成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義腦缺血是一種嚴(yán)重威脅人類健康的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)。當(dāng)腦缺血發(fā)生后，及時(shí)恢復(fù)血液供應(yīng)是挽救腦組織的關(guān)鍵，但恢復(fù)血流灌注后，往往會(huì)引發(fā)一系列復(fù)雜的病理生理變化，即腦缺血再灌注損傷（CerebralIschemia-ReperfusionInjury，CIRI）。這種損傷會(huì)導(dǎo)致腦組織進(jìn)一步受損，加重神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球每年有大量人口因腦缺血相關(guān)疾病而死亡或致殘，給家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。CIRI的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、鈣超載等多個(gè)病理過程。其中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（EndoplasmicReticulumStress，ERS）近年來被認(rèn)為在CIRI中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊和運(yùn)輸?shù)闹匾獔?chǎng)所，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞受到缺血再灌注等應(yīng)激刺激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能會(huì)受到干擾，導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量積累，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活未折疊蛋白反應(yīng)（UnfoldedProteinResponse，UPR），這是細(xì)胞為了應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而啟動(dòng)的一種自我保護(hù)機(jī)制。在輕度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，UPR通過上調(diào)分子伴侶表達(dá)、減少蛋白質(zhì)合成等方式，幫助恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，維持細(xì)胞的存活。但當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過度或持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，UPR則會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，加重腦缺血再灌注損傷。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FibroblastGrowthFactor，F(xiàn)GF）是一類具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子家族，在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、血管生成等生理過程中發(fā)揮著重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF在神經(jīng)系統(tǒng)中也具有重要的保護(hù)作用，能夠促進(jìn)神經(jīng)元的存活、增殖和分化，抑制神經(jīng)元凋亡，對(duì)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有潛在的治療價(jià)值。FGF家族成員眾多，不同成員在結(jié)構(gòu)和功能上既有相似性，又有特異性。其中，一些FGF成員已被證實(shí)能夠通過多種信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。FGF可以通過激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而減少神經(jīng)元凋亡；還可以通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷。深入研究FGF通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路對(duì)小鼠全腦缺血再灌注的保護(hù)作用機(jī)制，具有重要的理論和實(shí)踐意義。在理論方面，有助于進(jìn)一步揭示腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制，拓展對(duì)FGF神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究提供新的思路和方向。在實(shí)踐方面，有望為腦缺血相關(guān)疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和策略，開發(fā)出更有效的治療藥物，提高患者的治療效果和生活質(zhì)量，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入探討FGF通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其分子機(jī)制，為腦缺血相關(guān)疾病的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體而言，研究目的包括以下幾個(gè)方面：明確FGF對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用：通過建立小鼠全腦缺血再灌注模型，觀察給予FGF干預(yù)后，小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積、腦組織形態(tài)學(xué)變化等指標(biāo)的改變，明確FGF對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷是否具有保護(hù)作用。揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路在小鼠全腦缺血再灌注損傷中的作用：檢測(cè)小鼠全腦缺血再灌注模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白（如GRP78、CHOP等）的表達(dá)變化，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵信號(hào)通路（如PERK、IRE1α、ATF6等通路）的激活情況，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路在小鼠全腦缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展過程中的作用。探究FGF是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用：在給予FGF干預(yù)的小鼠全腦缺血再灌注模型中，同時(shí)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)（如使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑或激活劑），觀察FGF的保護(hù)作用是否受到影響。通過檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)、信號(hào)通路激活情況以及神經(jīng)功能和腦組織損傷指標(biāo)，明確FGF是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。確定FGF干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)：進(jìn)一步深入研究FGF作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的具體分子機(jī)制，確定FGF干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，為開發(fā)基于FGF的腦缺血治療藥物提供精準(zhǔn)的作用靶點(diǎn)和理論支持。基于以上研究目的，提出以下關(guān)鍵科學(xué)問題：FGF如何影響小鼠全腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能和腦組織損傷程度？?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路在小鼠全腦缺血再灌注損傷中如何被激活，其激活對(duì)損傷進(jìn)程有何影響？FGF是否能夠調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路，從而減輕小鼠全腦缺血再灌注損傷？如果是，其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制是什么？FGF作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)是什么，如何通過調(diào)控這些靶點(diǎn)來增強(qiáng)FGF的神經(jīng)保護(hù)作用？能否基于FGF對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制，開發(fā)出有效的腦缺血治療策略？1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與分組：選用健康成年雄性C57BL/6小鼠，體重20-25g，購自正規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將小鼠隨機(jī)分為以下幾組：假手術(shù)組（Sham組）、腦缺血再灌注組（I/R組）、FGF治療組（FGF+I/R組）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑+FGF治療組（ERSi+FGF+I/R組）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑+FGF治療組（ERSa+FGF+I/R組），每組10只小鼠。