(2025年)分子發(fā)光分析試題附答案一、選擇題（每題2分，共20分）1.下列關(guān)于分子熒光與磷光的描述中，錯誤的是（）A.熒光發(fā)射來自單重激發(fā)態(tài)（S?）的輻射躍遷B.磷光發(fā)射來自三重激發(fā)態(tài)（T?）的輻射躍遷C.磷光壽命通常比熒光壽命短D.室溫下多數(shù)物質(zhì)的磷光需要在剛性介質(zhì)（如低溫玻璃體）中觀測2.斯托克斯位移（Stokesshift）是指（）A.激發(fā)光譜與吸收光譜的波長差B.發(fā)射光譜與激發(fā)光譜的波長差C.發(fā)射光譜的最大波長與激發(fā)光譜最大波長的差值D.分子吸收光子能量與發(fā)射光子能量的差值3.某熒光物質(zhì)的量子產(chǎn)率（Φf）為0.3，其非輻射躍遷速率常數(shù)（k_nr）為7×10?s?1，輻射躍遷速率常數(shù)（k_r）約為（）A.3×10?s?1B.7×10?s?1C.1×10?s?1D.2×10?s?14.下列因素中，會導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低的是（）A.分子剛性增加（如形成螯合物）B.溶液溫度升高C.溶劑極性減小（對具有π-π躍遷的物質(zhì)）D.引入給電子取代基（如-OH、-NH?）5.化學(xué)發(fā)光分析中，魯米諾（Luminol）在堿性條件下與H?O?反應(yīng)發(fā)光，其發(fā)光機(jī)制屬于（）A.直接化學(xué)發(fā)光B.間接化學(xué)發(fā)光C.生物發(fā)光D.電致化學(xué)發(fā)光6.分子磷光分析中，采用液氮低溫（77K）的主要目的是（）A.增強(qiáng)分子熱運動B.抑制非輻射躍遷（如內(nèi)轉(zhuǎn)換、系間竄越）C.提高三重激發(fā)態(tài)的穩(wěn)定性D.降低溶劑的黏度7.某熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜存在重疊，為避免自吸收干擾，應(yīng)選擇的檢測方式是（）A.前向散射檢測B.直角檢測C.90°檢測D.后向散射檢測8.生物發(fā)光（如螢火蟲發(fā)光）的本質(zhì)是（）A.酶催化的化學(xué)發(fā)光B.熱致發(fā)光C.光致發(fā)光D.電致發(fā)光9.下列關(guān)于熒光淬滅的描述中，錯誤的是（）A.動態(tài)淬滅（碰撞淬滅）與淬滅劑濃度、溫度正相關(guān)B.靜態(tài)淬滅（形成復(fù)合物）與淬滅劑濃度、溫度負(fù)相關(guān)C.氧分子是常見的熒光淬滅劑，因其具有順磁性促進(jìn)系間竄越D.pH變化不會影響熒光淬滅，因分子結(jié)構(gòu)不受pH影響10.分子發(fā)光分析中，同步熒光光譜的優(yōu)勢是（）A.提高檢測靈敏度B.簡化光譜（減少譜帶重疊）C.增強(qiáng)發(fā)射強(qiáng)度D.延長發(fā)光壽命二、填空題（每空1分，共20分）1.分子發(fā)光包括熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光等類型，其中熒光和磷光屬于________發(fā)光，化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光屬于________發(fā)光。2.熒光量子產(chǎn)率（Φf）的定義式為________，其取值范圍為________。3.分子熒光的激發(fā)光譜反映的是________與激發(fā)波長的關(guān)系，發(fā)射光譜反映的是________與發(fā)射波長的關(guān)系。4.影響熒光強(qiáng)度的主要因素包括分子結(jié)構(gòu)（如共軛體系、剛性平面、取代基）、________、________、________（至少列舉3項）。5.磷光的產(chǎn)生需經(jīng)歷________（填躍遷類型）從S?態(tài)到T?態(tài)，再通過________躍遷回到基態(tài)S?。6.化學(xué)發(fā)光的量子產(chǎn)率（ΦCL）由________和________共同決定，公式為ΦCL=ΦR×ΦEM，其中ΦR是________，ΦEM是________。