納米siRNA制劑的免疫原性降低策略演講人CONTENTS納米siRNA制劑的免疫原性降低策略siRNA分子修飾：從源頭阻斷免疫識別遞送載體優(yōu)化：構(gòu)建“免疫惰性”納米屏障給藥途徑與靶向遞送：減少“非必要免疫暴露”聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)：多維度“協(xié)同減毒”挑戰(zhàn)與展望：邁向“臨床轉(zhuǎn)化”的最后一公里目錄01納米siRNA制劑的免疫原性降低策略納米siRNA制劑的免疫原性降低策略作為RNA干擾（RNAi）療法的核心工具，小干擾RNA（siRNA）通過特異性降解靶標mRNA，在腫瘤、遺傳性疾病、病毒感染等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大治療潛力。然而，siRNA制劑的臨床轉(zhuǎn)化長期面臨一個關(guān)鍵瓶頸——免疫原性。作為外源雙鏈RNA（dsRNA），siRNA易被模式識別受體（PRRs）如Toll樣受體3（TLR3）、TLR7/8、RIG-I樣受體（RLRs）等識別，觸發(fā)I型干擾素（IFN-α/β）、前炎性細胞因子（如IL-6、TNF-α）的級聯(lián)釋放，導致免疫相關(guān)不良反應(yīng)（如發(fā)熱、肝毒性、血小板減少），甚至掩蓋siRNA的基因沉默效應(yīng)。因此，通過多維度策略降低納米siRNA制劑的免疫原性，是提升其安全性、有效性及臨床可及性的核心任務(wù)。本文將從siRNA分子修飾、遞送載體優(yōu)化、給藥途徑調(diào)控及聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)四個維度，系統(tǒng)闡述當前納米siRNA制劑免疫原性降低的研究進展與作用機制，并結(jié)合臨床轉(zhuǎn)化挑戰(zhàn)展望未來方向。02siRNA分子修飾：從源頭阻斷免疫識別siRNA分子修飾：從源頭阻斷免疫識別siRNA自身的結(jié)構(gòu)特征（如未修飾的磷酸二酯骨架、特定序列基序）是觸發(fā)免疫反應(yīng)的根源。通過化學修飾改變siRNA的分子結(jié)構(gòu)，可阻斷其與PRRs的結(jié)合，或破壞免疫識別所需的構(gòu)象，從而從源頭降低免疫原性。1核糖修飾：破壞免疫識別的“關(guān)鍵接觸點”核糖2'位是siRNA與PRRs（如TLR7/8）結(jié)合的關(guān)鍵作用位點。通過對核糖2'位進行修飾，可改變siRNA的空間構(gòu)象，阻止其與PRRs的免疫識別結(jié)構(gòu)域結(jié)合。-2'-O-甲基（2'-OMe）修飾：2'-OMe修飾是最早應(yīng)用于siRNA免疫原性調(diào)控的化學修飾之一。其通過在核糖2'位引入甲基基團，stericallyhinderTLR7/8與siRNA的GU-rich基序結(jié)合。研究表明，全鏈2'-OMe修飾可使siRNA對TLR7/8的激活能力降低100倍以上，且不影響RISC介導的基因沉默效率。例如，在治療原發(fā)性輕鏈淀粉樣變性的siRNA藥物Patisiran（Onpattro）中，siRNA的正義鏈與反義鏈均采用2'-OMe修飾，顯著降低了LNP遞送系統(tǒng)引起的IFN-α釋放。1核糖修飾：破壞免疫識別的“關(guān)鍵接觸點”-2'-氟（2'-F）修飾：2'-F修飾通過電負性氟原子替代2'-羥基，增強siRNA與Ago2蛋白的結(jié)合穩(wěn)定性，同時破壞TLR7/8的識別。