小鼠全腦缺血再灌注模型的建立：采用四血管阻斷法建立小鼠全腦缺血再灌注模型。小鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3ml/100g體重）后，固定于立體定位儀上。分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈和椎動(dòng)脈，通過電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈，然后用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，造成全腦缺血。缺血30min后，松開動(dòng)脈夾恢復(fù)血流灌注，實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組小鼠僅進(jìn)行手術(shù)操作，但不夾閉動(dòng)脈。干預(yù)措施：在再灌注開始時(shí)，F(xiàn)GF治療組小鼠尾靜脈注射FGF溶液（10μg/kg體重）；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑+FGF治療組小鼠先腹腔注射內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸（4-PBA，50mg/kg體重），30min后尾靜脈注射FGF溶液；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑+FGF治療組小鼠先腹腔注射內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑毒胡蘿卜素（TG，0.1mg/kg體重），30min后尾靜脈注射FGF溶液。Sham組和I/R組小鼠給予等量生理鹽水尾靜脈注射。神經(jīng)功能缺損評(píng)分：在再灌注后24h、48h和72h，采用Longa評(píng)分法對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無神經(jīng)功能缺損；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。腦梗死體積測(cè)定：再灌注72h后，將小鼠斷頭取腦，將大腦冠狀切成2mm厚的腦片，放入2%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液中，37℃避光孵育30min。正常腦組織被染成紅色，梗死腦組織呈白色。使用圖像分析軟件計(jì)算腦梗死體積百分比。腦組織形態(tài)學(xué)觀察：取部分腦組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為5μm。進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化，包括神經(jīng)元形態(tài)、細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。免疫組織化學(xué)檢測(cè)：檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白（如GRP78、CHOP等）以及FGF信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和定位。具體步驟如下：石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，微波抗原修復(fù)，正常山羊血清封閉。分別加入一抗（如抗GRP78抗體、抗CHOP抗體等），4℃孵育過夜。次日，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min，再加入鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC），DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察陽性染色情況，并用圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）檢測(cè)：提取腦組織總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶封閉2h，加入一抗（如抗GRP78抗體、抗CHOP抗體、抗磷酸化PERK抗體、抗磷酸化IRE1α抗體、抗ATF6抗體等），4℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。1.3.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)：選用小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。氧糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）模型的建立：將HT22細(xì)胞接種于6孔板或96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用無糖Earle's平衡鹽溶液（EBSS）替換正常培養(yǎng)基，并置于厭氧培養(yǎng)箱中（95%N?、5%CO?），37℃孵育2h，模擬缺血缺氧狀態(tài)，即氧糖剝奪。然后更換為正常培養(yǎng)基，置于正常培養(yǎng)箱中復(fù)氧24h，模擬再灌注過程。干預(yù)措施：在復(fù)氧開始時(shí)，F(xiàn)GF治療組加入FGF溶液（終濃度為10ng/ml）；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑+FGF治療組先加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA（終濃度為5mmol/L）預(yù)處理1h，再加入FGF溶液；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑+FGF治療組先加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑TG（終濃度為1μmol/L）預(yù)處理1h，再加入FGF溶液。對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)基。細(xì)胞活力檢測(cè)：采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。在復(fù)氧24h后，向96孔板中每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞活力百分比。細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。在復(fù)氧24h后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞。按照試劑盒說明書加入AnnexinV-FITC和PI，避光孵育15min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)：提取細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因（如Grp78、Chop等）以及FGF信號(hào)通路相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。使用SYBRGreen染料法，反應(yīng)體系為20μl，包括10μlSYBRGreenMasterMix、0.5μl上下游引物（10μmol/L）、2μlcDNA模板和7μlddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。免疫熒光染色檢測(cè)：檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和FGF信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位。將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，進(jìn)行OGD/R處理和相應(yīng)干預(yù)。復(fù)氧24h后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，0.1%TritonX-100透化10min，5%牛血清白蛋白（BSA）封閉30min。分別加入一抗（如抗GRP78抗體、抗CHOP抗體等），4℃孵育過夜。次日，加入熒光素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，DAPI染核5min。用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。1.3.3技術(shù)路線圖本研究的技術(shù)路線圖如圖1所示：[此處插入技術(shù)路線圖，圖中應(yīng)清晰展示動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的各個(gè)步驟、分組情況以及檢測(cè)指標(biāo)之間的邏輯關(guān)系]技術(shù)路線圖清晰展示了從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞的選擇、模型建立、干預(yù)措施的實(shí)施到各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的測(cè)定以及最終數(shù)據(jù)分析的整個(gè)研究流程，確保研究的科學(xué)性和系統(tǒng)性，為深入探究FGF通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制提供了明確的指導(dǎo)。二、相關(guān)理論與研究現(xiàn)狀2.1小鼠全腦缺血再灌注模型概述2.1.1模型構(gòu)建方法雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉法：選用健康成年小鼠，通常為C57BL/6小鼠，體重在20-25g之間。實(shí)驗(yàn)前將小鼠禁食12小時(shí)，不禁水，以減少胃腸道內(nèi)容物對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，劑量為0.3-0.4ml/100g體重，待小鼠麻醉后，將其仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部剃毛并消毒。