2025年WB實驗試題及答案一、單項選擇題（每題2分，共20分）1.進行WesternBlot實驗時，若目標蛋白分子量為120kDa，最適宜選擇的分離膠濃度是（）A.5%B.8%C.12%D.15%2.以下關于SDS上樣緩沖液的描述，錯誤的是（）A.含β-巰基乙醇可破壞二硫鍵B.溴酚藍用于指示電泳進程C.甘油增加樣品密度，防止擴散D.SDS的作用是使蛋白帶正電荷3.轉膜時選擇PVDF膜而非NC膜的主要原因是（）A.PVDF膜親水性更強B.PVDF膜結合蛋白能力更高C.NC膜易脆裂D.PVDF膜無需甲醇活化4.封閉步驟中，若使用5%脫脂奶粉作為封閉液，需避免檢測的目標蛋白是（）A.磷酸化蛋白B.糖基化蛋白C.脂結合蛋白D.生物素標記蛋白5.一抗孵育后洗膜不充分，最可能導致的結果是（）A.背景過高B.條帶缺失C.分子量偏移D.信號過弱6.采用ECL化學發(fā)光法顯色時，若曝光后膠片無條帶，最不可能的原因是（）A.一抗與目標蛋白種屬不匹配B.轉膜時電流過大導致蛋白洗脫C.封閉時間過長D.二抗未偶聯(lián)HRP7.檢測細胞裂解液中的胞內蛋白時，裂解緩沖液中通常不包含的成分是（）A.TritonX-100B.PMSFC.EDTAD.牛血清白蛋白（BSA）8.若目標蛋白為膜蛋白，提高其在SDS中分離效果的關鍵操作是（）A.增加上樣量B.延長煮沸時間至15分鐘C.使用含高濃度去垢劑的裂解液D.降低分離膠pH值9.以下關于內參蛋白選擇的描述，錯誤的是（）A.檢測心肌組織樣本時，GAPDH比β-actin更穩(wěn)定B.目標蛋白為核蛋白時，可選擇組蛋白H3作為內參C.細胞發(fā)生凋亡時，β-tubulin可能降解，不宜作為內參D.內參分子量應與目標蛋白差異≥10kDa10.半干轉膜與濕轉相比，主要優(yōu)勢是（）A.適合大分子量蛋白轉膜B.所需時間更短C.轉膜效率更高D.無需使用轉膜緩沖液二、多項選擇題（每題3分，共15分，少選得1分，錯選不得分）11.以下屬于SDS電泳前樣品處理步驟的是（）A.細胞裂解后4℃12000g離心15分鐘B.加入5×上樣緩沖液后100℃煮沸5分鐘C.用BCA法測定蛋白濃度D.調節(jié)樣品pH至中性12.轉膜失敗的可能原因包括（）A.膜與膠之間存在氣泡B.轉膜緩沖液未預冷（25℃）C.電流設置為100mA（濕轉，10cm×10cm膠）D.PVDF膜僅用超純水活化13.封閉液的作用包括（）A.阻斷膜上未結合蛋白的非特異性位點B.防止一抗與膜直接結合產(chǎn)生背景C.維持抗體的生物學活性D.增強二抗與一抗的結合效率14.以下關于二抗選擇的描述，正確的是（）A.一抗為兔源單克隆抗體時，二抗需為抗兔IgGB.若使用熒光二抗，需避免與一抗種屬交叉反應C.化學發(fā)光二抗的HRP濃度越高，信號越強D.二抗孵育時間過長可能導致非特異性結合15.實驗中觀察到目標條帶位置比預期分子量大，可能的原因是（）A.目標蛋白發(fā)生磷酸化修飾B.上樣緩沖液中未加β-巰基乙醇C.分離膠濃度過高D.電泳時電壓過低導致電泳時間過長三、簡答題（每題8分，共40分）16.簡述SDS中濃縮膠（積層膠）的作用機制。17.列舉3種檢測蛋白上樣量一致性的方法，并說明其原理。18.轉膜后，如何驗證蛋白已成功從膠轉移至膜？請寫出2種方法。19.若實驗中出現(xiàn)“微笑條帶”（條帶中間上凸），可能的原因及解決方法是什么？20.比較化學發(fā)光法（ECL）與熒光檢測法在WB中的優(yōu)缺點。