與2'-OMe修飾相比，2'-F修飾對RISC裝載的促進作用更顯著，且可部分抵抗核酸酶降解。例如，Inclisiran（Leqvio）中siRNA的反義鏈采用2'-F修飾，結(jié)合GalNAc靶向遞送，使得皮下給藥后免疫原性極低，患者耐受性良好。-2'-甲氧基乙基（2'-MOE）與鎖定核酸（LNA）修飾：2'-MOE修飾通過引入乙氧基側(cè)鏈，增強siRNA的血清穩(wěn)定性，同時阻斷TLR識別；LNA修飾通過“鎖定”核糖構(gòu)象，顯著提高結(jié)合親和力，但需謹慎修飾位置（通常僅在兩端修飾），避免過度抑制RISC活性。2堿基修飾：規(guī)避“免疫激活基序”siRNA序列中的特定基序（如GU-rich、UGUGU）是PRRs識別的核心。通過堿基修飾改變這些基序，可降低免疫激活風險。-假尿嘧啶（ψ）修飾：ψ修飾將尿嘧啶的尿嘧啶堿基異構(gòu)化為假尿嘧啶，破壞GU基序的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，阻斷TLR7/8識別。研究表明，將siRNA中的尿嘧啶替換為ψ，可使其對TLR7的激活能力降低90%以上，且不影響基因沉默效果。例如，在抗HBVsiRNA研究中，全鏈ψ修飾的siRNA聯(lián)合LNP遞送，小鼠血清中IFN-α水平顯著低于未修飾組。-5-甲基胞嘧啶（5-mC）與5-溴尿嘧啶（5-BrU）修飾：5-mC修飾通過甲基化胞嘧啶，減少CpG基序?qū)LR9的激活（盡管TLR9主要識別DNA，但dsRNA可能間接激活先天免疫）；5-BrU修飾通過溴原子替代尿嘧啶5位位阻，干擾PRRs與堿基的接觸。3磷酸骨架修飾：增強穩(wěn)定性與隱蔽性未修飾的磷酸二酯骨架（PO）易被核酸酶降解，釋放的小片段RNA可能被PRRs識別。通過硫代磷酸酯（PS）修飾，可增強siRNA的血清穩(wěn)定性，減少降解產(chǎn)物引起的免疫反應(yīng)。-PS修飾：PS修飾將非橋接氧原子替換為硫原子，增強對核酸酶的抵抗能力，同時通過改變siRNA的構(gòu)象，減少與PRRs的結(jié)合。但PS修飾可能影響RISC裝載效率，因此通常僅在siRNA的末端1-3個核苷酸進行修飾，平衡穩(wěn)定性與活性。例如，在siRNA藥物Givosiran（Givlaari）中，PS修飾與2'-F修飾協(xié)同使用，顯著降低了免疫原性并延長了半衰期。3序列優(yōu)化：規(guī)避內(nèi)源免疫激活序列通過生物信息學工具篩選siRNA序列，避免與內(nèi)源免疫激活RNA（如miRNA、病毒RNA）的同源性，可降低“非特異性免疫激活”風險。例如，避免使用富含GU、UGU的序列，優(yōu)先選擇A/U含量較低的序列（<50%），可顯著降低TLR7/8的激活概率。03遞送載體優(yōu)化：構(gòu)建“免疫惰性”納米屏障遞送載體優(yōu)化：構(gòu)建“免疫惰性”納米屏障裸siRNA易被血漿中的核酸酶降解并被免疫細胞吞噬，而納米遞送載體通過包封siRNA，可形成物理屏障，減少其與PRRs的直接接觸，同時通過載體材料本身的免疫調(diào)節(jié)特性，進一步降低免疫原性。1脂質(zhì)納米粒（LNP）：調(diào)控“兩親性”與“電負性”LNP是目前siRNA藥物最常用的遞送系統(tǒng)（如Patisiran、Inclisiran、Vutrisiran），其免疫原性主要取決于脂質(zhì)組成與表面性質(zhì)。