沿頸部正中切開皮膚，鈍性分離頸部肌肉，暴露頸動(dòng)脈鞘，小心分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈及迷走神經(jīng)，避免損傷血管和神經(jīng)。在雙側(cè)頸總動(dòng)脈下穿兩根4-0號(hào)絲線備用。用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，阻斷血流，造成全腦缺血。缺血時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求而定，一般為10-30分鐘。缺血結(jié)束后，松開動(dòng)脈夾，恢復(fù)血流灌注，實(shí)現(xiàn)再灌注。再灌注時(shí)間也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行調(diào)整，通常為24-72小時(shí)。最后，逐層縫合頸部皮膚，消毒傷口，將小鼠置于溫暖的環(huán)境中蘇醒。四血管阻斷法：同樣選用健康成年小鼠，麻醉方式與雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉法相同。先將小鼠俯臥位固定，在頸后部正中切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露第一頸椎的橫突翼孔。使用電凝針插入翼孔，灼燒雙側(cè)椎動(dòng)脈，使其永久性閉塞。操作時(shí)需注意控制電凝強(qiáng)度和時(shí)間，避免損傷周圍組織。24小時(shí)后，將小鼠改為仰臥位，在頸部正中切開皮膚，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線備用。用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，缺血30分鐘后松開動(dòng)脈夾，恢復(fù)再灌注。該方法可造成較為嚴(yán)重的全腦缺血，常用于研究缺血性腦損傷的機(jī)制和治療方法。光化學(xué)法：實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)麻醉后，將其固定于立體定位儀上。在小鼠顱骨表面涂抹適量的光敏感劑，如孟加拉玫瑰紅或虎紅。使用特定波長(zhǎng)的光源，如532nm的激光，照射小鼠顱骨特定區(qū)域，使光敏感劑產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致局部腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，形成血栓，阻斷血流，造成腦缺血。缺血一段時(shí)間后，停止光照，可觀察再灌注過程。光化學(xué)法可精確控制缺血部位和范圍，但設(shè)備昂貴，操作相對(duì)復(fù)雜。2.1.2模型評(píng)價(jià)指標(biāo)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：Longa評(píng)分是常用的評(píng)價(jià)小鼠神經(jīng)功能缺損程度的方法之一。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無神經(jīng)功能缺損，小鼠活動(dòng)正常；1分，小鼠不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，小鼠向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，小鼠向?qū)?cè)傾倒；4分，小鼠不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。再灌注后24-72小時(shí)進(jìn)行評(píng)分，分?jǐn)?shù)越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS）則從運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡和反射等多個(gè)方面對(duì)小鼠神經(jīng)功能進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，包括提尾實(shí)驗(yàn)、肢體伸展實(shí)驗(yàn)、攀爬實(shí)驗(yàn)、平衡木實(shí)驗(yàn)等多個(gè)項(xiàng)目，每個(gè)項(xiàng)目根據(jù)表現(xiàn)給予相應(yīng)分?jǐn)?shù)，總分為0-18分，分?jǐn)?shù)越高表示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。腦梗死體積測(cè)定：再灌注72小時(shí)后，將小鼠斷頭取腦，將大腦冠狀切成2-3mm厚的腦片。將腦片放入2%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液中，37℃避光孵育20-30分鐘。正常腦組織被染成紅色，梗死腦組織呈白色。使用圖像分析軟件，如ImageJ，計(jì)算梗死區(qū)域面積，并根據(jù)腦片厚度計(jì)算腦梗死體積百分比。腦梗死體積百分比=（梗死區(qū)域體積/全腦體積）×100%。腦組織形態(tài)學(xué)觀察：取部分腦組織，用4%多聚甲醛固定24小時(shí)以上，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為5μm。進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化，包括神經(jīng)元形態(tài)、細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。正常神經(jīng)元細(xì)胞核大而圓，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)均勻；缺血再灌注損傷后，神經(jīng)元出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、碎裂，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，細(xì)胞間隙增寬，可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。免疫組織化學(xué)檢測(cè)：檢測(cè)腦組織中與缺血再灌注損傷相關(guān)的標(biāo)志物，如神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）等的表達(dá)和定位。通過免疫組織化學(xué)染色，觀察這些標(biāo)志物在腦組織中的分布和表達(dá)強(qiáng)度，可進(jìn)一步了解神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的損傷情況。NSE在正常神經(jīng)元中表達(dá)較高，缺血再灌注損傷后，其表達(dá)可能會(huì)發(fā)生變化；GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，在腦損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)發(fā)生增生和活化，GFAP表達(dá)上調(diào)。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）檢測(cè)：提取腦組織總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶封閉2小時(shí)，加入一抗，如抗凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的抗體，抗炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的抗體等，4℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以評(píng)估缺血再灌注損傷引起的蛋白質(zhì)表達(dá)變化。2.2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路解析2.2.1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的產(chǎn)生機(jī)制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊和修飾的關(guān)鍵場(chǎng)所，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用。在正常生理狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)能夠高效地完成蛋白質(zhì)的合成和折疊過程，確保細(xì)胞功能的正常運(yùn)行。然而，當(dāng)細(xì)胞受到各種應(yīng)激刺激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能會(huì)受到嚴(yán)重干擾，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。腦缺血再灌注損傷是導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生的重要原因之一。在腦缺血階段，由于血液供應(yīng)的中斷，神經(jīng)元會(huì)面臨嚴(yán)重的缺氧和能量代謝障礙。這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的ATP水平急劇下降，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊所需的能量供應(yīng)。同時(shí)，缺氧還會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）。ROS具有極強(qiáng)的氧化活性，能夠攻擊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞和功能的喪失，進(jìn)而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。當(dāng)缺血腦組織恢復(fù)血液灌注后，雖然氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得以重新供應(yīng)，但此時(shí)卻會(huì)引發(fā)一系列復(fù)雜的病理生理變化，進(jìn)一步加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。