慢病毒介導(dǎo)shRNA構(gòu)建抑制口蹄疫病毒增殖細(xì)胞系的研究與應(yīng)用一、引言1.1研究背景與意義口蹄疫（Foot-and-MouthDisease，F(xiàn)MD）是一種由口蹄疫病毒（Foot-and-MouthDiseaseVirus，F(xiàn)MDV）引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要感染牛、豬、羊等偶蹄動(dòng)物。該病傳播迅速、發(fā)病率高，一旦爆發(fā)，會(huì)給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響肉類、奶制品等農(nóng)產(chǎn)品的供應(yīng)，進(jìn)而對(duì)全球經(jīng)濟(jì)和食品安全產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。目前，防控口蹄疫的主要手段是疫苗接種。然而，現(xiàn)有疫苗存在諸多局限性。一方面，F(xiàn)MDV具有7個(gè)血清型（O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1）以及眾多亞型，不同血清型和亞型之間的抗原性差異較大，導(dǎo)致疫苗的通用性較差，需要針對(duì)不同的血清型和亞型分別制備疫苗，這不僅增加了疫苗研發(fā)和生產(chǎn)的成本，也給疫苗的選擇和使用帶來了困難。另一方面，F(xiàn)MDV的變異速度較快，容易出現(xiàn)新的變異株，使得現(xiàn)有的疫苗難以對(duì)其提供有效的保護(hù)。此外，疫苗接種后需要一定的時(shí)間才能產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，在疫情爆發(fā)的緊急情況下，難以快速有效地控制疫情的傳播。因此，尋找新的治療手段和控制措施成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)是一種在細(xì)胞內(nèi)通過RNA分子靶向破壞指定基因的技術(shù)，是近年來最為成功的基因敲除方法之一。在RNAi技術(shù)中，小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）和小發(fā)夾RNA（smallhairpinRNA，shRNA）可以選擇性地降低目標(biāo)基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)基因沉默。研究證明，RNAi技術(shù)已經(jīng)成功用于控制口蹄疫的發(fā)展，但是現(xiàn)有的RNAi技術(shù)仍有許多不足之處，如缺乏持久的效果和穩(wěn)定性。慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)能夠有效解決上述問題，因?yàn)槁《据d體可以將shRNA穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的基因組中，從而實(shí)現(xiàn)shRNA的持續(xù)表達(dá)，可持續(xù)且穩(wěn)定地降低目標(biāo)基因的表達(dá)。此外，慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)還具有轉(zhuǎn)染效率高、宿主范圍廣、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，也被證明具有很好的聯(lián)合治療效果和低副作用。因此，建立基于慢病毒介導(dǎo)的shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制FMDV增殖的兩類細(xì)胞系，對(duì)于深入研究FMDV的致病機(jī)制、開發(fā)新的抗病毒藥物和治療方法具有重要的意義。本研究旨在建立兩類細(xì)胞系，包括非免疫型細(xì)胞系（如293T）和免疫型細(xì)胞系（如porcinekidney3，PK-3），通過慢病毒介導(dǎo)shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制FMDV增殖。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究慢病毒介導(dǎo)RNAi技術(shù)對(duì)FMDV增殖的影響，為未來研究口蹄疫治療方案提供重要參考。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在RNA干擾技術(shù)的研究領(lǐng)域，國外早在20世紀(jì)90年代末就開始了相關(guān)探索。Fire等科學(xué)家于1998年首次在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象，這一開創(chuàng)性的研究成果為后續(xù)基因沉默機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)，也為利用RNAi技術(shù)進(jìn)行抗病毒研究提供了理論依據(jù)。隨后，RNAi技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，其中就包括對(duì)病毒感染性疾病的研究。在口蹄疫病毒的研究方面，國外研究人員率先嘗試將RNAi技術(shù)應(yīng)用于抑制FMDV的增殖。他們通過設(shè)計(jì)針對(duì)FMDV基因組特定區(qū)域的siRNA，成功在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中降低了病毒的復(fù)制水平，為口蹄疫的防治提供了新的思路。隨著研究的深入，慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)逐漸成為研究熱點(diǎn)。國外科研團(tuán)隊(duì)利用慢病毒載體將shRNA導(dǎo)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定基因的長期穩(wěn)定沉默。在抗病毒研究中，這種技術(shù)被應(yīng)用于構(gòu)建穩(wěn)定抑制FMDV增殖的細(xì)胞系。例如，有研究通過慢病毒介導(dǎo)shRNA，在BHK-21細(xì)胞中穩(wěn)定抑制FMDV的關(guān)鍵基因表達(dá)，顯著降低了病毒的感染能力和增殖效率，為進(jìn)一步研究FMDV的致病機(jī)制和開發(fā)新型抗病毒策略提供了有力的工具。國內(nèi)在RNA干擾技術(shù)和慢病毒介導(dǎo)shRNA技術(shù)方面的研究起步相對(duì)較晚，但發(fā)展迅速。近年來，國內(nèi)科研團(tuán)隊(duì)在RNAi技術(shù)的基礎(chǔ)理論研究和應(yīng)用研究方面都取得了顯著成果。在口蹄疫病毒的研究中，國內(nèi)學(xué)者積極探索利用RNAi技術(shù)抑制FMDV增殖的方法。通過篩選有效的干擾靶點(diǎn)和優(yōu)化RNAi載體，在體外細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中都取得了較好的抗病毒效果。在構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)shRNA穩(wěn)定抑制FMDV增殖的細(xì)胞系方面，國內(nèi)研究人員也進(jìn)行了大量的工作。他們通過對(duì)慢病毒載體的改造和優(yōu)化，提高了shRNA的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)穩(wěn)定性。同時(shí)，結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法，成功構(gòu)建了多種能夠穩(wěn)定抑制FMDV增殖的細(xì)胞系，并對(duì)其抗病毒機(jī)制進(jìn)行了深入研究。這些研究成果不僅為口蹄疫的防治提供了新的技術(shù)手段，也為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了重要的參考依據(jù)。盡管國內(nèi)外在慢病毒介導(dǎo)shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制口蹄疫病毒增殖的細(xì)胞系建立方面取得了一定的進(jìn)展，但仍存在一些問題和挑戰(zhàn)。一方面，如何進(jìn)一步提高慢病毒介導(dǎo)shRNA的效率和穩(wěn)定性，降低脫靶效應(yīng)，仍是需要解決的關(guān)鍵問題。另一方面，對(duì)于構(gòu)建的細(xì)胞系在體內(nèi)的抗病毒效果和安全性評(píng)價(jià)還需要進(jìn)一步深入研究，以確保其在實(shí)際應(yīng)用中的有效性和可靠性。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在建立基于慢病毒介導(dǎo)的shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制FMDV增殖的兩類細(xì)胞系，即非免疫型細(xì)胞系和免疫型細(xì)胞系，并深入探究慢病毒介導(dǎo)RNAi技術(shù)對(duì)FMDV增殖的影響，為未來口蹄疫治療方案的研究提供重要參考。具體研究內(nèi)容如下：確定適宜的細(xì)胞系：通過對(duì)多種細(xì)胞系的特性分析和篩選，選擇293T細(xì)胞作為非免疫型細(xì)胞系的研究對(duì)象。293T細(xì)胞是一種人胚腎細(xì)胞系，具有易于培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染效率高、生長迅速等優(yōu)點(diǎn)，在基因功能研究和病毒學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。選擇PK-3細(xì)胞作為免疫型細(xì)胞系的研究對(duì)象，PK-3細(xì)胞是豬腎細(xì)胞系，對(duì)口蹄疫病毒具有一定的天然免疫反應(yīng)，能夠更真實(shí)地模擬病毒在免疫細(xì)胞中的感染和增殖過程，為研究FMDV與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用提供良好的模型。構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制FMDV增殖的兩類細(xì)胞系：構(gòu)建相應(yīng)的載體，包括慢病毒載體和shRNA載體。在構(gòu)建過程中，首先根據(jù)FMDV的基因序列，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)FMDV關(guān)鍵基因的shRNA序列，然后將其連接到慢病毒載體上，形成重組慢病毒載體。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或電穿孔法等適當(dāng)?shù)姆椒?，將重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染到293T和PK-3細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后，利用嘌呤霉素等抗生素進(jìn)行篩選，從中篩選出帶有穩(wěn)定shRNA的細(xì)胞系。驗(yàn)證慢病毒介導(dǎo)shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制FMDV增殖的效果：將篩選出來的細(xì)胞系和FMDV共同培養(yǎng)，通過觀察病毒感染后的細(xì)胞表型變化，如細(xì)胞的形態(tài)、生長情況、細(xì)胞病變效應(yīng)等，以及檢測(cè)病毒核酸的變化，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒RNA的拷貝數(shù)、病毒滴度測(cè)定等方法，來驗(yàn)證慢病毒介導(dǎo)shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制FMDV增殖的效果。同時(shí)，設(shè)置對(duì)照組，包括未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系感染FMDV組和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞系感染FMDV組，以對(duì)比分析慢病毒介導(dǎo)shRNA對(duì)FMDV增殖的抑制作用。1.4研究方法與技術(shù)路線細(xì)胞系培養(yǎng)：在生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)操作，嚴(yán)格按照細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。對(duì)于293T細(xì)胞和PK-3細(xì)胞，使用含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染：根據(jù)FMDV的基因序列，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)FMDV關(guān)鍵基因（如VP1基因）的shRNA序列，將其連接到慢病毒載體（如pLKO.1載體）上，構(gòu)建重組慢病毒載體。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組慢病毒載體和輔助質(zhì)粒（psPAX2和pMD2.G）共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，進(jìn)行慢病毒的包裝和生產(chǎn)。