-可電離陽離子脂質(zhì)：可電離陽離子脂質(zhì)（如DLin-MC3-DMA、SM-102）在酸性條件下（如內(nèi)吞體）質(zhì)子化帶正電，促進siRNA從內(nèi)吞體逃逸，而在中性生理條件下呈電中性，減少與帶負電的細胞膜（如免疫細胞表面）的非特異性結(jié)合，降低巨噬細胞吞噬和TLR激活。例如，DLin-MC3-DMA組成的LNP在肝細胞中高效遞送siRNA，同時血漿中IFN-α水平顯著低于傳統(tǒng)陽離子脂質(zhì)（如DOTAP）。-輔助脂質(zhì)優(yōu)化：磷脂（如DSPC）、膽固醇與PEG化脂質(zhì)的比例影響LNP的穩(wěn)定性與免疫原性。膽固醇可增強LNP的膜流動性，促進內(nèi)吞體逃逸，減少溶酶體降解導致的免疫激活；PEG化脂質(zhì)可形成“親水冠層”，1脂質(zhì)納米粒（LNP）：調(diào)控“兩親性”與“電負性”減少血清蛋白吸附（opsonization），降低巨噬細胞吞噬。但長期或高劑量PEG可能誘導“抗PEG抗體”，導致加速血液清除（ABC現(xiàn)象），因此需優(yōu)化PEG分子量（通常為2000Da）與修飾密度。-表面電荷調(diào)控：LNP表面ζ電位接近中性（-10mV至+10mV）可減少對帶負電免疫細胞（如樹突狀細胞、巨噬細胞）的吸引，降低免疫激活。研究表明，ζ電位為-5mV的LNP遞送siRNA時，小鼠脾臟中TNF-α水平顯著低于ζ電位為+20mV的LNP。1脂質(zhì)納米粒（LNP）：調(diào)控“兩親性”與“電負性”2.2高分子聚合物載體：引入“免疫調(diào)節(jié)單元”高分子聚合物（如聚乙烯亞胺PEI、聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA、樹枝狀聚合物）可通過自身降解特性或修飾功能基團，調(diào)控免疫原性。-可降解陽離子聚合物：傳統(tǒng)陽離子聚合物（如PEI25k）因其高正電荷密度和不可降解性，易引發(fā)細胞毒性并激活NLRP3炎癥小體。而可降解陽離子聚合物（如β-氨基酯聚合物、聚β-氨基酯）在細胞內(nèi)可水解為小分子片段，降低長期滯留引起的免疫反應(yīng)。例如，聚β-氨基酯包封的siRNA在巨噬細胞中幾乎不誘導IL-6釋放，而PEI25k組IL-6水平升高10倍以上。-聚乙二醇化（PEGylation）與親水性修飾：通過在聚合物骨架上接枝PEG，可減少非特異性細胞攝取，降低免疫細胞識別。例如，PEG化PLGA納米粒遞送siRNA時，小鼠血清中IFN-α水平較未PEG化組降低70%。1脂質(zhì)納米粒（LNP）：調(diào)控“兩親性”與“電負性”-陰離子/兩性離子聚合物：陰離子聚合物（如聚丙烯酸）或兩性離子聚合物（如聚羧酸甜菜堿）因表面帶負電或電中性，可避免陽離子聚合物引起的細胞膜破壞和免疫激活。例如，聚羧酸甜菜堿修飾的siRNA納米粒在靜脈注射后，主要被肝細胞而非枯否細胞攝取，顯著降低了炎癥因子釋放。3無機納米材料：利用“低免疫原性”與“易修飾性”無機納米材料（如金納米粒、介孔二氧化硅、量子點）因其獨特的理化性質(zhì)，在siRNA遞送中展現(xiàn)出低免疫原性優(yōu)勢。-金納米粒（AuNPs）：AuNPs表面易修飾硫醇基團，可高效負載siRNA，且本身具有生物惰性，不易激活先天免疫。例如，AuNPs-siRNA復合物在治療肝癌時，小鼠肝臟中IFN-β水平顯著低于LNP-siRNA組，且基因沉默效率相當。-介孔二氧化硅納米粒（MSNs）：MSNs具有高比表面積和可調(diào)控孔徑，可負載大量siRNA，表面硅羥基易于修飾PEG或靶向分子，減少非特異性免疫識別。