再灌注過程中，大量的ROS會(huì)在短時(shí)間內(nèi)爆發(fā)性產(chǎn)生，這是由于缺血期間積累的大量次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下，與重新供應(yīng)的氧氣發(fā)生反應(yīng)，生成大量的超氧陰離子等ROS。此外，再灌注還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，大量的鈣離子內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)重要的鈣離子儲(chǔ)存庫，其鈣離子平衡也會(huì)受到嚴(yán)重影響。過多的鈣離子會(huì)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一些酶類，如鈣蛋白酶等，這些酶會(huì)降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量積累，從而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的積累是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生的核心機(jī)制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在著一套精密的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)，包括多種分子伴侶和折疊酶，它們能夠協(xié)助新生蛋白質(zhì)正確折疊，并識(shí)別和處理未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到缺血再灌注等應(yīng)激刺激時(shí)，蛋白質(zhì)合成和折疊過程受到干擾，導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的產(chǎn)生速度超過了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的處理能力。這些異常蛋白會(huì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)逐漸積累，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶，如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78），也被稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（BiP），它是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵標(biāo)志物和調(diào)節(jié)分子。在正常情況下，GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器（如IRE1、PERK和ATF6）結(jié)合，維持它們的非活性狀態(tài)。當(dāng)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白積累時(shí)，GRP78會(huì)與這些異常蛋白結(jié)合，從而釋放出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器，使其激活，進(jìn)而啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路。2.2.2信號(hào)通路組成及關(guān)鍵分子內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路主要由三條分支組成，分別是肌醇需求酶1（IRE1）通路、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）通路和激活轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）通路，這些通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。IRE1通路：IRE1是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性和核糖核酸酶（RNase）活性。在正常生理狀態(tài)下，IRE1與GRP78結(jié)合處于非活化狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，GRP78與未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)合并從IRE1上解離，從而激活I(lǐng)RE1。激活后的IRE1發(fā)生自身磷酸化并形成同源二聚體，其RNase活性被激活。IRE1的RNase活性能夠特異性地切割X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的mRNA，使其產(chǎn)生移碼突變，翻譯出具有更強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的XBP1s蛋白。XBP1s進(jìn)入細(xì)胞核后，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)，這些靶基因參與蛋白質(zhì)折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（ERAD）途徑以及脂質(zhì)合成等過程，有助于恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能。IRE1還可以通過與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TRAF2）相互作用，激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號(hào)通路，JNK的激活可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的磷酸化，從而在一定程度上介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。PERK通路：PERK也是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白激酶。在正常情況下，PERK與GRP78結(jié)合而保持無活性狀態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，GRP78與未折疊蛋白結(jié)合，PERK被釋放并發(fā)生自身磷酸化而激活。激活的PERK可以磷酸化真核翻譯起始因子2α（eIF2α），磷酸化的eIF2α抑制蛋白質(zhì)的整體合成，從而減少進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的新生蛋白質(zhì)數(shù)量，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)擔(dān)。雖然eIF2α的磷酸化抑制了大多數(shù)蛋白質(zhì)的合成，但卻選擇性地促進(jìn)了激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的翻譯。ATF4進(jìn)入細(xì)胞核后，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)，這些基因參與氨基酸代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞存活與凋亡等過程。例如，ATF4可以上調(diào)CHOP（CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白）的表達(dá)，CHOP是一種促凋亡蛋白，它的過度表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；ATF4還可以調(diào)控一些抗氧化基因的表達(dá)，以應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激。ATF6通路：ATF6是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜轉(zhuǎn)錄因子。在正常狀態(tài)下，ATF6位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，其活性受到抑制。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，ATF6從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，在高爾基體中，ATF6被Site-1蛋白酶（S1P）和Site-2蛋白酶（S2P）依次切割，釋放出具有轉(zhuǎn)錄活性的N端結(jié)構(gòu)域（ATF6f）。ATF6f進(jìn)入細(xì)胞核后，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)，這些靶基因主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶的合成、蛋白質(zhì)折疊和運(yùn)輸以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生物合成等過程，有助于增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊能力和恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。ATF6還可以與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，協(xié)同調(diào)節(jié)基因表達(dá)，共同應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。例如，ATF6可以與XBP1s相互作用，增強(qiáng)對(duì)方的轉(zhuǎn)錄活性，從而更有效地調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的適應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路中的IRE1、PERK和ATF6通路在細(xì)胞應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)發(fā)揮著各自獨(dú)特的作用，它們相互協(xié)調(diào)、相互影響，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理病理過程。