收集培養(yǎng)上清中的慢病毒顆粒，通過超速離心法進(jìn)行濃縮和純化。將濃縮后的慢病毒感染293T細(xì)胞和PK-3細(xì)胞，感染時(shí)設(shè)置不同的感染復(fù)數(shù)（MOI），如MOI=1、MOI=5、MOI=10等，以確定最佳的感染條件。感染后48-72小時(shí)，使用嘌呤霉素（濃度為2-5μg/mL）進(jìn)行篩選，持續(xù)篩選2-3周，獲得穩(wěn)定表達(dá)shRNA的細(xì)胞系。PCR檢測(cè)：提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的基因組DNA，設(shè)計(jì)針對(duì)shRNA插入片段的特異性引物，通過PCR方法檢測(cè)其中是否存在靶標(biāo)RNA。PCR反應(yīng)體系包括模板DNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的95℃變性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒，最后72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶。Westernblot檢測(cè)：收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，通過BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)。加入針對(duì)FMDV關(guān)鍵蛋白（如VP1蛋白）的一抗，4℃孵育過夜，然后用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時(shí)，再次用TBST洗滌3次，每次10分鐘。最后使用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶的表達(dá)情況。MOI的優(yōu)化：利用不同的MOI感染轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在感染后48-72小時(shí)，通過觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)、熒光表達(dá)情況（如果慢病毒載體帶有熒光標(biāo)記）以及檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)shRNA的表達(dá)水平（如通過qRT-PCR檢測(cè)），篩選適合的MOI，以確保慢病毒能夠高效感染細(xì)胞且對(duì)細(xì)胞毒性較小。結(jié)果分析：將篩選出來的穩(wěn)定表達(dá)shRNA的細(xì)胞系和FMDV共同培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)（如感染后12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)等）收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。通過觀察病毒感染后的細(xì)胞表型變化，如細(xì)胞的形態(tài)（是否出現(xiàn)細(xì)胞病變、細(xì)胞皺縮等）、生長情況（細(xì)胞增殖速度是否受到影響），以及檢測(cè)病毒核酸的變化（如實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒RNA的拷貝數(shù)、病毒滴度測(cè)定）來評(píng)估慢病毒介導(dǎo)shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制FMDV增殖的效果。同時(shí)，設(shè)置對(duì)照組，包括未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系感染FMDV組和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞系感染FMDV組，對(duì)比分析慢病毒介導(dǎo)shRNA對(duì)FMDV增殖的抑制作用。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（如t檢驗(yàn)、方差分析等）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，判斷實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究的技術(shù)路線如圖1所示：文獻(xiàn)調(diào)研與準(zhǔn)備階段：查閱大量關(guān)于口蹄疫病毒、RNA干擾技術(shù)、慢病毒載體等方面的文獻(xiàn)資料，深入了解相關(guān)領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀和前沿動(dòng)態(tài)，為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。同時(shí)，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞系（293T細(xì)胞和PK-3細(xì)胞）、病毒（FMDV）、試劑（各種培養(yǎng)基、血清、抗生素、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、引物、抗體等）和儀器設(shè)備（細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)等）。細(xì)胞系選擇與培養(yǎng)階段：對(duì)293T細(xì)胞和PK-3細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。在培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，定期檢測(cè)細(xì)胞的活力和純度，確保細(xì)胞質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。載體構(gòu)建與慢病毒包裝階段：設(shè)計(jì)針對(duì)FMDV關(guān)鍵基因的shRNA序列，合成后連接到慢病毒載體上，構(gòu)建重組慢病毒載體。將重組慢病毒載體和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，進(jìn)行慢病毒的包裝和生產(chǎn)。收集培養(yǎng)上清中的慢病毒顆粒，通過超速離心法進(jìn)行濃縮和純化。細(xì)胞感染與篩選階段：用濃縮后的慢病毒感染293T細(xì)胞和PK-3細(xì)胞，設(shè)置不同的MOI，確定最佳感染條件。感染后，使用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)shRNA的細(xì)胞系。效果驗(yàn)證階段：將穩(wěn)定表達(dá)shRNA的細(xì)胞系和FMDV共同培養(yǎng)，通過觀察細(xì)胞表型變化和檢測(cè)病毒核酸變化，驗(yàn)證慢病毒介導(dǎo)shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制FMDV增殖的效果。同時(shí)，設(shè)置對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比分析。數(shù)據(jù)分析與總結(jié)階段：對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析，采用合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法判斷實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)慢病毒介導(dǎo)RNAi技術(shù)對(duì)FMDV增殖的影響，撰寫研究報(bào)告，為口蹄疫治療方案的研究提供重要參考。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中各階段用箭頭連接，每個(gè)階段標(biāo)注相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和關(guān)鍵步驟]圖1技術(shù)路線圖二、口蹄疫病毒及RNA干擾技術(shù)概述2.1口蹄疫病毒特性2.1.1病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)口蹄疫病毒（FMDV）屬于小RNA病毒科口瘡病毒屬，在電子顯微鏡下觀察，其外形呈球形或近似圓形，無包膜結(jié)構(gòu)。病毒粒子直徑約為25-30nm，由蛋白質(zhì)衣殼和內(nèi)部的核酸組成，具有二十面體對(duì)稱的衣殼結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)賦予了病毒較高的穩(wěn)定性。FMDV的衣殼由60個(gè)相同的蛋白亞基組成，這些亞基進(jìn)一步組裝形成五聚體，然后由12個(gè)五聚體構(gòu)成完整的二十面體衣殼。衣殼蛋白包括VP1、VP2、VP3和VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白。其中，VP1、VP2和VP3位于衣殼表面，直接與外界環(huán)境接觸，它們?cè)诓《镜母腥具^程中發(fā)揮著重要作用，如識(shí)別宿主細(xì)胞受體、誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)等。VP1蛋白上存在著與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的位點(diǎn)，是病毒感染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵分子；同時(shí)，VP1也是病毒的主要抗原位點(diǎn)，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，對(duì)病毒的免疫診斷和疫苗研發(fā)具有重要意義。VP4則位于衣殼內(nèi)部，與病毒核酸緊密結(jié)合，起到保護(hù)核酸的作用。FMDV的核酸為單鏈正股RNA，長度約為8.5kb。這種核酸結(jié)構(gòu)可以直接作為信使RNA（mRNA），參與病毒蛋白的合成過程。在病毒粒子中，核酸被衣殼蛋白緊密包裹，免受外界核酸酶的降解，確保了病毒基因組的完整性和穩(wěn)定性，為病毒的復(fù)制和感染提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。2.1.2病毒基因組結(jié)構(gòu)FMDV的基因組結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，由5'-非翻譯區(qū)（5'-UTR）、開放讀碼框（ORF）和3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）組成。5'-UTR長度較長，約為1300個(gè)核苷酸，具有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)。其第一個(gè)核苷酸為尿嘧啶（U），并與病毒編碼的小蛋白質(zhì)（VPg）以共價(jià)鍵的形式結(jié)合。5'-UTR中沒有帽子結(jié)構(gòu)，但含有多個(gè)十分保守的閱讀框，這些閱讀框在調(diào)控病毒蛋白的合成與RNA的復(fù)制過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。此外，5'-UTR中還存在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES），它能夠介導(dǎo)核糖體直接結(jié)合到mRNA上，啟動(dòng)翻譯過程，這種不依賴帽子結(jié)構(gòu)的翻譯起始方式是FMDV基因表達(dá)調(diào)控的重要特征之一。ORF是病毒基因組中編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域，長度約為6.5kb。它按照特定的順序依次編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。其中，P1區(qū)域編碼結(jié)構(gòu)多肽，包括VP1、VP2、VP3和VP4，這些結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒衣殼的組裝，決定了病毒的形態(tài)和抗原性。P2和P3區(qū)域則編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白，如L蛋白酶、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D等。這些非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的生命周期中發(fā)揮著多種重要功能，如參與RNA復(fù)制、多聚蛋白的裂解以及結(jié)構(gòu)蛋白的折疊和裝配等。3'-UTR由兩部分組成，一部分位于非結(jié)構(gòu)蛋白3D之后，大約為100個(gè)氨基酸；另一部分為poly(A)結(jié)構(gòu)。3'-UTR的主要功能是參與RNA聚合酶3D的識(shí)別，對(duì)病毒RNA的合成和穩(wěn)定性具有重要影響。