7.熒光壽命（τf）與輻射躍遷速率常數(shù)（k_r）、非輻射躍遷速率常數(shù)（k_nr）的關(guān)系為________；若某物質(zhì)的τf=5ns，且k_r=2×10?s?1，則k_nr=________s?1。8.生物發(fā)光分析中，螢火蟲發(fā)光的關(guān)鍵酶是________，其發(fā)光底物為________。三、簡答題（每題6分，共30分）1.簡述分子熒光與磷光產(chǎn)生機(jī)制的主要差異，并說明為何室溫下磷光通常難以觀測。2.解釋“熒光猝滅”的概念，并列舉3種常見的猝滅類型及其作用機(jī)制。3.比較化學(xué)發(fā)光分析與熒光分析的優(yōu)缺點（各至少2點）。4.溫度對熒光強(qiáng)度的影響具有雙重性：一方面升高溫度可能增強(qiáng)分子與溶劑的碰撞（促進(jìn)非輻射躍遷），另一方面可能破壞分子間氫鍵（減少非輻射躍遷）。請結(jié)合具體例子說明實際分析中如何平衡這兩種效應(yīng)。5.同步熒光光譜（SFS）的掃描方式有哪幾種？與常規(guī)熒光光譜相比，其在復(fù)雜樣品分析中的優(yōu)勢是什么？四、計算題（共20分）1.（8分）采用熒光法測定某藥物中有效成分X的含量。配制X的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL，測得熒光強(qiáng)度（F）分別為12.5、62.0、124.0、248.0。取樣品溶液10.0mL，稀釋至100mL后測得F=98.5，假設(shè)在該濃度范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度與濃度呈線性關(guān)系（F=kC+b，且b≈0），計算原樣品溶液中X的濃度（單位：μg/mL）。2.（6分）某磷光物質(zhì)的磷光強(qiáng)度隨時間衰減符合I(t)=I?e^(-t/τp)，其中τp為磷光壽命。實驗測得t=0時I?=1000，t=50μs時I=368，計算該物質(zhì)的磷光壽命τp；若t=100μs時I=？3.（6分）某化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，消耗1.2×10??mol的反應(yīng)物A，測得發(fā)射光子數(shù)為2.4×1012個，計算該反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)率（ΦCL）。（已知阿伏伽德羅常數(shù)N_A=6.02×1023mol?1）五、綜合應(yīng)用題（共10分）某實驗室需建立高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLD）測定血漿中新型抗腫瘤藥物Y（結(jié)構(gòu)含萘環(huán)，激發(fā)波長280nm，發(fā)射波長340nm）的濃度。請設(shè)計實驗方案，包括：（1）色譜條件選擇（流動相、固定相、柱溫）；（2）熒光檢測器參數(shù)設(shè)置；（3）可能的干擾因素及解決措施（至少2項）。答案一、選擇題1.C2.C3.A（Φf=k_r/(k_r+k_nr)，0.3=k_r/(k_r+7×10?)，解得k_r≈3×10?）4.B5.A6.C7.B（直角檢測可減少激發(fā)光直接進(jìn)入檢測器）8.A9.D（pH變化可能改變分子解離狀態(tài)，影響熒光）10.B二、填空題1.光致；非光致（或化學(xué)能激發(fā)）2.Φf=發(fā)射光子數(shù)/吸收光子數(shù)；0≤Φf≤13.熒光強(qiáng)度；熒光強(qiáng)度4.溶劑性質(zhì)（極性、黏度）；溫度；pH；猝滅劑存在（任選3項）5.系間竄越（ISC）；輻射（磷光發(fā)射）6.反應(yīng)效率；發(fā)光效率；反應(yīng)提供激發(fā)態(tài)產(chǎn)物的效率；激發(fā)態(tài)產(chǎn)物發(fā)射光子的效率7.τf=1/(k_r+k_nr)；0.5×10?