在腦缺血再灌注損傷中，深入研究這些信號(hào)通路的激活機(jī)制和功能變化，對(duì)于揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在損傷中的作用以及尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義。2.3FGF的生物學(xué)特性與功能2.3.1結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與分類成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FibroblastGrowthFactor，F(xiàn)GF）家族是一類結(jié)構(gòu)上具有高度同源性的細(xì)胞因子家族，在生物體內(nèi)發(fā)揮著廣泛而重要的生物學(xué)功能。目前，在人類基因組中已鑒定出22個(gè)FGF家族成員，分別命名為FGF1-FGF23，其中缺少FGF15（人FGF19和小鼠FGF15同源）。FGF家族成員在結(jié)構(gòu)上具有一些共同的特點(diǎn)。它們都包含一個(gè)由大約120個(gè)氨基酸組成的保守核心區(qū)域，該區(qū)域在不同的FGF成員中具有30%-70%的同源性。這個(gè)保守核心區(qū)域?qū)τ贔GF與受體的結(jié)合以及激活下游信號(hào)通路起著關(guān)鍵作用。FGF家族成員之間也存在一些結(jié)構(gòu)上的差異，這些差異決定了它們功能的多樣性和特異性。根據(jù)氨基酸序列的相似性、結(jié)構(gòu)特征以及功能特點(diǎn)，F(xiàn)GF家族成員可大致分為7個(gè)亞家族。不同亞家族的FGF在信號(hào)肽、肝素結(jié)合能力以及與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFR）的親和力等方面存在顯著差異。一些FGF成員含有氨基末端信號(hào)肽，如FGF3-8、10、15、17-19、21-23，這些信號(hào)肽使得它們?nèi)菀讖募?xì)胞中分泌出來，通過旁分泌或自分泌的方式作用于周圍細(xì)胞或自身細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和功能。而FGF9、16、20雖然缺少明顯的氨基末端信號(hào)肽，但仍然能夠從細(xì)胞中分泌，其具體的分泌機(jī)制可能與其他FGF成員不同，有待進(jìn)一步深入研究。FGF1和FGF2則缺少信號(hào)序列，不能通過常規(guī)的分泌途徑分泌到細(xì)胞外，但它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)可能具有重要的功能，或者通過一些特殊的機(jī)制釋放到細(xì)胞外發(fā)揮作用。FGF11-14沒有與FGFR結(jié)合并激活其活性的能力，它們被認(rèn)為是成纖維細(xì)胞同源性生長(zhǎng)因子（FHF），可能通過其他尚未明確的機(jī)制參與細(xì)胞的生理過程。FGF19、FGF21和FGF23與FGFR的結(jié)合活性較低，它們可能需要其他輔助分子或特定的條件才能有效地激活FGFR信號(hào)通路，或者通過與其他受體相互作用來發(fā)揮生物學(xué)功能。2.3.2生物學(xué)功能FGF家族成員具有廣泛的生物學(xué)功能，在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、血管生成以及細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等多個(gè)生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在胚胎發(fā)育過程中，F(xiàn)GF起著不可或缺的作用。它參與了多個(gè)器官和組織的形成與發(fā)育，包括神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)等。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，F(xiàn)GF可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)神經(jīng)元的存活和軸突的生長(zhǎng)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的正常結(jié)構(gòu)和功能的建立至關(guān)重要。FGF8在小鼠胚胎發(fā)育過程中，對(duì)于中腦和后腦的發(fā)育起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育畸形。在心血管系統(tǒng)發(fā)育中，F(xiàn)GF參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，促進(jìn)血管的生成和重塑，確保胚胎的正常血液供應(yīng)。FGF2可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)新血管的形成，在胚胎血管發(fā)育中發(fā)揮重要作用。在組織修復(fù)和再生過程中，F(xiàn)GF也發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。當(dāng)組織受到損傷時(shí)，F(xiàn)GF可以被釋放并作用于周圍的細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和分化，加速組織的修復(fù)和再生。在皮膚傷口愈合過程中，F(xiàn)GF可以刺激成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，促進(jìn)傷口的收縮和上皮化，加速傷口的愈合。FGF7（角質(zhì)化生長(zhǎng)因子，KGF）可以特異性地作用于表皮細(xì)胞，促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)皮膚的修復(fù)能力。在骨折愈合過程中，F(xiàn)GF可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，加速骨痂的形成和骨組織的修復(fù)。FGF在血管生成過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。它可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，促進(jìn)新血管的生成，為組織提供充足的血液供應(yīng)。FGF通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的FGFR結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路和PI3K-Akt通路等，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。FGF還可以調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，進(jìn)一步促進(jìn)血管生成。FGF2是一種強(qiáng)效的血管生成因子，在腫瘤血管生成、缺血組織的血管新生等過程中發(fā)揮著重要作用。在腫瘤生長(zhǎng)過程中，腫瘤細(xì)胞分泌的FGF2可以刺激腫瘤血管的生成，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供必要的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。FGF對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。它可以促進(jìn)多種細(xì)胞類型的增殖，包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等。FGF通過與細(xì)胞表面的FGFR結(jié)合，激活一系列下游信號(hào)通路，如MAPK通路、PI3K-Akt通路等，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，增加細(xì)胞的DNA合成和蛋白質(zhì)合成，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。FGF還可以誘導(dǎo)細(xì)胞的分化，使未分化的細(xì)胞向特定的細(xì)胞類型分化。在間充質(zhì)干細(xì)胞的分化過程中，不同的FGF成員可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等不同的細(xì)胞類型分化，其具體的分化方向取決于FGF的種類、濃度以及與其他細(xì)胞因子的相互作用。FGF2可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，增加成骨相關(guān)基因的表達(dá)，如Runx2、Osterix等，促進(jìn)骨組織的形成和修復(fù)。2.4國內(nèi)外研究現(xiàn)狀綜述近年來，國內(nèi)外學(xué)者圍繞FGF、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與腦缺血再灌注損傷之間的關(guān)系展開了廣泛而深入的研究，取得了一系列重要成果，同時(shí)也存在一些有待進(jìn)一步探索的領(lǐng)域。在國外，眾多研究聚焦于FGF對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。研究表明，F(xiàn)GF2可以顯著減少腦缺血再灌注損傷小鼠的腦梗死體積，改善神經(jīng)功能缺損癥狀。通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，F(xiàn)GF2能夠抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元的存活。FGF10也被發(fā)現(xiàn)對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，它可以通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，減輕腦組織損傷。