此外，poly(A)尾在病毒mRNA的翻譯過程中也起到一定的作用，它可以增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)翻譯的起始和延伸。2.1.3病毒的傳播與致病機(jī)制FMDV的傳播途徑主要包括直接接觸傳播和間接接觸傳播。直接接觸傳播是指健康動(dòng)物與感染動(dòng)物直接接觸，如通過舔舐、咬斗、交配等行為，病毒可以從感染動(dòng)物的水皰液、水皰皮、奶、尿、糞便、呼出的氣體以及唾液等分泌物或排泄物中傳播到健康動(dòng)物體內(nèi)。間接接觸傳播則是指病毒通過污染的飼料、水源、畜舍、運(yùn)輸工具、飼養(yǎng)人員的衣物和鞋子等媒介，間接傳播給健康動(dòng)物。此外，F(xiàn)MDV還可以通過空氣傳播，尤其是在近距離范圍內(nèi)，病毒可以隨著氣溶膠的形式在空氣中傳播，遠(yuǎn)距離感染其他動(dòng)物。當(dāng)FMDV感染宿主細(xì)胞時(shí)，首先通過病毒表面的VP1蛋白與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，這種結(jié)合具有高度的特異性和親和力。目前已知的宿主細(xì)胞受體主要包括整合素家族成員、硫酸乙酰肝素等。結(jié)合后，病毒粒子通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，隨后衣殼蛋白在細(xì)胞內(nèi)被降解，釋放出病毒核酸。病毒核酸進(jìn)入細(xì)胞后，利用宿主細(xì)胞的核糖體、酶系統(tǒng)和各種原料，通過IRES介導(dǎo)的不依賴帽子結(jié)構(gòu)的翻譯起始方式，合成病毒的多聚蛋白。多聚蛋白在病毒編碼的蛋白酶（如L蛋白酶、3C蛋白酶等）的作用下，被裂解成多個(gè)成熟的病毒蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。這些蛋白進(jìn)一步參與病毒的復(fù)制、裝配和釋放過程。在病毒復(fù)制過程中，F(xiàn)MDV會(huì)大量消耗宿主細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)和能量，導(dǎo)致宿主細(xì)胞代謝紊亂。同時(shí)，病毒感染還會(huì)激活宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)，如誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素等細(xì)胞因子。然而，F(xiàn)MDV也進(jìn)化出了一系列逃避宿主免疫反應(yīng)的機(jī)制，例如通過編碼一些蛋白來抑制干擾素的產(chǎn)生和信號(hào)傳導(dǎo)，從而使得病毒能夠在宿主體內(nèi)持續(xù)復(fù)制和傳播。隨著病毒在宿主體內(nèi)的大量增殖，會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞的損傷和死亡，進(jìn)而引起機(jī)體的病理變化。在臨床上，感染FMDV的動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)體溫升高、精神沉郁、食欲減退、口腔黏膜、蹄部和乳房等部位出現(xiàn)水皰、潰瘍和糜爛等癥狀。嚴(yán)重感染時(shí)，還可能導(dǎo)致動(dòng)物死亡，給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2.2RNA干擾技術(shù)原理與應(yīng)用2.2.1RNA干擾的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)可以追溯到20世紀(jì)90年代。1990年，Jorgensen等在研究矮牽?；ㄉ睾铣蓵r(shí)，意外發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入的外源色素合成基因不僅自身沒有表達(dá)，還導(dǎo)致了內(nèi)源色素合成基因的表達(dá)受到抑制，這種現(xiàn)象被稱為共抑制。當(dāng)時(shí)，這一現(xiàn)象的分子機(jī)制并不清楚，引發(fā)了科研人員的廣泛關(guān)注和深入研究。1995年，Guo等在利用反義技術(shù)研究線蟲的基因功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，靶向Par-1基因的反義RNA可以阻遏該基因的表達(dá)，但令人意外的是，導(dǎo)入正義鏈RNA也出現(xiàn)了類似的基因表達(dá)抑制現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的反義RNA理論相悖，進(jìn)一步加深了人們對(duì)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的困惑。直到1998年，美國科學(xué)家Fire和Mello在線蟲中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)取得了關(guān)鍵突破。他們將靶向Par-1基因的正反義鏈RNA混合物注入線蟲卵中，發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA（dsRNA）抑制靶基因表達(dá)的能力至少比任一單鏈RNA強(qiáng)10倍以上，且靶mRNA受到明顯的干擾，同時(shí)呈現(xiàn)出可傳遞給后代的特異表型?；诖?，他們提出了“dsRNA介導(dǎo)的RNA干擾”現(xiàn)象，這一發(fā)現(xiàn)揭示了一種全新的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為后續(xù)的RNA干擾研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。由于這一開創(chuàng)性的貢獻(xiàn)，F(xiàn)ire和Mello在2006年榮獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。此后，RNA干擾技術(shù)在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域迅速發(fā)展?？茖W(xué)家們?cè)诙喾N生物中證實(shí)了RNA干擾現(xiàn)象的存在，包括植物、動(dòng)物、真菌等。在植物中，RNA干擾被發(fā)現(xiàn)是植物抵御病毒入侵的重要免疫機(jī)制之一。當(dāng)病毒感染植物細(xì)胞時(shí)，病毒的雙鏈RNA會(huì)誘發(fā)植物細(xì)胞產(chǎn)生RNA干擾，從而降解病毒的mRNA，抑制病毒的復(fù)制和傳播。在動(dòng)物中，RNA干擾也被廣泛應(yīng)用于基因功能的研究。通過設(shè)計(jì)針對(duì)特定基因的dsRNA或小干擾RNA（siRNA），可以特異性地降低該基因的表達(dá)水平，從而研究其在發(fā)育、生理和病理過程中的功能。隨著研究的深入，RNA干擾技術(shù)逐漸從基礎(chǔ)研究走向應(yīng)用領(lǐng)域。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，RNA干擾技術(shù)被視為一種極具潛力的新型治療手段，可用于治療多種疾病，如癌癥、病毒感染性疾病、遺傳性疾病等。在癌癥治療方面，通過靶向腫瘤相關(guān)基因，如癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，為癌癥的治療提供了新的策略。在病毒感染性疾病的治療中，RNA干擾技術(shù)可以針對(duì)病毒的關(guān)鍵基因進(jìn)行干擾，阻止病毒的復(fù)制和傳播，為抗病毒治療開辟了新的途徑。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，RNA干擾技術(shù)也被用于培育抗病、抗蟲的轉(zhuǎn)基因作物。通過將針對(duì)害蟲或病原菌關(guān)鍵基因的RNA干擾載體導(dǎo)入植物中，使害蟲或病原菌在攝取植物組織時(shí)攝入siRNA，從而抑制其關(guān)鍵基因的表達(dá)，達(dá)到防治病蟲害的目的。2.2.2RNA干擾的作用機(jī)制RNA干擾的作用機(jī)制主要包括起始階段、效應(yīng)階段和擴(kuò)增階段。在起始階段，外源導(dǎo)入的雙鏈RNA（dsRNA）或細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生的dsRNA，如病毒感染細(xì)胞后復(fù)制過程中產(chǎn)生的dsRNA，被細(xì)胞內(nèi)一種名為Dicer的核酸酶特異性識(shí)別。Dicer酶以ATP依賴的方式將dsRNA裂解成21-23個(gè)核苷酸長度的小干擾RNA（siRNA）。siRNA具有特定的結(jié)構(gòu)特征，其3'末端有兩個(gè)堿基凸出，5'末端為磷酸基團(tuán)，這種結(jié)構(gòu)對(duì)于后續(xù)的RNA干擾過程至關(guān)重要。進(jìn)入效應(yīng)階段，siRNA雙鏈與一系列蛋白質(zhì)組裝形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。在ATP的參與下，RISC被激活，其中的解旋酶將siRNA雙鏈解開，形成單鏈siRNA。單鏈siRNA中的反義鏈作為引導(dǎo)鏈，引導(dǎo)RISC識(shí)別并結(jié)合與其互補(bǔ)的靶mRNA序列。一旦RISC與靶mRNA結(jié)合，RISC中的核酸內(nèi)切酶就會(huì)在siRNA與靶mRNA互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域?qū)Π衜RNA進(jìn)行切割，將其降解成小片段。這些小片段隨后被細(xì)胞內(nèi)的外切核酸酶進(jìn)一步降解，從而導(dǎo)致靶mRNA無法翻譯為蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)基因沉默的效果。擴(kuò)增階段，當(dāng)RISC切割靶mRNA后，釋放出來的siRNA反義鏈可以作為引物，在RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）的作用下，以靶mRNA為模板合成新的dsRNA。新合成的dsRNA又可以被Dicer酶切割成新的siRNA，這些新產(chǎn)生的siRNA繼續(xù)參與RNA干擾過程，形成一個(gè)循環(huán)放大機(jī)制。通過這種放大效應(yīng)，少量的dsRNA就可以引發(fā)強(qiáng)烈的RNA干擾反應(yīng)，高效地抑制靶基因的表達(dá)。除了siRNA介導(dǎo)的RNA干擾，小發(fā)夾RNA（shRNA）也可以引發(fā)RNA干擾。shRNA是一種人工合成的RNA分子，其結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖部由互補(bǔ)的核苷酸序列組成，環(huán)部則是一段非互補(bǔ)的核苷酸序列。shRNA通常被克隆到表達(dá)載體中，通過轉(zhuǎn)染等方式導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。在細(xì)胞內(nèi)，shRNA首先被核酸酶切割成siRNA，然后按照與siRNA介導(dǎo)的RNA干擾相同的機(jī)制，參與RNA干擾過程，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的沉默。2.2.3RNA干擾在抗病毒研究中的應(yīng)用RNA干擾技術(shù)在抗病毒研究中展現(xiàn)出了巨大的潛力，已被廣泛應(yīng)用于多種病毒的研究，包括口蹄疫病毒、艾滋病病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）等。在口蹄疫病毒的研究中，眾多學(xué)者致力于利用RNA干擾技術(shù)抑制病毒的增殖。Snijder等人于2006年的研究表明，通過設(shè)計(jì)針對(duì)口蹄疫病毒基因組5'端核酸的siRNA，可以切割病毒基因組，使其失去復(fù)制能力。這一研究成果為口蹄疫病毒基因工程藥物的開發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。后續(xù)研究中，Liu和Floyd在2005年發(fā)現(xiàn)，siRNA不僅可以直接干擾病毒基因的表達(dá)，還能通過介導(dǎo)免疫反應(yīng)來抗擊口蹄疫病毒。他們發(fā)現(xiàn)siRNA對(duì)基因上游或下游序列的靶向識(shí)別可以激活干擾素（IFN）及其下游信號(hào)通路。IFN信號(hào)通路能夠誘導(dǎo)和加強(qiáng)免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒的抵抗力。此外，某些siRNA還能誘導(dǎo)重要的抗病毒蛋白，如β-干擾素，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫活性，有效減少病毒的感染并縮短疾病的持續(xù)時(shí)間。在HIV的研究中，RNA干擾技術(shù)被用于靶向HIV的關(guān)鍵基因，如gag、pol、env等。通過設(shè)計(jì)針對(duì)這些基因的siRNA或shRNA，并將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，可以有效抑制HIV的復(fù)制和感染。