四、實驗設計與分析題（共25分）21.某實驗室擬檢測缺氧處理（6小時）的HepG2細胞中HIF-1α（缺氧誘導因子-1α，分子量約120kDa）的表達變化，同時以β-actin（42kDa）作為內參。實驗步驟如下：①收集細胞，加入RIPA裂解液（含PMSF和蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘；②4℃12000g離心10分鐘，取上清，BCA法測蛋白濃度；③調整蛋白濃度至2μg/μL，加入5×上樣緩沖液（含SDS、β-巰基乙醇、溴酚藍、甘油），100℃煮沸5分鐘；④配制10%分離膠（pH8.8）和5%濃縮膠（pH6.8），上樣20μL/孔；⑤恒壓80V電泳至溴酚藍進入分離膠，調至120V至溴酚藍到達膠底部；⑥濕轉法轉膜：PVDF膜用甲醇活化30秒，與膠、濾紙組裝成“三明治”（順序：陰極→濾紙→膠→膜→濾紙→陽極），轉膜緩沖液（含20%甲醇）4℃恒流200mA轉膜2小時；⑦5%脫脂奶粉（TBST配制）室溫封閉1小時；⑧加入兔抗HIF-1α一抗（1:1000，TBST稀釋），4℃孵育過夜；⑨TBST洗膜3次（5分鐘/次），加入山羊抗兔HRP二抗（1:5000，TBST稀釋），室溫孵育1小時；⑩TBST洗膜3次（5分鐘/次），滴加ECL底物，暗室曝光。實驗結果：HIF-1α條帶模糊且背景高，β-actin條帶清晰。（1）分析HIF-1α條帶模糊和背景高的可能原因（至少4條）。（10分）（2）針對上述問題，提出改進方案（至少4條）。（15分）答案一、單項選擇題1.B（120kDa蛋白適宜8%分離膠，5%用于>200kDa，12%用于50-100kDa，15%用于<30kDa）2.D（SDS使蛋白帶負電荷，向陽極移動）3.B（PVDF膜結合蛋白能力（100-200μg/cm2）高于NC膜（80-100μg/cm2））4.A（脫脂奶粉含酪蛋白，可能與磷酸化抗體交叉反應）5.A（洗膜不充分導致未結合一抗殘留，與二抗結合產(chǎn)生高背景）6.C（封閉時間過長可能降低信號，但不會導致無條帶）7.D（BSA通常用于封閉液，裂解液含去垢劑、蛋白酶抑制劑等）8.C（膜蛋白需高濃度去垢劑（如1%SDS或NP-40）助溶）9.A（心肌組織中β-actin比GAPDH更穩(wěn)定，GAPDH在代謝活躍組織中表達易變）10.B（半干轉通常30分鐘-2小時，濕轉需2-4小時或過夜）二、多項選擇題11.ABC（樣品處理包括裂解、離心取上清、定量、變性，無需調節(jié)pH，SDS緩沖液已調節(jié)）12.ABD（轉膜緩沖液未預冷可能導致產(chǎn)熱，膜與膠氣泡阻礙轉移，PVDF膜需甲醇活化，純水無法活化）13.AB（封閉液主要阻斷膜上非特異性位點，防止一抗非特異性結合，不直接影響抗體活性或二抗結合）14.ABD（二抗需與一抗種屬匹配；熒光二抗需避免交叉反應；HRP濃度過高可能導致背景；孵育時間過長增加非特異性結合）15.AB（磷酸化修飾增加分子量；未加β-巰基乙醇導致二硫鍵保留，蛋白未完全變性，遷移率降低）三、簡答題16.濃縮膠（pH6.8）的作用機制：①低pH環(huán)境使Cl?（快離子）遷移率高于蛋白質-SDS復合物（慢離子），在濃縮膠中形成電位梯度，壓縮蛋白條帶；②濃縮膠孔徑大（約100nm），允許蛋白自由遷移，通過分子篩效應初步聚集；③當?shù)鞍走M入分離膠（pH8.8）時，Cl?