例如，PEG化MSNs遞送抗纖維化siRNA時，大鼠肺泡巨噬細胞中IL-1β表達水平較脂質(zhì)體組降低50%。4天然來源載體：仿生“免疫逃逸”策略利用細胞膜或外泌體等天然載體包裹siRNA，可“偽裝”siRNA，使其逃避免疫識別。-細胞膜包被納米粒：將紅細胞膜、血小板膜或癌細胞膜包裹在LNP核心表面，可賦予納米?！白陨怼碧匦裕瑴p少巨噬細胞吞噬。例如，紅細胞膜包被的LNP-siRNA在血液循環(huán)時間延長至48小時以上，而未包被組僅6小時，且小鼠血清中IFN-α水平顯著降低。-外泌體遞送：外泌體作為天然納米囊泡，可穿透生物屏障（如血腦屏障），且表面膜蛋白（如CD47）可發(fā)揮“別吃我”信號，抑制巨噬細胞吞噬。例如，間充質(zhì)干細胞來源外泌體負載siRNA治療阿爾茨海默病時，不僅實現(xiàn)了腦靶向遞送，還顯著降低了小膠質(zhì)細胞激活和IL-6釋放。04給藥途徑與靶向遞送：減少“非必要免疫暴露”給藥途徑與靶向遞送：減少“非必要免疫暴露”給藥途徑直接影響siRNA在體內(nèi)的分布與免疫細胞接觸概率，通過局部或靶向遞送，可減少siRNA在免疫器官（如脾臟、淋巴結(jié)）的滯留，降低全身免疫反應(yīng)。3.1局部給藥：繞過全身免疫系統(tǒng)-眼部給藥：眼睛作為免疫豁免器官，前房玻璃體注射或滴眼液遞送siRNA可直接作用于靶組織（如視網(wǎng)膜），避免全身暴露。例如，siRNA藥物QPI-1007（治療非動脈炎性前部缺血性視神經(jīng)病變）通過玻璃體注射給藥，患者血漿中未檢測到IFN-α升高，安全性良好。-呼吸道給藥：霧化吸入siRNA可靶向肺部（如治療COVID-19、肺纖維化），減少肝臟首過效應(yīng)和全身免疫激活。例如，LNP包封的抗SARS-CoV-2siRNA通過霧化給藥，小鼠肺組織中病毒載量降低100倍，而血清中炎癥因子水平與空白組無顯著差異。給藥途徑與靶向遞送：減少“非必要免疫暴露”-皮膚黏膜給藥：透皮或黏膜（如鼻黏膜、陰道黏膜）遞送siRNA可局部治療炎癥或感染，避免全身分布。例如，陽離子脂質(zhì)體-siRNA復合物通過鼻黏膜給藥治療過敏性鼻炎，直接作用于鼻黏膜免疫細胞，顯著降低IL-4、IL-5釋放，且未引發(fā)全身免疫反應(yīng)。2肝靶向遞送：利用“自然清除機制”減少免疫激活肝臟是siRNA體內(nèi)分布的主要器官（因LNP等載體易被肝細胞攝?。蝺?nèi)免疫細胞（如枯否細胞、肝竇內(nèi)皮細胞）可識別siRNA并引發(fā)炎癥。通過肝細胞特異性靶向，可減少與枯否細胞的接觸，降低免疫原性。-GalNAc-siRNA偶聯(lián)物：N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）作為去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）的配體，可介導肝細胞主動攝取，避免枯否細胞吞噬。Inclisiran通過GalNAc修飾，皮下注射后優(yōu)先被肝細胞攝取，血漿半衰期長達數(shù)天，且?guī)缀醪患せ頣LR7/8，患者耐受性極佳。-LDL受體靶向：低密度脂蛋白（LDL）受體在肝細胞高表達，通過LDL肽或抗體修飾納米粒，可實現(xiàn)肝細胞特異性遞送。例如，LDL肽修飾的LNP-siRNA在肝臟中積累量較未修飾組提高5倍，而枯否細胞攝取量降低70%，IFN-α釋放顯著減少。