研究表明，RNA干擾能夠降低HIV在細(xì)胞內(nèi)的RNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，減少病毒顆粒的產(chǎn)生。同時(shí)，RNA干擾還可以與其他抗病毒藥物聯(lián)合使用，增強(qiáng)抗病毒效果，為HIV的治療提供了新的策略。對(duì)于HBV和HCV，RNA干擾技術(shù)也為其治療研究帶來了新的希望。在HBV的研究中，通過干擾HBV的基因表達(dá)，如HBsAg、HBcAg等基因，可以抑制病毒的復(fù)制和組裝，降低病毒載量。在HCV的研究中，針對(duì)HCV的保守序列設(shè)計(jì)siRNA，能夠有效抑制病毒的復(fù)制，并且對(duì)不同基因型的HCV都具有一定的抑制效果。這些研究為乙型肝炎和丙型肝炎的治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)和新的治療方法。三、慢病毒介導(dǎo)shRNA技術(shù)3.1慢病毒載體的特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)慢病毒載體作為一種重要的基因傳遞工具，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和顯著的優(yōu)勢(shì)，在基因治療、基因功能研究等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，其基因組為單鏈RNA。在感染細(xì)胞時(shí)，慢病毒首先通過表面的包膜糖蛋白與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，隨后病毒包膜與細(xì)胞膜融合，病毒核心進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在細(xì)胞內(nèi)，病毒攜帶的逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA，形成DNA整合前復(fù)合體。該復(fù)合體能夠穿越核膜，進(jìn)入細(xì)胞核后，在整合酶的作用下，將病毒DNA穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的基因組中。這種整合特性使得慢病毒載體能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因在宿主細(xì)胞中的長期穩(wěn)定表達(dá)，避免了基因表達(dá)隨細(xì)胞分裂而逐漸丟失的問題，為需要持續(xù)表達(dá)特定基因的研究和治療提供了有力的保障。慢病毒載體的宿主范圍極為廣泛，不僅能夠感染分裂期細(xì)胞，如快速增殖的腫瘤細(xì)胞、造血干細(xì)胞等，還對(duì)非分裂期細(xì)胞具有高效的感染能力，如神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等。這一特點(diǎn)使得慢病毒載體在多種組織和器官的基因研究和治療中具有巨大的應(yīng)用潛力。例如，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中，慢病毒載體可以將治療基因?qū)肷窠?jīng)元細(xì)胞，為治療帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病提供了新的策略；在心血管疾病的治療中，慢病毒載體能夠感染心肌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌細(xì)胞功能的調(diào)控，為心肌梗死、心力衰竭等疾病的治療帶來了新的希望。慢病毒載體具有較低的免疫原性。在改造過程中，慢病毒載體刪除了大部分病毒自身的基因，僅保留了必要的順式作用元件和包裝信號(hào)，極大地降低了其引發(fā)宿主免疫反應(yīng)的可能性。當(dāng)慢病毒載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，不易被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除，從而能夠在體內(nèi)長期穩(wěn)定地發(fā)揮作用。這一優(yōu)勢(shì)在基因治療的臨床應(yīng)用中尤為重要，減少了免疫反應(yīng)對(duì)治療效果的影響，提高了治療的安全性和有效性。與其他一些病毒載體相比，慢病毒載體具有較大的基因容量，能夠攜帶相對(duì)較大的基因片段，一般可容納不超過8kb的外源基因。這使得慢病毒載體能夠滿足多種基因治療和基因功能研究的需求，例如可以攜帶完整的基因編碼序列、調(diào)控序列以及報(bào)告基因等。在基因治療中，較大的基因容量可以確保導(dǎo)入的治療基因包含完整的功能結(jié)構(gòu)域，從而更好地發(fā)揮治療作用；在基因功能研究中，能夠同時(shí)攜帶多個(gè)基因或基因片段，有助于深入研究基因之間的相互作用和調(diào)控機(jī)制。3.2慢病毒介導(dǎo)shRNA的作用原理慢病毒介導(dǎo)shRNA的作用過程涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟，其原理基于慢病毒獨(dú)特的生物學(xué)特性和RNA干擾機(jī)制。首先，在載體構(gòu)建階段，針對(duì)目標(biāo)基因（如口蹄疫病毒的關(guān)鍵基因）設(shè)計(jì)特異性的shRNA序列。這些shRNA序列通常由一段短的反向重復(fù)序列和一個(gè)環(huán)序列組成，形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。將設(shè)計(jì)好的shRNA序列克隆到慢病毒載體中，構(gòu)建成重組慢病毒載體。慢病毒載體包含了病毒復(fù)制和包裝所必需的元件，如長末端重復(fù)序列（LTR）、包裝信號(hào)（ψ）等，同時(shí)也包含了shRNA表達(dá)盒，該表達(dá)盒通常由啟動(dòng)子（如U6啟動(dòng)子）驅(qū)動(dòng)shRNA的轉(zhuǎn)錄。接著進(jìn)入慢病毒包裝環(huán)節(jié)，將重組慢病毒載體與輔助質(zhì)粒（如psPAX2和pMD2.G）共轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞（如293T細(xì)胞）中。輔助質(zhì)粒能夠提供病毒包裝所需的蛋白質(zhì)，包括gag、pol和env等基因編碼的蛋白。在包裝細(xì)胞內(nèi)，重組慢病毒載體和輔助質(zhì)粒共同作用，產(chǎn)生含有shRNA的慢病毒顆粒。這些慢病毒顆粒包含了病毒核心，其中包裹著重組的RNA基因組，該基因組包含了shRNA序列以及其他必要的病毒元件。當(dāng)慢病毒顆粒感染靶細(xì)胞時(shí)，病毒表面的包膜糖蛋白與靶細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，隨后病毒包膜與細(xì)胞膜融合，病毒核心進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在細(xì)胞內(nèi)，病毒攜帶的逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA，形成DNA整合前復(fù)合體。該復(fù)合體能夠穿越核膜，進(jìn)入細(xì)胞核后，在整合酶的作用下，將病毒DNA穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的基因組中。此時(shí)，整合到宿主基因組中的shRNA表達(dá)盒在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制作用下，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生shRNA。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的shRNA在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步發(fā)揮作用。shRNA首先被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶（如Dicer酶）識(shí)別并切割，形成21-23個(gè)核苷酸長度的雙鏈siRNA。這些siRNA與一系列蛋白質(zhì)組裝形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。在ATP的參與下，RISC被激活，其中的解旋酶將siRNA雙鏈解開，形成單鏈siRNA。單鏈siRNA中的反義鏈作為引導(dǎo)鏈，引導(dǎo)RISC識(shí)別并結(jié)合與其互補(bǔ)的靶mRNA序列。一旦RISC與靶mRNA結(jié)合，RISC中的核酸內(nèi)切酶就會(huì)在siRNA與靶mRNA互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域?qū)Π衜RNA進(jìn)行切割，將其降解成小片段。這些小片段隨后被細(xì)胞內(nèi)的外切核酸酶進(jìn)一步降解，從而導(dǎo)致靶mRNA無法翻譯為蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的抑制。在口蹄疫病毒感染的細(xì)胞中，慢病毒介導(dǎo)的shRNA可以特異性地針對(duì)病毒的關(guān)鍵基因（如VP1基因、3D基因等）進(jìn)行干擾。通過抑制這些關(guān)鍵基因的表達(dá)，阻斷病毒的復(fù)制、裝配和釋放過程，從而達(dá)到抑制口蹄疫病毒增殖的目的。例如，針對(duì)VP1基因的shRNA可以切割VP1基因的mRNA，使其無法翻譯為VP1蛋白，而VP1蛋白是病毒衣殼的重要組成部分，缺乏VP1蛋白會(huì)導(dǎo)致病毒無法組裝成完整的病毒粒子，進(jìn)而抑制病毒的感染和傳播能力。3.3慢病毒介導(dǎo)shRNA技術(shù)在基因沉默中的應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)shRNA技術(shù)在基因功能研究、疾病模型構(gòu)建以及基因治療等多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了重要的應(yīng)用價(jià)值，為生命科學(xué)研究和臨床治療提供了有力的工具。在基因功能研究方面，該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)特定基因的穩(wěn)定沉默，從而深入探究基因在細(xì)胞生理過程、發(fā)育機(jī)制以及疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。例如，在細(xì)胞周期調(diào)控的研究中，研究人員利用慢病毒介導(dǎo)shRNA技術(shù)，針對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)基因（如CDK4、CyclinD1等）進(jìn)行沉默。通過將攜帶靶向這些基因shRNA的慢病毒感染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期進(jìn)程受到顯著影響，細(xì)胞增殖速度減慢，細(xì)胞周期分布發(fā)生改變。這表明這些基因在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為進(jìn)一步揭示細(xì)胞周期調(diào)控的分子機(jī)制提供了重要線索。在胚胎發(fā)育研究中，利用慢病毒介導(dǎo)shRNA技術(shù)沉默斑馬魚胚胎發(fā)育相關(guān)基因，觀察到胚胎發(fā)育出現(xiàn)異常，如形態(tài)結(jié)構(gòu)畸形、器官發(fā)育不全等。這有助于明確這些基因在胚胎發(fā)育過程中的功能，為發(fā)育生物學(xué)的研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在疾病模型構(gòu)建領(lǐng)域，慢病毒介導(dǎo)shRNA技術(shù)為模擬人類疾病的發(fā)病機(jī)制提供了有效的手段。以腫瘤疾病模型為例，研究人員通過慢病毒介導(dǎo)shRNA沉默腫瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵致癌基因（如BRAF、KRAS等），可以觀察到腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力受到抑制。將這些沉默關(guān)鍵基因的腫瘤細(xì)胞接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，構(gòu)建成腫瘤移植模型，發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長速度明顯減緩，轉(zhuǎn)移能力降低。這種腫瘤疾病模型能夠更真實(shí)地模擬腫瘤在體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展過程，為腫瘤的發(fā)病機(jī)制研究、藥物研發(fā)和治療方案的優(yōu)化提供了重要的平臺(tái)。在神經(jīng)退行性疾病模型構(gòu)建中，利用慢病毒介導(dǎo)shRNA技術(shù)沉默與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的基因（如APP、PS1等），可以在細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中模擬神經(jīng)退行性疾病的病理特征，如神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)纖維纏結(jié)等。