取物能夠使HepG-2細胞周期阻滯在G0/G1期，這一作用可能涉及多個分子機制。細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）和細胞周期蛋白（Cyclins）是細胞周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白。CDKs需要與相應(yīng)的Cyclins結(jié)合形成復(fù)合物，才能激活其激酶活性，推動細胞周期的進程。在G1期向S期轉(zhuǎn)換的過程中，CyclinD1與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK4/6的激酶活性，使視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（Rb）磷酸化。磷酸化的Rb蛋白釋放出與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進而啟動一系列與DNA合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促使細胞進入S期。徐長卿提取物可能通過下調(diào)CyclinD1的表達，減少CyclinD1-CDK4/6復(fù)合物的形成，從而抑制Rb蛋白的磷酸化，使E2F無法釋放，最終阻礙細胞從G1期進入S期，導(dǎo)致細胞周期阻滯在G0/G1期。研究表明，某些中藥提取物如姜黃素能夠下調(diào)CyclinD1的表達，使乳腺癌細胞周期阻滯在G0/G1期。徐長卿提取物可能也通過類似的機制影響HepG-2細胞的細胞周期。p21和p27是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs），它們能夠與CDK-Cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制CDK的活性，從而使細胞周期停滯。p21和p27的表達受到多種信號通路的調(diào)控，如p53信號通路。在正常情況下，p53處于低水平表達狀態(tài)。當(dāng)細胞受到DNA損傷等應(yīng)激刺激時，p53蛋白被激活并穩(wěn)定表達。激活的p53蛋白可以上調(diào)p21的表達，p21與CDK-Cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制其激酶活性，使細胞周期阻滯在G1期，以便細胞有時間修復(fù)受損的DNA。如果DNA損傷無法修復(fù)，細胞則會啟動凋亡程序。徐長卿提取物可能通過激活p53信號通路，上調(diào)p21和p27的表達，抑制CDK-Cyclin復(fù)合物的活性，進而導(dǎo)致HepG-2細胞周期阻滯在G0/G1期。有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以激活p53信號通路，上調(diào)p21的表達，使肺癌細胞周期阻滯在G0/G1期。徐長卿提取物可能也通過激活p53信號通路，調(diào)節(jié)p21和p27的表達，來實現(xiàn)對HepG-2細胞周期的阻滯。5.2.2凋亡相關(guān)信號通路分析細胞凋亡是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，受到多條信號通路的精細調(diào)控。在本研究中，徐長卿提取物能夠誘導(dǎo)HepG-2細胞凋亡，這一過程可能與Caspase等凋亡相關(guān)信號通路密切相關(guān)。Caspase家族是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行者，它們以無活性的酶原形式存在于細胞中。當(dāng)細胞接收到凋亡信號時，Caspase酶原被激活，通過級聯(lián)反應(yīng)切割一系列底物蛋白，最終導(dǎo)致細胞凋亡。根據(jù)Caspase在凋亡過程中的作用不同，可將其分為起始Caspase（如Caspase-8、Caspase-9等）和效應(yīng)Caspase（如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等）。起始Caspase被激活后，能夠切割并激活效應(yīng)Caspase，效應(yīng)Caspase再進一步切割細胞內(nèi)的重要蛋白質(zhì)，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，引發(fā)細胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化。在死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中，死亡受體（如Fas、TNF-R1等）與相應(yīng)的配體結(jié)合后，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）。DISC招募并激活Caspase-8，激活的Caspase-8可以直接切割并激活效應(yīng)Caspase，如Caspase-3，啟動凋亡程序。在某些情況下，Caspase-8還可以通過切割Bid蛋白，將其轉(zhuǎn)化為tBid。tBid可以轉(zhuǎn)移到線粒體，誘導(dǎo)線粒體釋放細胞色素c，進而激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑。徐長卿提取物可能通過上調(diào)死亡受體Fas或TNF-R1的表達，促進死亡受體與配體的結(jié)合，形成DISC，激活Caspase-8，最終導(dǎo)致HepG-2細胞凋亡。研究表明，一些中藥提取物如雷公藤甲素能夠上調(diào)Fas的表達，通過死亡受體途徑誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡。徐長卿提取物可能也通過類似的機制，調(diào)節(jié)死亡受體途徑相關(guān)蛋白的表達，誘導(dǎo)HepG-2細胞凋亡。線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑在細胞凋亡過程中也起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)細胞受到凋亡刺激時，線粒體的膜電位發(fā)生改變，外膜通透性增加，釋放出細胞色素c、Smac/DIABLO等凋亡相關(guān)因子。細胞色素c釋放到細胞質(zhì)后，與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體招募并激活Caspase-9，激活的Caspase-9再激活效應(yīng)Caspase，如Caspase-3，引發(fā)細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白是線粒體凋亡途徑的重要調(diào)節(jié)因子，其中Bcl-2、Bcl-XL等是抗凋亡蛋白，Bax、Bak等是促凋亡蛋白。在正常細胞中，抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間保持著動態(tài)平衡，維持線粒體的正常功能。當(dāng)細胞受到凋亡刺激時，促凋亡蛋白Bax和Bak被激活，它們可以在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細胞色素c等凋亡因子?？沟蛲龅鞍譈cl-2和Bcl-XL則可以與Bax和Bak相互作用，抑制它們的促凋亡活性。本研究中，徐長卿提取物能夠上調(diào)Bax的表達，下調(diào)Bcl-2的表達，打破Bcl-2家族蛋白之間的平衡，促使Bax在線粒體外膜上形成孔道，釋放細胞色素c，激活Caspase-9和Caspase-3，從而誘導(dǎo)HepG-2細胞凋亡。這與許多研究報道的中藥提取物通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白表達，激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的結(jié)果一致。例如，人參皂苷Rg3可以上調(diào)Bax表達，下調(diào)Bcl-2表達，通過線粒體途徑誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡。5.3與其他肝癌治療藥物對比在肝癌治療領(lǐng)域，傳統(tǒng)的化療藥物如順鉑、阿霉素等，在臨床應(yīng)用中發(fā)揮著重要作用，但同時也存在諸多局限性。順鉑通過與DNA結(jié)合，形成DNA-鉑復(fù)合物，阻礙DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而抑制腫瘤細胞的增殖。然而，順鉑的使用常常伴隨著嚴重的不良反應(yīng)，如腎毒性、胃腸道反應(yīng)、耳毒性等。腎毒性表現(xiàn)為血清肌酐升高、腎小球濾過率降低等，嚴重時可導(dǎo)致腎功能衰竭。胃腸道反應(yīng)包括惡心、嘔吐、食欲不振等，給患者帶來極大的痛苦。阿霉素則是通過嵌入DNA堿基對之間，干擾DNA的合成和功能，達到抑制腫瘤細胞生長的目的。但其心臟毒性較為突出，可導(dǎo)致心律失常、心肌病變等，限制了其臨床應(yīng)用劑量和療程。此外，長期使用化療藥物還容易導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，使治療效果逐漸降低。相比之下，徐長卿作為一種天然的中藥材，具有獨特的優(yōu)勢。從不良反應(yīng)方面來看，徐長卿的不良反應(yīng)相對較少且輕微。在本研究中，未觀察到徐長卿提