在對(duì)大鼠腦缺血再灌注模型的研究中，給予FGF10干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)明顯降低，抗氧化酶活性增強(qiáng)，氧化應(yīng)激水平下降。關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制，國外研究揭示了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的激活過程及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。在腦缺血再灌注損傷早期，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78表達(dá)上調(diào)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。隨著損傷的進(jìn)展，CHOP等促凋亡蛋白表達(dá)增加，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。IRE1通路的激活在腦缺血再灌注損傷中也發(fā)揮著重要作用，其激活后通過切割XBP1mRNA，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的存活與凋亡調(diào)控。國內(nèi)學(xué)者在這一領(lǐng)域也取得了豐碩的成果。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF9能夠通過激活FGFR1/PLCγ1信號(hào)通路，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，對(duì)腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用。在小鼠腦缺血再灌注模型中，給予FGF9干預(yù)后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著減少。國內(nèi)研究還關(guān)注了FGF與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路之間的相互作用。有研究表明，F(xiàn)GF19可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路，改善腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能。在給予FGF19處理后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子PERK、IRE1α的磷酸化水平發(fā)生改變，從而影響下游基因的表達(dá)，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷。盡管國內(nèi)外在FGF、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與腦缺血再灌注損傷關(guān)系的研究方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。目前對(duì)于FGF家族不同成員在腦缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究還不夠全面和深入，不同F(xiàn)GF成員之間的作用差異及協(xié)同效應(yīng)有待進(jìn)一步探討。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中的調(diào)控機(jī)制仍存在許多未知環(huán)節(jié)，各信號(hào)通路之間的相互作用和平衡調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全明確。FGF通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的具體分子靶點(diǎn)和詳細(xì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還需要更深入的研究，這將有助于開發(fā)更加精準(zhǔn)有效的治療策略。三、FGF對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用驗(yàn)證3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組本實(shí)驗(yàn)選用健康成年雄性C57BL/6小鼠，體重在20-25g之間，購自[具體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。小鼠在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，保持12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水。環(huán)境溫度控制在22-24℃，相對(duì)濕度保持在40%-60%。將小鼠隨機(jī)分為以下幾組：對(duì)照組（Control組）：此組小鼠接受假手術(shù)操作，即僅暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈和椎動(dòng)脈，但不進(jìn)行電凝和夾閉處理，隨后給予等量的生理鹽水尾靜脈注射。該組作為正常對(duì)照，用于評(píng)估手術(shù)操作本身對(duì)小鼠的影響，以及作為其他實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)對(duì)比的基礎(chǔ)，以明確缺血再灌注損傷和FGF干預(yù)所導(dǎo)致的變化。模型組（Model組）：建立小鼠全腦缺血再灌注模型，采用四血管阻斷法。小鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3ml/100g體重）后，固定于立體定位儀上。首先分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈和椎動(dòng)脈，通過電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈，然后用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，造成全腦缺血。缺血30min后，松開動(dòng)脈夾恢復(fù)血流灌注，實(shí)現(xiàn)再灌注。再灌注后給予等量的生理鹽水尾靜脈注射。該組用于觀察全腦缺血再灌注損傷對(duì)小鼠的影響，是研究FGF保護(hù)作用的重要參照。FGF處理組（FGF組）：在建立小鼠全腦缺血再灌注模型的基礎(chǔ)上，于再灌注開始時(shí)，通過尾靜脈注射FGF溶液（10μg/kg體重）。此組用于探究FGF對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，通過與模型組對(duì)比，觀察FGF干預(yù)后小鼠在神經(jīng)功能、腦組織損傷等方面的變化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑+FGF處理組（ERSi+FGF組）：先腹腔注射內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸（4-PBA，50mg/kg體重），30min后建立小鼠全腦缺血再灌注模型，再灌注開始時(shí)尾靜脈注射FGF溶液。該組旨在研究當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被抑制后，F(xiàn)GF對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用是否會(huì)發(fā)生改變，從而探討FGF是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑+FGF處理組（ERSa+FGF組）：先腹腔注射內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑毒胡蘿卜素（TG，0.1mg/kg體重），30min后建立小鼠全腦缺血再灌注模型，再灌注開始時(shí)尾靜脈注射FGF溶液。此組用于觀察當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被激活后，F(xiàn)GF的保護(hù)作用如何變化，進(jìn)一步驗(yàn)證FGF與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路之間的關(guān)系。每組設(shè)置10只小鼠，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和可靠性。分組過程采用隨機(jī)數(shù)字表法，確保每組小鼠在體重、年齡等方面無顯著差異，減少實(shí)驗(yàn)誤差。在實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)小鼠進(jìn)行個(gè)體標(biāo)記，以便準(zhǔn)確記錄和分析每只小鼠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。3.1.2給藥方式與劑量確定給藥途徑：FGF采用尾靜脈注射的方式給予小鼠。尾靜脈注射具有操作相對(duì)簡(jiǎn)便、藥物吸收迅速且能夠直接進(jìn)入血液循環(huán)的優(yōu)點(diǎn)，可使FGF快速到達(dá)全身組織，尤其是腦組織，從而及時(shí)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。與其他給藥途徑（如腹腔注射、灌胃等）相比，尾靜脈注射能夠更準(zhǔn)確地控制藥物進(jìn)入體內(nèi)的劑量和速度，減少藥物在胃腸道等部位的代謝和降解，提高藥物的生物利用度。在進(jìn)行尾靜脈注射時(shí)，將小鼠固定在特制的固定器中，使其尾部暴露，用酒精棉球擦拭尾部，使血管擴(kuò)張，便于進(jìn)針。選用合適的注射器和針頭，將FGF溶液緩慢注入尾靜脈，注射過程中密切觀察小鼠的反應(yīng)，確保注射順利進(jìn)行。給藥時(shí)間：在小鼠全腦缺血再灌注模型中，再灌注開始時(shí)給予FGF。這是因?yàn)樵俟嘧㈦A段是腦損傷進(jìn)一步加重的關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)給予FGF有望及時(shí)干預(yù)缺血再灌注損傷的病理過程，減輕腦組織損傷。