這有助于深入研究神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制，尋找潛在的治療靶點(diǎn)。在基因治療方面，慢病毒介導(dǎo)shRNA技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。對(duì)于一些單基因遺傳性疾病，如囊性纖維化、血友病等，通過慢病毒介導(dǎo)shRNA技術(shù)靶向沉默致病基因或調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的治療。在囊性纖維化的研究中，針對(duì)CFTR基因的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)shRNA，利用慢病毒將其導(dǎo)入患者的呼吸道上皮細(xì)胞中，能夠有效降低突變CFTR基因的表達(dá)，改善細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，從而緩解囊性纖維化的癥狀。在癌癥治療中，慢病毒介導(dǎo)shRNA技術(shù)可以與傳統(tǒng)的化療、放療等方法聯(lián)合使用，增強(qiáng)治療效果。例如，通過慢病毒介導(dǎo)shRNA沉默腫瘤細(xì)胞中的耐藥相關(guān)基因（如MDR1等），可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，增強(qiáng)化療的療效。同時(shí)，慢病毒介導(dǎo)shRNA技術(shù)還可以用于腫瘤的免疫治療，通過沉默腫瘤細(xì)胞中的免疫逃逸相關(guān)基因，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，提高機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。四、兩類細(xì)胞系的選擇與培養(yǎng)4.1非免疫型細(xì)胞系的選擇與特性在本研究中，選擇293T細(xì)胞作為非免疫型細(xì)胞系。293T細(xì)胞是一種人胚腎細(xì)胞系，由293細(xì)胞派生而來，通過基因工程技術(shù)使其表達(dá)SV40大T抗原。這種細(xì)胞系具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，使其在病毒研究領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。293T細(xì)胞的培養(yǎng)條件相對(duì)較為簡單。在常規(guī)培養(yǎng)中，使用高糖DMEM培養(yǎng)基，添加10%的胎牛血清，以提供細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子。同時(shí)，加入1%的雙抗（青霉素和鏈霉素），可有效防止細(xì)菌污染，確保細(xì)胞在無菌環(huán)境中生長。培養(yǎng)環(huán)境需維持在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中，在此條件下，293T細(xì)胞能夠保持良好的生長狀態(tài)，快速增殖。在傳代過程中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，需進(jìn)行傳代操作。傳代時(shí)，首先吸掉細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，用無Ca2?和Mg2?的PBS輕輕洗滌貼壁細(xì)胞兩遍，以去除殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。然后加入少量的0.05%胰蛋白酶-EDTA，放入培養(yǎng)箱溫育20秒左右，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離。待細(xì)胞消化完畢，加入適量培養(yǎng)液終止消化，并輕輕吹打細(xì)胞，制成均勻的細(xì)胞懸液。最后，加入足量的培養(yǎng)液，將細(xì)胞分裝到新的培養(yǎng)瓶中。值得注意的是，293T細(xì)胞的貼壁性不強(qiáng)，在更換培養(yǎng)液或用PBS沖洗時(shí)，應(yīng)小心操作，避免液體沖打到貼壁的細(xì)胞，以免導(dǎo)致細(xì)胞脫落。293T細(xì)胞在病毒研究中具有顯著的優(yōu)勢(shì)。其生長迅速，具有快速的增殖能力，能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得大量細(xì)胞，這對(duì)于需要大量細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的病毒研究來說至關(guān)重要。例如，在病毒生產(chǎn)過程中，需要大量的宿主細(xì)胞來繁殖病毒，293T細(xì)胞的快速增殖特性可以滿足這一需求，提高病毒的生產(chǎn)效率。293T細(xì)胞具有易于轉(zhuǎn)染的特性，能夠高效攝取外源DNA。這使得研究人員可以方便地將外源性基因?qū)爰?xì)胞，進(jìn)行基因功能研究和基因治療研究。在口蹄疫病毒的研究中，可以通過將針對(duì)病毒關(guān)鍵基因的shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，研究其對(duì)病毒增殖的影響。293T細(xì)胞在培養(yǎng)過程中保持較高的遺傳穩(wěn)定性，減少了實(shí)驗(yàn)變異。這為病毒研究提供了穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)材料，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。4.2免疫型細(xì)胞系的選擇與特性在本研究中，選用PK-3細(xì)胞作為免疫型細(xì)胞系。PK-3細(xì)胞屬于豬腎細(xì)胞系，是從豬的腎臟組織中分離培養(yǎng)得到的。豬作為偶蹄動(dòng)物，是口蹄疫病毒的主要宿主之一，因此PK-3細(xì)胞對(duì)口蹄疫病毒具有天然的易感性。這使得PK-3細(xì)胞成為研究口蹄疫病毒感染機(jī)制、病毒與宿主細(xì)胞相互作用以及抗病毒藥物研發(fā)的理想細(xì)胞模型。PK-3細(xì)胞的培養(yǎng)同樣需要在嚴(yán)格的無菌條件下進(jìn)行。其培養(yǎng)條件與293T細(xì)胞有所不同，PK-3細(xì)胞通常使用含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中，為細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境，使其能夠正常生長和增殖。在傳代過程中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)，需進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，先棄去舊培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞兩次，以去除殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，放入培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。待細(xì)胞消化完全，加入含血清的培養(yǎng)液終止消化，并輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液。最后，將細(xì)胞懸液按照適當(dāng)?shù)谋壤盅b到新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。PK-3細(xì)胞具有顯著的免疫相關(guān)特性。當(dāng)口蹄疫病毒感染PK-3細(xì)胞后，細(xì)胞能夠啟動(dòng)一系列天然免疫反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體（PRRs），如Toll樣受體（TLRs）和維甲酸誘導(dǎo)基因I樣受體（RLRs）等，能夠識(shí)別病毒的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如病毒的雙鏈RNA。識(shí)別后，PRRs會(huì)激活下游的信號(hào)通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素（IFN）等細(xì)胞因子。干擾素可以通過與細(xì)胞表面的干擾素受體結(jié)合，激活一系列抗病毒蛋白的表達(dá)，如蛋白激酶R（PKR）、2'-5'-寡腺苷酸合成酶（OAS）等。這些抗病毒蛋白能夠抑制病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，從而限制病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖。PK-3細(xì)胞還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等機(jī)制來應(yīng)對(duì)病毒感染。當(dāng)病毒感染導(dǎo)致細(xì)胞損傷嚴(yán)重時(shí)，PK-3細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)凋亡程序，通過程序性死亡來阻止病毒的進(jìn)一步傳播，保護(hù)周圍的正常細(xì)胞。在本研究中，PK-3細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用。由于其具有免疫相關(guān)特性，能夠更真實(shí)地模擬口蹄疫病毒在免疫細(xì)胞中的感染和增殖過程。通過在PK-3細(xì)胞中構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制FMDV增殖的細(xì)胞系，可以深入研究病毒與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用機(jī)制。研究FMDV如何逃避宿主的免疫反應(yīng)，以及shRNA如何通過調(diào)節(jié)宿主免疫相關(guān)基因的表達(dá)來增強(qiáng)細(xì)胞的抗病毒能力。這對(duì)于開發(fā)新的抗病毒策略和治療方法具有重要的指導(dǎo)意義。同時(shí)，PK-3細(xì)胞系的建立也為篩選和評(píng)價(jià)抗口蹄疫病毒藥物提供了有效的工具。利用該細(xì)胞系可以檢測(cè)藥物對(duì)病毒增殖的抑制效果，評(píng)估藥物的安全性和有效性，為口蹄疫的臨床治療提供更多的選擇。4.3細(xì)胞系的培養(yǎng)與傳代本研究中的293T細(xì)胞和PK-3細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代操作均在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，以確保實(shí)驗(yàn)過程的安全性和規(guī)范性，防止病毒泄漏對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境造成危害。在培養(yǎng)過程中，為293T細(xì)胞和PK-3細(xì)胞提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境至關(guān)重要。293T細(xì)胞使用高糖DMEM培養(yǎng)基，添加10%的胎牛血清和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度保持在70%-80%，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的生長環(huán)境。PK-3細(xì)胞則使用含有10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，同樣在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，包括細(xì)胞的形態(tài)、密度和培養(yǎng)液的顏色變化等。當(dāng)培養(yǎng)液顏色由紅色變?yōu)辄S色時(shí)，說明細(xì)胞代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)增多，培養(yǎng)液的pH值下降，此時(shí)需要及時(shí)更換培養(yǎng)液。一般情況下，293T細(xì)胞和PK-3細(xì)胞每2-3天更換一次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度時(shí)，需進(jìn)行傳代操作，以維持細(xì)胞的良好生長狀態(tài)。293T細(xì)胞傳代時(shí)，先吸掉細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，用無Ca2?和Mg2?的PBS輕輕洗滌貼壁細(xì)胞兩遍，以去除殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。然后加入少量的0.05%胰蛋白酶-EDTA，放入培養(yǎng)箱溫育20秒左右。