3免疫豁免器官靶向：降低“免疫識別風險”對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）、睪丸等免疫豁免器官，需突破生物屏障并避免激活局部免疫細胞。-血腦屏障（BBB）穿透：通過受體介導轉(zhuǎn)運（如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體修飾）、吸附介導轉(zhuǎn)運（陽離子納米粒）或臨時開放BBB（如聚焦超聲），可遞送siRNA至腦組織。例如，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體修飾的AuNPs-siRNA治療阿爾茨海默病時，腦內(nèi)siRNA濃度較非靶向組提高3倍，且小膠質(zhì)細胞活化程度顯著降低。-睪丸靶向：通過緊密連接調(diào)節(jié)劑（如EGF）或細胞穿透肽（如TAT）修飾，可促進siRNA穿越血睪屏障。例如，TAT修飾的PLGA納米粒遞送抗精子生成siRNA，睪丸組織中基因沉默效率達60%，而未修飾組僅10%，且未引發(fā)睪丸局部炎癥。05聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)：多維度“協(xié)同減毒”聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)：多維度“協(xié)同減毒”對于高免疫原性siRNA或復雜疾?。ㄈ缱陨砻庖卟。?，單一策略可能難以完全抑制免疫激活，需聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)劑，實現(xiàn)“協(xié)同減毒”。1小分子免疫抑制劑聯(lián)合使用-TLR信號通路抑制劑：如氯喹（TLR3/7/8抑制劑）、BAY11-7082（NF-κB抑制劑），可阻斷siRNA觸發(fā)的下游信號轉(zhuǎn)導。例如，LNP-siRNA聯(lián)合氯喹給藥，小鼠血清中IFN-α水平降低80%，且基因沉默效率不受影響。-糖皮質(zhì)激素：如地塞米松，可廣泛抑制炎癥因子釋放，與siRNA聯(lián)用可減輕急性免疫反應(yīng)。例如，在siRNA治療急性肝損傷模型中，地塞米松預給藥可顯著降低血清TNF-α、IL-6水平，提高小鼠生存率。2生物大分子調(diào)節(jié)劑協(xié)同遞送-可溶性誘受體（sdecoy）：如可溶性TLR4（sTLR4），可與siRNA競爭結(jié)合PRRs，阻斷免疫識別。例如，sTLR4與siRNA共包封于LNP中，小鼠脾臟中IFN-β表達降低90%，優(yōu)于單獨使用siRNA。-抗炎細胞因子：如IL-10、TGF-β，可通過調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）抑制過度炎癥反應(yīng)。例如，IL-10修飾的PLGA-siRNA納米粒治療炎癥性腸病時，結(jié)腸組織中IL-10水平升高，TNF-α降低，且免疫細胞浸潤顯著減少。3基因編輯工具聯(lián)合應(yīng)用利用CRISPR-Cas9或堿基編輯工具敲除免疫相關(guān)基因（如TLR3、TLR7、MAVS），可從基因?qū)用娼档图毎麑iRNA的免疫敏感性。例如，在TLR7敲除小鼠中，未修飾siRNA的免疫原性降低95%，且基因沉默效率與野生型小鼠相當，為“免疫豁免”個體化治療提供新思路。06挑戰(zhàn)與展望：邁向“臨床轉(zhuǎn)化”的最后一公里