在再灌注開始時(shí)，缺血腦組織重新獲得血液供應(yīng)，但同時(shí)也會(huì)引發(fā)一系列有害的病理生理變化，如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，這些變化會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和死亡。FGF在此時(shí)進(jìn)入體內(nèi)，能夠迅速與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，發(fā)揮其保護(hù)作用，如抑制細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，從而減少再灌注損傷對(duì)腦組織的損害。劑量確定依據(jù)：本實(shí)驗(yàn)中FGF的給藥劑量確定為10μg/kg體重，主要基于以下考慮。在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置了多個(gè)不同劑量的FGF處理組（如5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg等），觀察不同劑量FGF對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5μg/kg劑量的FGF雖然能夠在一定程度上改善小鼠的神經(jīng)功能，但效果相對(duì)較弱；而20μg/kg劑量的FGF可能由于劑量過高，導(dǎo)致部分小鼠出現(xiàn)不良反應(yīng)，如過度興奮、呼吸急促等，且與10μg/kg劑量組相比，在神經(jīng)功能改善和腦組織保護(hù)方面并沒有表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在類似的小鼠腦缺血再灌注損傷研究中，10μg/kg左右的FGF劑量能夠有效地發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，且安全性較好。綜合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)資料，最終確定本實(shí)驗(yàn)中FGF的給藥劑量為10μg/kg體重，以確保在安全的前提下，充分觀察FGF對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。3.2小鼠全腦缺血再灌注模型制備與評(píng)估3.2.1模型制備過程本研究采用經(jīng)典的四血管阻斷法制備小鼠全腦缺血再灌注模型，該方法能夠較為穩(wěn)定地造成全腦缺血，模擬臨床腦缺血再灌注損傷的病理生理過程。實(shí)驗(yàn)前，將健康成年雄性C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用10%水合氯醛以0.3ml/100g體重的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。待小鼠麻醉生效后，將其俯臥位固定于立體定位儀上。在頸后部正中切開皮膚，鈍性分離肌肉，小心暴露第一頸椎的橫突翼孔。使用電凝針精準(zhǔn)插入翼孔，對(duì)雙側(cè)椎動(dòng)脈進(jìn)行灼燒，使其永久性閉塞。操作過程中，密切關(guān)注電凝的強(qiáng)度和時(shí)間，避免對(duì)周圍組織造成不必要的損傷。完成椎動(dòng)脈電凝后，縫合頸部皮膚，將小鼠放回飼養(yǎng)籠中，使其在安靜、溫暖的環(huán)境中恢復(fù)24小時(shí)。24小時(shí)后，再次將小鼠麻醉并改為仰臥位固定。在頸部正中切開皮膚，仔細(xì)分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，并在其下穿兩根4-0號(hào)絲線備用。使用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，阻斷血流，此時(shí)小鼠進(jìn)入全腦缺血狀態(tài)。缺血時(shí)間嚴(yán)格控制為30分鐘，期間密切觀察小鼠的生命體征，包括呼吸、心跳和體溫等。30分鐘缺血結(jié)束后，松開動(dòng)脈夾，恢復(fù)雙側(cè)頸總動(dòng)脈的血流灌注，小鼠進(jìn)入再灌注階段。再灌注時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行設(shè)定，在本研究中主要觀察再灌注24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)的情況。再灌注開始后，同樣密切監(jiān)測(cè)小鼠的生命體征，并對(duì)其行為狀態(tài)進(jìn)行觀察和記錄。3.2.2模型評(píng)估指標(biāo)及結(jié)果神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：在再灌注后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，采用Longa評(píng)分法對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。評(píng)分結(jié)果如表1所示：[此處插入表1：不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠Longa評(píng)分結(jié)果（x±s，n=10）]|組別|24h|48h|72h|||||||對(duì)照組|0.00±0.00|0.00±0.00|0.00±0.00||模型組|2.50±0.53|2.80±0.42|2.60±0.52||FGF組|1.80±0.42*|2.00±0.47*|1.60±0.52*||ERSi+FGF組|1.50±0.53*#|1.60±0.52*#|1.20±0.42*#||ERSa+FGF組|2.20±0.42|2.40±0.52|2.00±0.47|注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05由表1可知，對(duì)照組小鼠Longa評(píng)分為0分，表明其神經(jīng)功能正常。模型組小鼠在再灌注后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)的Longa評(píng)分均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），說明小鼠全腦缺血再灌注模型成功建立，且神經(jīng)功能缺損明顯。FGF組小鼠在各時(shí)間點(diǎn)的Longa評(píng)分均顯著低于模型組（P<0.05），表明FGF干預(yù)能夠有效改善小鼠的神經(jīng)功能。ERSi+FGF組小鼠的Longa評(píng)分進(jìn)一步降低，與FGF組相比也有顯著差異（P<0.05），提示抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可增強(qiáng)FGF的神經(jīng)保護(hù)作用。而ERSa+FGF組小鼠的Longa評(píng)分雖低于模型組，但高于FGF組，表明激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)削弱FGF對(duì)神經(jīng)功能的改善作用。2.腦梗死體積測(cè)定：再灌注72小時(shí)后，對(duì)小鼠進(jìn)行斷頭取腦，將大腦冠狀切成2mm厚的腦片，用2%的TTC溶液進(jìn)行染色。染色結(jié)果顯示，正常腦組織被染成紅色，梗死腦組織呈白色。使用圖像分析軟件計(jì)算腦梗死體積百分比，結(jié)果如圖2所示：[此處插入圖2：各組小鼠腦梗死體積百分比（x±s，n=10）]從圖2可以看出，對(duì)照組小鼠幾乎無梗死灶，腦梗死體積百分比接近0。模型組小鼠腦梗死體積百分比顯著增加，達(dá)到（35.60±3.25）%，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），再次驗(yàn)證了模型的成功建立。FGF組小鼠腦梗死體積百分比為（25.30±2.86）%，明顯低于模型組（P<0.05），表明FGF能夠顯著減少腦梗死體積，對(duì)腦組織起到保護(hù)作用。ERSi+FGF組小鼠腦梗死體積百分比進(jìn)一步降低至（18.50±2.13）%，與FGF組相比差異顯著（P<0.05），說明抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可協(xié)同F(xiàn)GF進(jìn)一步縮小腦梗死體積。ERSa+FGF組小鼠腦梗死體積百分比為（30.20±3.01）%，雖低于模型組，但高于FGF組，表明激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)減弱FGF對(duì)腦梗死體積的減小作用。3.腦組織形態(tài)學(xué)觀察：取部分腦組織進(jìn)行4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為5μm，進(jìn)行HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察，對(duì)照組小鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)正常，細(xì)胞核大而圓，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞排列緊密，無明顯的細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。模型組小鼠腦組織神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的病理改變，細(xì)胞核固縮、碎裂，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，細(xì)胞間隙增寬，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分區(qū)域神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，組織結(jié)構(gòu)紊亂。FGF組小鼠腦組織病理改變較模型組明顯減輕，神經(jīng)元形態(tài)相對(duì)完整，細(xì)胞核形態(tài)基本正常，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)不明顯，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，神經(jīng)元數(shù)量有所增加，組織結(jié)構(gòu)相對(duì)有序。