在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞變圓且大部分細(xì)胞開始脫離瓶壁時(shí)，加入適量培養(yǎng)液終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液。最后，將細(xì)胞懸液按照1:4-1:8的比例分裝到新的培養(yǎng)瓶中，加入足量的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。在傳代過程中，由于293T細(xì)胞貼壁性不強(qiáng)，操作時(shí)要特別小心，避免液體沖打到貼壁的細(xì)胞，以免導(dǎo)致細(xì)胞脫落。PK-3細(xì)胞傳代時(shí)，先棄去舊培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞兩次。加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，放入培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。待細(xì)胞消化完全，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓且大部分細(xì)胞脫離瓶壁后，加入含血清的培養(yǎng)液終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液按照1:3-1:5的比例分裝到新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。在消化過程中，要嚴(yán)格控制消化時(shí)間，避免消化過度導(dǎo)致細(xì)胞損傷。消化時(shí)間過長會(huì)使細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)被過度水解，影響細(xì)胞的活性和貼壁能力。同時(shí)，在吹打細(xì)胞時(shí)，力度要適中，避免產(chǎn)生過多的氣泡，以免對(duì)細(xì)胞造成物理損傷。五、慢病毒介導(dǎo)shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制口蹄疫病毒增殖細(xì)胞系的構(gòu)建5.1shRNA靶序列的設(shè)計(jì)與篩選5.1.1FMDV基因序列分析在構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制FMDV增殖的細(xì)胞系過程中，對(duì)FMDV的基因序列進(jìn)行深入分析是關(guān)鍵的第一步。從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取大量不同血清型和亞型的FMDV全基因組序列，涵蓋了O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1等主要血清型。利用BioEdit、MEGA等生物信息學(xué)軟件對(duì)這些序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，以確定基因的保守區(qū)域。在對(duì)FMDV的2B基因進(jìn)行分析時(shí)，通過多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在2B基因的第100-150位核苷酸區(qū)域，不同血清型的FMDV序列具有較高的同源性。進(jìn)一步分析該區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其形成了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這表明該區(qū)域在病毒的生命周期中可能具有重要的功能，且保守性較高，不易發(fā)生變異。在3D基因中，經(jīng)過細(xì)致的序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)分析，確定了第200-250位核苷酸區(qū)域?yàn)楸Ｊ貐^(qū)域。該區(qū)域編碼的氨基酸序列在不同血清型的FMDV中幾乎完全一致，且該區(qū)域參與了病毒RNA聚合酶的活性中心形成，對(duì)于病毒的復(fù)制過程至關(guān)重要。選擇這些保守區(qū)域作為后續(xù)shRNA靶序列設(shè)計(jì)的目標(biāo)，具有重要的意義。一方面，針對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)的shRNA可以對(duì)多種血清型和亞型的FMDV發(fā)揮抑制作用，提高了RNA干擾的廣譜性。不同血清型的FMDV在這些保守區(qū)域具有相似的序列，因此同一條shRNA可以識(shí)別并結(jié)合不同血清型病毒的mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病毒的干擾。另一方面，保守區(qū)域通常與病毒的關(guān)鍵功能相關(guān)，如病毒的復(fù)制、裝配等。通過干擾保守區(qū)域的基因表達(dá)，可以更有效地阻斷病毒的生命周期，抑制病毒的增殖。針對(duì)3D基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)的shRNA，可以直接影響病毒RNA聚合酶的合成或活性，從而抑制病毒的RNA復(fù)制過程，從根本上遏制病毒的增殖。5.1.2shRNA靶序列的設(shè)計(jì)原則依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，設(shè)計(jì)的shRNA靶序列需與FMDV的mRNA序列高度互補(bǔ)。在設(shè)計(jì)過程中，充分考慮以下因素：從FMDVmRNA序列的起始密碼子AUG開始，仔細(xì)尋找“AA”或“NA”二連序列，并記錄其3'端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的shRNA靶位點(diǎn)。選擇的靶序列第一個(gè)堿基必須為G，以確保RNA聚合酶能夠順利轉(zhuǎn)錄。若目的序列不以G開頭，則在緊連正義鏈的上游添加一個(gè)G。避免選取含有連續(xù)3個(gè)或以上T的序列，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致shRNA轉(zhuǎn)錄的提前終止。盡量避免選擇高GC含量（如GGG和CCC等高GC序列）的區(qū)域。高GC含量的序列容易形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等，這些結(jié)構(gòu)可能會(huì)影響shRNA與靶mRNA的結(jié)合能力。高GC含量的序列還可能導(dǎo)致引物不易變性成單鏈，影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作，如PCR擴(kuò)增、載體構(gòu)建等。選擇的靶序列應(yīng)具有較高的特異性，盡量避免與宿主細(xì)胞基因組中的其他基因序列存在相似性，以減少脫靶效應(yīng)。利用BLAST等生物信息學(xué)工具，將潛在的靶序列與宿主細(xì)胞基因組進(jìn)行比對(duì)，確保其與非目標(biāo)基因的相似性較低。脫靶效應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)非目標(biāo)基因的干擾，影響細(xì)胞的正常生理功能，從而產(chǎn)生假陽性或假陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。選擇的shRNA靶序列應(yīng)盡量位于FMDV基因的編碼區(qū)（CDS區(qū)）。CDS區(qū)是基因中編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域，對(duì)病毒的功能發(fā)揮起著關(guān)鍵作用。干擾CDS區(qū)的基因表達(dá)，可以直接影響病毒蛋白的合成，進(jìn)而抑制病毒的增殖。例如，針對(duì)FMDV的VP1基因的CDS區(qū)設(shè)計(jì)shRNA，能夠有效阻止VP1蛋白的合成，而VP1蛋白是病毒衣殼的重要組成部分，缺乏VP1蛋白會(huì)導(dǎo)致病毒無法組裝成完整的病毒粒子，從而抑制病毒的感染和傳播能力。在正義鏈和反義鏈序列上不能出現(xiàn)連續(xù)3個(gè)或以上的T。這是因?yàn)檫B續(xù)的T序列可能會(huì)被RNA聚合酶Ⅲ識(shí)別為轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，導(dǎo)致shRNA轉(zhuǎn)錄的提前終止，無法產(chǎn)生完整的shRNA分子，從而影響RNA干擾的效果。在設(shè)計(jì)shRNA靶序列時(shí)，需對(duì)正義鏈和反義鏈進(jìn)行仔細(xì)檢查，確保不存在這樣的連續(xù)T序列。5.1.3靶序列的篩選與驗(yàn)證利用RNAiDesign等在線工具，根據(jù)上述設(shè)計(jì)原則，針對(duì)FMDV基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)多條候選shRNA靶序列。將這些候選序列與已知的FMDV基因序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步評(píng)估其特異性和潛在的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。選擇特異性高、脫靶風(fēng)險(xiǎn)低的序列進(jìn)入后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證階段。為了驗(yàn)證候選靶序列的干擾效果，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。將候選shRNA序列構(gòu)建到shRNA表達(dá)載體中，如pLKO.1載體。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組載體轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，提取細(xì)胞總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)FMDV基因的mRNA表達(dá)水平。根據(jù)mRNA表達(dá)水平的變化，初步篩選出干擾效果較好的靶序列。對(duì)初步篩選出的靶序列進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。將攜帶有效靶序列的shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到PK-3細(xì)胞中，感染FMDV。通過觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），如細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞死亡情況等，評(píng)估病毒的增殖情況。利用病毒滴度測(cè)定、免疫熒光染色等方法，檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)水平和病毒粒子的數(shù)量。綜合這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最終用于構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制FMDV增殖細(xì)胞系的有效靶序列。在篩選和驗(yàn)證過程中，嚴(yán)格設(shè)置對(duì)照組是至關(guān)重要的。陰性對(duì)照組包括轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用于排除非特異性干擾和細(xì)胞自身因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。陽性對(duì)照組則采用已知有效的針對(duì)FMDV的抗病毒藥物或已驗(yàn)證的有效shRNA序列，用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系的有效性和可靠性。通過與對(duì)照組的對(duì)比分析，可以更準(zhǔn)確地評(píng)估候選靶序列的干擾效果，確保篩選出的靶序列具有真正的抑制FMDV增殖的能力。5.2慢病毒載體與shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建5.2.1載體構(gòu)建所需材料與工具本研究中載體構(gòu)建所需的材料與工具涵蓋了多種關(guān)鍵試劑和儀器設(shè)備。材料方面，選用pLKO.1質(zhì)粒作為慢病毒載體的基礎(chǔ)骨架，該質(zhì)粒具有高效表達(dá)、穩(wěn)定整合等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于基因傳遞和RNA干擾研究。同時(shí)，準(zhǔn)備psPAX2和pMD2.G輔助質(zhì)粒，它們?cè)诼《景b過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。psPAX2質(zhì)粒能夠提供慢病毒包裝所需的核心蛋白，如gag、pol等，這些蛋白參與病毒粒子的組裝和成熟過程；pMD2.G質(zhì)粒則編碼包膜糖蛋白，賦予慢病毒感染宿主細(xì)胞的能力。針對(duì)FMDV基因設(shè)計(jì)并合成特異性的shRNA序列，這些序列是實(shí)現(xiàn)對(duì)FMDV基因沉默的關(guān)鍵元件。