遷移率降低，甘氨酸根（慢離子）遷移率升高，形成穩(wěn)定電場，蛋白按分子量分離。17.檢測上樣量一致性的方法及原理：①考馬斯亮藍染色膠：電泳后剝膠，考馬斯亮藍染色，觀察各泳道條帶密度（總蛋白染色，反映上樣量）；②內參蛋白檢測：選擇表達穩(wěn)定的蛋白（如β-actin），通過WB檢測其條帶密度，間接驗證上樣量；③紫外分光光度法：上樣前用UV280nm測各樣品蛋白濃度，調整至相同濃度（需排除裂解液干擾）。18.驗證轉膜成功的方法：①麗春紅染色：轉膜后用麗春紅S染膜，可見紅色條帶（非特異性結合蛋白），若膠上無明顯條帶，說明轉移成功；②考馬斯亮藍染膠：轉膜后將膠用考馬斯亮藍染色，若膠上無或僅有少量條帶，證明蛋白已轉移至膜；③預染蛋白Marker：使用預染Marker，轉膜后直接觀察膜上是否有Marker條帶（需注意大分子量Marker可能轉移不完全）。19.微笑條帶的原因及解決方法：原因：①電泳時膠板兩側溫度低于中間（如冷卻系統(tǒng)不良），導致兩側凝膠收縮，蛋白遷移率降低；②分離膠聚合不均勻（如APS或TEMED濃度不均），中間膠更緊密；③上樣量過大，超過凝膠負載能力。解決方法：①使用循環(huán)水浴或冰浴降溫，確保膠板溫度均勻；②配制凝膠時充分混勻，避免局部聚合差異；③減少上樣量（通常不超過30μg/孔），或增加凝膠厚度。20.化學發(fā)光法（ECL）與熒光檢測法的優(yōu)缺點：ECL優(yōu)點：靈敏度高（可檢測pg級蛋白）、操作簡單（無需特殊儀器）、成本低；缺點：信號衰減快（需及時曝光）、無法多重檢測（單通道）、背景易受HRP殘留影響。熒光檢測法優(yōu)點：可同時檢測多個目標蛋白（不同熒光波長）、信號穩(wěn)定（可反復掃描）、動態(tài)范圍廣；缺點：需要熒光成像儀（成本高）、靈敏度略低（適用于ng級蛋白）、需避免光漂白（操作需避光）。四、實驗設計與分析題21.（1）HIF-1α條帶模糊及背景高的可能原因：①轉膜時間不足：HIF-1α分子量120kDa，濕轉200mA2小時可能未完全轉移（大分子量蛋白通常需3-4小時或恒壓100V過夜）；②封閉不充分：HIF-1α為誘導表達蛋白，豐度較低，5%脫脂奶粉封閉1小時可能未完全阻斷膜上非特異性位點（可延長至2小時或使用BSA封閉）；③一抗?jié)舛然蚍跤龡l件不當：1:1000的一抗?jié)舛瓤赡苓^低（HIF-1α豐度低時需提高至1:500），或4℃孵育過夜但搖床轉速過低，導致抗體結合不充分；④洗膜不徹底：TBST洗膜3次×5分鐘可能不足（背景高時需增加至5次×10分鐘），殘留未結合一抗與二抗反應；⑤PVDF膜活化不充分：甲醇活化僅30秒（通常需1-2分鐘），膜未完全親水，影響蛋白結合；⑥裂解液選擇不當：RIPA裂解液含強去垢劑（如SDS），可能導致HIF-1α變性或與其他蛋白結合，影響電泳遷移率（可換用溫和裂解液如NP-40裂解液）。（2）改進方案：①延長轉膜時間：濕轉時改為恒壓100V（4℃）轉膜3小時，或使用半干轉（15V，1.5小時）提高大分子量蛋白轉移效率；②優(yōu)化封閉條件：改用5%BSA（TBST配制）封閉2小時（BSA非特異性結合更少，適合低豐度蛋白）；③調整一抗?jié)舛群头跤绞剑簩⒁豢瓜♂尡壤岣咧?:500，4℃孵育時使用低速搖床（確?？贵w均勻接觸膜）；④加強洗膜步驟：一抗和二抗孵育后，均用TBST洗膜5次（10分鐘/次），最后一次可加入0.1%