（τf=1/(k_r+k_nr)=5×10??s，解得k_nr=2×10?-1/5×10?=0.5×10?）8.熒光素酶；熒光素三、簡答題1.差異：熒光來自S?→S?的輻射躍遷（單重態(tài)→單重態(tài)），自旋允許，壽命短（10??~10??s）；磷光來自T?→S?的輻射躍遷（三重態(tài)→單重態(tài)），自旋禁阻，壽命長（10??~102s）。室溫下，T?態(tài)易通過非輻射躍遷（如與溶劑碰撞）失活，難以積累足夠激發(fā)態(tài)分子發(fā)射磷光，需低溫或剛性介質(zhì)抑制非輻射躍遷。2.熒光猝滅：熒光物質(zhì)分子與其他物質(zhì)相互作用導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。常見類型：（1）動態(tài)猝滅（碰撞猝滅）：激發(fā)態(tài)分子與猝滅劑碰撞，能量以熱形式耗散，與溫度、猝滅劑濃度正相關(guān)；（2）靜態(tài)猝滅（形成復(fù)合物）：基態(tài)分子與猝滅劑形成無熒光復(fù)合物，與溫度負(fù)相關(guān)；（3）電荷轉(zhuǎn)移猝滅：猝滅劑與熒光分子發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，降低激發(fā)態(tài)能量，如O?的順磁性促進(jìn)系間竄越。3.化學(xué)發(fā)光優(yōu)點：無需外光源（無散射干擾）、靈敏度高（檢測限可達(dá)10?12~10?1?mol/L）；缺點：發(fā)光反應(yīng)需特定條件（如pH、催化劑），適用物質(zhì)有限。熒光分析優(yōu)點：應(yīng)用廣泛（多數(shù)芳香族化合物可測）、線性范圍寬；缺點：易受散射光（瑞利、拉曼散射）干擾，需嚴(yán)格控制激發(fā)波長。4.以羅丹明B為例，其熒光與分子內(nèi)氫鍵相關(guān)。低溫下氫鍵穩(wěn)定，非輻射躍遷少，熒光強(qiáng)；溫度升高時，氫鍵斷裂，分子剛性降低，非輻射躍遷（如振動弛豫）增強(qiáng)，熒光減弱。實際分析中，通常選擇室溫（25℃）作為檢測溫度，若需更高靈敏度，可采用恒溫裝置（如20℃）平衡熱運動與氫鍵破壞的影響；對于易形成剛性結(jié)構(gòu)的物質(zhì)（如金屬螯合物），適當(dāng)升溫可能因減少溶劑籠效應(yīng)（降低碰撞概率）而增強(qiáng)熒光，需通過實驗優(yōu)化溫度。5.同步熒光掃描方式：（1）固定波長同步（Δλ=λem-λex=常數(shù)）；（2）固定能量同步（ΔE=常數(shù)）；（3）可變角度同步。優(yōu)勢：通過固定Δλ減少光譜重疊，簡化復(fù)雜樣品（如生物體液、環(huán)境水樣）的光譜圖，提高選擇性；同時降低背景干擾，提升檢測靈敏度。四、計算題1.標(biāo)準(zhǔn)曲線：F=kC，k=12.5/0.1=125（或通過1.0μg/mL時F=124，k≈124）。樣品稀釋后濃度C=98.5/125≈0.788μg/mL，原樣品濃度=0.788×100/10=7.88μg/mL（或用124計算得0.794×10=7.94，取近似值7.9μg/mL）。2.τp=50μs（因I/I?=e^(-t/τp)，t=τp時I/I?≈1/e≈0.368）；t=100μs時，I=1000×e^(-100/50)=1000×e?2≈135。3.反應(yīng)分子數(shù)=1.2×10??mol×6.02×1023mol?1=7.224×101?個；ΦCL=發(fā)射光子數(shù)/反應(yīng)分子數(shù)=2.4×1012/(7.224×101?)≈3.32×10??。五、綜合應(yīng)用題（1）色譜條件：固定相選擇C18鍵合硅膠柱（萘環(huán)為疏水性，C18柱對其保留強(qiáng)）；流動相采用甲醇-水（60:40，v/v）或乙腈-0.1%甲酸水（55:45），調(diào)節(jié)pH至3~4（藥物Y含萘環(huán)，中性或弱酸性條件下更穩(wěn)定）；柱溫設(shè)為30℃（平衡分離效率與柱壓）。（2）檢測器參數(shù)：激發(fā)波長λex=280nm（萘環(huán)的最大激發(fā)波長），發(fā)射波長λem=340nm（