在酶類方面，使用限制性內(nèi)切酶AgeI和EcoRI，它們能夠識(shí)別并切割特定的DNA序列，用于將shRNA序列準(zhǔn)確地插入到pLKO.1載體中。T4DNA連接酶則用于連接載體和插入片段，形成重組質(zhì)粒。此外，還準(zhǔn)備了DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、PCR擴(kuò)增所需的dNTPs、TaqDNA聚合酶等試劑，用于質(zhì)粒鑒定和相關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。儀器設(shè)備方面，主要包括PCR儀，用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)目的基因的大量擴(kuò)增。離心機(jī)在質(zhì)粒提取、病毒濃縮等步驟中發(fā)揮重要作用，通過高速離心可以分離不同密度的物質(zhì)。電泳儀及電泳槽用于進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過電泳可以分離和鑒定DNA片段，判斷質(zhì)粒的構(gòu)建是否成功。恒溫培養(yǎng)箱為細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化提供適宜的溫度和濕度環(huán)境，確保細(xì)胞的正常生長和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率。超凈工作臺(tái)則提供了一個(gè)無菌的操作環(huán)境，有效防止實(shí)驗(yàn)過程中的微生物污染，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。5.2.2慢病毒載體的構(gòu)建過程慢病毒載體的構(gòu)建是一個(gè)精細(xì)且關(guān)鍵的過程，涉及多個(gè)步驟和技術(shù)要點(diǎn)。首先，對(duì)pLKO.1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理。將pLKO.1質(zhì)粒與限制性內(nèi)切酶AgeI和EcoRI按照適當(dāng)?shù)谋壤旌?，加入相?yīng)的緩沖液，在37℃的恒溫條件下孵育2-3小時(shí)。這兩種限制性內(nèi)切酶能夠特異性地識(shí)別pLKO.1質(zhì)粒上的特定序列，并在相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行切割，從而在質(zhì)粒上產(chǎn)生粘性末端，為后續(xù)shRNA序列的插入提供了條件。酶切反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒定。將酶切后的產(chǎn)物加入到含有溴化乙錠（EB）的瓊脂糖凝膠中，在一定電壓下進(jìn)行電泳。由于不同長度的DNA片段在電場中的遷移速度不同，經(jīng)過一段時(shí)間的電泳后，酶切后的pLKO.1質(zhì)粒片段會(huì)在凝膠上呈現(xiàn)出特定的條帶位置。使用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)作為參照，通過觀察凝膠上條帶的位置和大小，可以判斷酶切是否成功，以及酶切后的質(zhì)粒片段是否符合預(yù)期大小。若酶切成功，將含有目的片段的凝膠條帶從凝膠中切下，利用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。膠回收試劑盒利用特殊的硅基質(zhì)材料在高鹽緩沖系統(tǒng)下能夠高效、專一地吸附DNA的原理，通過離心吸附柱式結(jié)構(gòu)，在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)DNA片段的高效回收，去除雜質(zhì)和未切割的質(zhì)粒，得到純凈的酶切后pLKO.1質(zhì)粒片段。在shRNA序列的準(zhǔn)備階段，根據(jù)前期設(shè)計(jì)并篩選出的針對(duì)FMDV基因的有效shRNA序列，進(jìn)行化學(xué)合成。合成的shRNA序列通常為兩條互補(bǔ)的寡核苷酸鏈，在其兩端添加與pLKO.1質(zhì)粒酶切位點(diǎn)相匹配的粘性末端序列，以便后續(xù)的連接反應(yīng)。將合成的兩條寡核苷酸鏈進(jìn)行退火處理，使其形成雙鏈結(jié)構(gòu)。退火過程中，將兩條寡核苷酸鏈混合，加入適量的退火緩沖液，先在95℃的高溫下變性5分鐘，使雙鏈解開，然后緩慢降溫至室溫，使兩條鏈重新互補(bǔ)配對(duì)，形成穩(wěn)定的雙鏈shRNA結(jié)構(gòu)。完成pLKO.1質(zhì)粒的酶切回收和shRNA序列的退火處理后，進(jìn)行連接反應(yīng)。將酶切回收的pLKO.1質(zhì)粒片段與退火后的雙鏈shRNA按照一定的摩爾比混合，加入T4DNA連接酶和連接緩沖液，在16℃的恒溫條件下連接過夜。T4DNA連接酶能夠催化質(zhì)粒和shRNA之間的磷酸二酯鍵形成，使shRNA序列成功插入到pLKO.1質(zhì)粒中，構(gòu)建成重組慢病毒載體。連接反應(yīng)結(jié)束后，將重組慢病毒載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，如DH5α感受態(tài)細(xì)胞。利用熱激法或電轉(zhuǎn)法等轉(zhuǎn)化方法，使重組質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有相應(yīng)抗生素（如氨芐青霉素）的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。由于重組質(zhì)粒上攜帶了抗生素抗性基因，只有成功轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含有抗生素的培養(yǎng)基上生長，形成菌落。通過挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，利用PCR、酶切鑒定和測(cè)序等方法，對(duì)重組慢病毒載體進(jìn)行驗(yàn)證，確保shRNA序列正確插入到pLKO.1質(zhì)粒中，且序列無突變。5.2.3shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定構(gòu)建shRNA表達(dá)載體時(shí)，同樣以pLKO.1質(zhì)粒為基礎(chǔ)。將合成的帶有特定酶切位點(diǎn)的shRNA雙鏈寡核苷酸與經(jīng)過AgeI和EcoRI雙酶切的pLKO.1質(zhì)粒在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系中各成分的比例和反應(yīng)條件與慢病毒載體構(gòu)建時(shí)的連接反應(yīng)類似，在16℃下連接過夜，以確保shRNA雙鏈寡核苷酸能夠高效地插入到pLKO.1質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中。連接完成后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。熱激處理后，迅速將細(xì)胞置于冰上冷卻，然后加入不含抗生素的LB培養(yǎng)基，在37℃搖床中振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)胞恢復(fù)生長并表達(dá)抗生素抗性基因。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜，篩選出含有重組質(zhì)粒的陽性克隆。為了鑒定構(gòu)建的shRNA表達(dá)載體是否正確，采用菌落PCR和酶切鑒定相結(jié)合的方法。首先進(jìn)行菌落PCR，挑取平板上的單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。以培養(yǎng)后的菌液為模板，使用針對(duì)shRNA插入片段和pLKO.1質(zhì)粒特定區(qū)域設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和條件根據(jù)所用的TaqDNA聚合酶說明書進(jìn)行設(shè)置，一般包括95℃預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)的95℃變性30秒、55-60℃退火30秒、72℃延伸30-60秒，最后72℃延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。如果構(gòu)建正確，在凝膠上應(yīng)出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶。接著進(jìn)行酶切鑒定，從菌落PCR鑒定為陽性的克隆中提取質(zhì)粒。使用與構(gòu)建時(shí)相同的限制性內(nèi)切酶AgeI和EcoRI對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切體系和反應(yīng)條件與構(gòu)建時(shí)的酶切反應(yīng)一致。酶切產(chǎn)物同樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。若構(gòu)建正確，酶切后應(yīng)得到與預(yù)期大小相符的pLKO.1質(zhì)粒片段和shRNA插入片段，在凝膠上呈現(xiàn)出兩條清晰的條帶。為了進(jìn)一步確認(rèn)shRNA表達(dá)載體中插入的shRNA序列的準(zhǔn)確性，對(duì)經(jīng)過菌落PCR和酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。將重組質(zhì)粒送至專業(yè)的測(cè)序公司，采用Sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與原始設(shè)計(jì)的shRNA序列進(jìn)行比對(duì)，確保插入的shRNA序列完全正確，無堿基突變、缺失或插入等情況。通過以上嚴(yán)格的構(gòu)建和鑒定過程，確保成功構(gòu)建出準(zhǔn)確無誤的shRNA表達(dá)載體，為后續(xù)慢病毒介導(dǎo)shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制FMDV增殖細(xì)胞系的構(gòu)建奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。5.3慢病毒的包裝與滴度測(cè)定5.3.1慢病毒包裝的原理與方法在293T細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒包裝，主要依賴于三質(zhì)粒系統(tǒng)，包括攜帶shRNA表達(dá)盒的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、psPAX2包裝質(zhì)粒以及pMD2.G包膜質(zhì)粒。這一過程的原理基于病毒的天然生命周期和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。psPAX2包裝質(zhì)粒攜帶了編碼gag、pol等病毒核心蛋白的基因。gag基因編碼的蛋白是構(gòu)成病毒核心結(jié)構(gòu)的重要組成部分，它們參與病毒粒子的組裝，形成病毒的外殼框架。pol基因編碼的蛋白則具有多種關(guān)鍵酶活性，其中逆轉(zhuǎn)錄酶能夠?qū)⒉《綬NA反轉(zhuǎn)錄為DNA，整合酶負(fù)責(zé)將反轉(zhuǎn)錄后的DNA整合到宿主細(xì)胞基因組中。這些蛋白在病毒的復(fù)制和傳播過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。pMD2.G包膜質(zhì)粒編碼VSV-G包膜糖蛋白，這種糖蛋白賦予了慢病毒廣泛的宿主細(xì)胞感染能力。VSV-G糖蛋白能夠與多種細(xì)胞表面的受體結(jié)合，使得慢病毒能夠突破細(xì)胞膜的屏障，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。攜帶shRNA表達(dá)盒的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒是實(shí)現(xiàn)對(duì)FMDV基因沉默的關(guān)鍵元件。它包含了shRNA表達(dá)所需的啟動(dòng)子（如U6啟動(dòng)子）和shRNA序列。當(dāng)這些質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中后，細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制被激活。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生攜帶shRNA的病毒RNA，psPAX2包裝質(zhì)粒表達(dá)的核心蛋白與病毒RNA結(jié)合，組裝成病毒核心顆粒。pMD2.G包膜質(zhì)粒表達(dá)的VSV-G包膜糖蛋白則包裹在病毒核心顆粒表面，形成完整的慢病毒粒子。這些慢病毒粒子隨后被分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。具體操作流程如下：在轉(zhuǎn)染前一天，將生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞接種于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，接種密度控制在使得第二天細(xì)胞匯合度能達(dá)到30%-50%為宜。這是因?yàn)樘幱趯?duì)數(shù)生長期且密度適中的細(xì)胞具有較高的代謝活性和增殖能力，能夠更好地?cái)z取外源質(zhì)粒并進(jìn)行后續(xù)的病毒包裝過程。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將DMEM培養(yǎng)基和慢病毒包裝專用轉(zhuǎn)染試劑LentiFitTM恢復(fù)至室溫，并充分搖勻。按照載體質(zhì)粒:psPAX2:pMD2.G=4:3:1的比例（此比例經(jīng)過前期優(yōu)化，可根據(jù)實(shí)際情況微調(diào)，以獲得最佳的病毒包裝效率），準(zhǔn)確稱取相應(yīng)質(zhì)量的質(zhì)粒，將其加入到500μlOpti-MEM無血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻。取適量的LentiFitTM轉(zhuǎn)染試劑加入到另500μlOpti-MEM無血清培養(yǎng)基中，同樣混合均勻，并室溫靜置5分鐘。將稀釋后的質(zhì)粒溶液與轉(zhuǎn)染試劑溶液輕柔混合，常溫靜置20分鐘，使其充分反應(yīng)形成DNA-LentiFitTM復(fù)合體。將形成的復(fù)合體緩慢滴加至293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖晃培養(yǎng)皿，使復(fù)合體均勻分布于細(xì)胞表面。將培養(yǎng)皿放回37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基，以去除未結(jié)合的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑，減少對(duì)細(xì)胞的毒性影響。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)，分別收集含有慢病毒粒子的細(xì)胞培養(yǎng)上清。收集48小時(shí)上清后，及時(shí)向培養(yǎng)皿中補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基，以維持細(xì)胞的正常生長和病毒的持續(xù)產(chǎn)生。將收集到的上清液用0.45μm濾器過濾，去除其中的細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，得到初步純化的慢病毒液。5.3.2慢病毒滴度測(cè)定的方法與意義常用的慢病毒滴度測(cè)定方法為熒光定量PCR。該方法基于熒光標(biāo)記的引物和探針，通過對(duì)慢病毒基因組中的特定序列進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)慢病毒滴度的精確測(cè)定。具體操作時(shí)，首先提取慢病毒的核酸，將其作為模板加入到熒光定量PCR反應(yīng)體系中。反應(yīng)體系中包含熒光標(biāo)記的引物、探針、dNTPs、TaqDNA聚合酶等成分。引物和探針特異性地結(jié)合到慢病毒基因組的目標(biāo)序列上，在TaqDNA聚合酶的作用下，以慢病毒核酸為模板進(jìn)行擴(kuò)增。隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號(hào)不斷增強(qiáng)。通過與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算出慢病毒的滴度。慢病毒滴度測(cè)定對(duì)本實(shí)驗(yàn)具有至關(guān)重要的意義。滴度反映了單位體積病毒液中具有感染活性的病毒顆粒數(shù)量，是評(píng)估慢病毒質(zhì)量和感染能力的關(guān)鍵指標(biāo)。在構(gòu)建穩(wěn)定抑制FMDV增殖的細(xì)胞系過程中，準(zhǔn)確的滴度測(cè)定有助于確定合適的感染復(fù)數(shù)（MOI）。MOI是指感染時(shí)病毒與細(xì)胞的數(shù)量比例，不同的MOI會(huì)影響病毒感染細(xì)胞的效率和對(duì)細(xì)胞的毒性。如果MOI過低，病毒可能無法有效感染足夠數(shù)量的細(xì)胞，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)FMDV基因的有效沉默和病毒增殖的抑制。如果MOI過高，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成過度損傷，影響細(xì)胞的正常生理功能，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。通過準(zhǔn)確測(cè)定慢病毒滴度，能夠根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求精確調(diào)整MOI，提高病毒感染細(xì)胞的效率，確保慢病毒能夠穩(wěn)定地將shRNA導(dǎo)入細(xì)胞，并持續(xù)表達(dá)發(fā)揮作用。這對(duì)于后續(xù)驗(yàn)證慢病毒介導(dǎo)shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制FMDV增殖的效果具有重要的保障作用，為實(shí)驗(yàn)的成功進(jìn)行提供了關(guān)鍵的數(shù)據(jù)支持。5.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選5.4.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法與優(yōu)化在本研究中，針對(duì)293T細(xì)胞和PK-3細(xì)胞，分別采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和電穿孔法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，提高轉(zhuǎn)染效率。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是一種常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，其原理是利用陽離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電荷的核酸通過靜電作用形成復(fù)合物，然后復(fù)合物通過與細(xì)胞膜的融合或內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)，選用Lipofectamine2000作為轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染前，將293T細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種密度為5×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到70%-80%。根據(jù)Lipofectamine2000的說明書，將重組慢病毒載體與Lipofectamine2000按照不同的比例（如1:1、1:2、1:3等）混合，加入Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中，輕柔混勻，室溫靜置20分鐘，使脂質(zhì)體與質(zhì)粒充分結(jié)合形成復(fù)合物。將復(fù)合物緩慢加入到含有293T細(xì)胞的孔中，輕輕搖晃6孔板，使復(fù)合物均勻分布于細(xì)胞表面。將6孔板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4-6小時(shí)后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。通過觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)、熒光表達(dá)情況（若重組慢病毒載體攜帶熒光標(biāo)記）以及檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)shRNA的表達(dá)水平（如通過qRT-PCR檢測(cè)），評(píng)估不同比例下的轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)重組慢病毒載體與Lipofectamine2000的比例為1:2時(shí)，293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，shRNA的表達(dá)水平也相對(duì)較高。電穿孔法是利用高壓電脈沖在細(xì)胞膜上形成瞬間小孔，使外源DNA能夠通過這些小孔進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在對(duì)PK-3細(xì)胞進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染時(shí)，首先將PK-3細(xì)胞收集，用PBS洗滌兩次后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。將10μg的重組慢病毒載體與100μL的細(xì)胞懸液混合，轉(zhuǎn)移至電穿孔杯中。設(shè)置不同的電穿孔參數(shù)，如電壓（200V、250V、300V等）、脈沖時(shí)間（10ms、20ms、30ms等）和脈沖次數(shù)（1次、2次、3次等）。將電穿孔杯放入電穿孔儀中，按照設(shè)定的參數(shù)進(jìn)行電穿孔操作。電穿孔結(jié)束后，迅速將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過觀察細(xì)胞的存活率、熒光表達(dá)情況以及檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)shRNA的表達(dá)水平，評(píng)估不同電穿孔參數(shù)下的轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)電壓為250V、脈沖時(shí)間為20ms、脈沖次數(shù)為2次時(shí)，PK-3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高，細(xì)胞存活率也能維持在相對(duì)較高的水平。通過對(duì)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和電穿孔法的對(duì)比和優(yōu)化，確定了適合293T細(xì)胞和PK-3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件。這不僅提高了重組慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率，確保了shRNA能夠有效地導(dǎo)入細(xì)胞，還減少了轉(zhuǎn)染過程對(duì)細(xì)胞的損傷，為后續(xù)穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選和病毒增殖抑制效果的驗(yàn)證奠定了良好的基礎(chǔ)。5.4.2穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選策略與過程利用重組慢病毒載體上攜帶的嘌呤霉素抗性基因，采用嘌呤霉素篩選法來獲得穩(wěn)定表達(dá)shRNA的細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，只有成功轉(zhuǎn)染并整合了重組慢病毒載體的細(xì)胞才能在這種選擇性培養(yǎng)基中存活和增殖。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將293T細(xì)胞和PK-3細(xì)胞更換為含有嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基。嘌呤霉素的初始篩選濃度設(shè)定為2μg/mL，對(duì)于293T細(xì)胞，在篩選過程中，每天觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和存活情況。隨著篩選的進(jìn)行，未成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞逐漸死亡，而成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則開始形成克隆。在篩選的第3天，部分未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞出現(xiàn)明顯的死亡跡象，細(xì)胞形態(tài)變圓，貼壁能力下降。到第7天，大部分未轉(zhuǎn)染細(xì)胞已死亡，而成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆逐漸清晰可見。對(duì)于PK-3細(xì)胞，同樣在含有2μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。由于PK-3細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素的耐受性相對(duì)較低，在篩選初期，細(xì)胞死亡現(xiàn)象較為明顯。在篩選的第2天，就有較多的未轉(zhuǎn)染P