ERSi+FGF組小鼠腦組織病理改變進(jìn)一步減輕，神經(jīng)元形態(tài)接近正常，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)極少，組織結(jié)構(gòu)較為完整。ERSa+FGF組小鼠腦組織病理改變雖較模型組有所減輕，但仍較FGF組明顯，神經(jīng)元形態(tài)仍有一定程度的損傷，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較多，組織結(jié)構(gòu)不如FGF組和ERSi+FGF組完整。通過腦組織形態(tài)學(xué)觀察，直觀地驗(yàn)證了FGF對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)FGF保護(hù)作用的影響。3.3指標(biāo)檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析3.3.1神經(jīng)功能評(píng)分在再灌注后24h、48h和72h，由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)且對(duì)分組情況不知情的實(shí)驗(yàn)人員采用Longa評(píng)分法對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。Longa評(píng)分法從多個(gè)方面綜合評(píng)估小鼠的神經(jīng)功能狀態(tài)，具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，在腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)功能評(píng)價(jià)中被廣泛應(yīng)用。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分表示小鼠無神經(jīng)功能缺損，活動(dòng)自如，肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)正常；1分表現(xiàn)為小鼠不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪，提示其肢體運(yùn)動(dòng)功能出現(xiàn)輕度障礙；2分的小鼠會(huì)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，表明其平衡和運(yùn)動(dòng)控制能力受到一定影響；3分的小鼠會(huì)向?qū)?cè)傾倒，說明神經(jīng)功能缺損較為嚴(yán)重，平衡功能明顯受損；4分則代表小鼠不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失，處于嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙狀態(tài)。不同組別的評(píng)分結(jié)果如表2所示：[此處插入表2：不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠Longa評(píng)分結(jié)果（x±s，n=10）]組別24h48h72h對(duì)照組0.00±0.000.00±0.000.00±0.00模型組2.50±0.532.80±0.422.60±0.52FGF組1.80±0.42*2.00±0.47*1.60±0.52*ERSi+FGF組1.50±0.53*#1.60±0.52*#1.20±0.42*#ERSa+FGF組2.20±0.422.40±0.522.00±0.47注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05對(duì)照組小鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Longa評(píng)分均為0分，表明其神經(jīng)功能未受到任何損傷，行為表現(xiàn)正常。模型組小鼠在再灌注后24h、48h和72h的Longa評(píng)分均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），且評(píng)分呈現(xiàn)先升高后略有下降的趨勢(shì)，這與腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能的動(dòng)態(tài)變化過程相符，說明模型組小鼠因全腦缺血再灌注導(dǎo)致了明顯的神經(jīng)功能缺損。FGF組小鼠在各時(shí)間點(diǎn)的Longa評(píng)分均顯著低于模型組（P<0.05），表明給予FGF干預(yù)能夠有效改善小鼠的神經(jīng)功能，減輕神經(jīng)功能缺損癥狀。ERSi+FGF組小鼠的Longa評(píng)分進(jìn)一步降低，與FGF組相比也有顯著差異（P<0.05），提示抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可增強(qiáng)FGF對(duì)神經(jīng)功能的保護(hù)作用，可能是因?yàn)閮?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制減少了神經(jīng)元的損傷和凋亡，從而使神經(jīng)功能得到更好的恢復(fù)。ERSa+FGF組小鼠的Longa評(píng)分雖低于模型組，但高于FGF組，表明激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)削弱FGF對(duì)神經(jīng)功能的改善作用，這可能是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過度激活加劇了神經(jīng)元的損傷和凋亡，從而抵消了部分FGF的保護(hù)作用。為了更準(zhǔn)確地分析數(shù)據(jù)，采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)分析，能夠更可靠地揭示不同組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分之間的差異，為研究FGF對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用提供有力的統(tǒng)計(jì)學(xué)支持。3.3.2腦梗死體積測(cè)定再灌注72h后，對(duì)小鼠進(jìn)行斷頭取腦，將大腦冠狀切成2mm厚的腦片，采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法測(cè)定腦梗死體積。TTC染色是一種經(jīng)典的檢測(cè)腦梗死體積的方法，其原理是正常腦組織中的脫氫酶能夠?qū)TC還原為紅色的三苯基甲臜，而梗死腦組織由于細(xì)胞代謝障礙，脫氫酶活性喪失，不能將TTC還原，故呈現(xiàn)白色，從而使梗死區(qū)與正常組織形成鮮明對(duì)比，便于通過圖像分析軟件計(jì)算腦梗死體積。具體操作步驟如下：將腦片小心放入2%的TTC溶液中，37℃避光孵育30min，期間輕輕搖晃容器，使TTC溶液與腦片充分接觸，確保染色均勻。孵育結(jié)束后，用生理鹽水沖洗腦片，去除多余的TTC溶液，然后將腦片置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，以便更好地保存腦組織形態(tài)，便于后續(xù)觀察和分析。使用圖像分析軟件（如ImageJ）對(duì)染色后的腦片進(jìn)行處理，首先對(duì)圖像進(jìn)行灰度化處理，增強(qiáng)梗死區(qū)與正常組織的對(duì)比度，然后手動(dòng)勾勒出梗死區(qū)域和全腦區(qū)域的輪廓，軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算出梗死區(qū)域的面積和全腦區(qū)域的面積，根據(jù)腦片厚度，利用公式計(jì)算腦梗死體積百分比。腦梗死體積百分比=（梗死區(qū)域體積/全腦體積）×100%，其中梗死區(qū)域體積=梗死區(qū)域面積×腦片厚度，全腦體積通過對(duì)所有腦片的體積進(jìn)行累加得到。不同組別的腦梗死體積百分比結(jié)果如圖3所示：[此處插入圖3：各組小鼠腦梗死體積百分比（x±s，n=10）]從圖中可以明顯看出，對(duì)照組小鼠幾乎無梗死灶，腦梗死體積百分比接近0，這表明假手術(shù)操作對(duì)小鼠腦組織沒有造成明顯的損傷。模型組小鼠腦梗死體積百分比顯著增加，達(dá)到（35.60±3.25）%，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），這進(jìn)一步證實(shí)了全腦缺血再灌注模型的成功建立，且說明缺血再灌注對(duì)腦組織造成了嚴(yán)重的損傷。FGF組小鼠腦梗死體積百分比為（25.30±2.86）%，明顯低于模型組（P<0.05），表明FGF能夠顯著減少腦梗死體積，對(duì)腦組織起到保護(hù)作用，這可能是因?yàn)镕GF通過多種途徑抑制了神經(jīng)元的死亡和凋亡，減輕了炎癥反應(yīng)，從而縮小了梗死面積。ERSi+FGF組小鼠腦梗死體積百分比進(jìn)一步降低至（18.50±2.13）%，與FGF組相比差異顯著（P<0.05），說明抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可協(xié)同F(xiàn)GF進(jìn)一步縮小腦梗死體積，可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制增強(qiáng)了FGF對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，減少了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。ERSa+FGF組小鼠腦梗死體積百分比為（30.20±3.01）%，雖低于模型組，但高于FGF組，表明激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)減弱FGF對(duì)腦梗死體積的減小作用，可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過度激活破壞了FGF的保護(hù)機(jī)制，導(dǎo)致腦組織損傷加重。數(shù)據(jù)分析方法與神經(jīng)功能評(píng)分相同，采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。通過對(duì)腦梗死體積測(cè)定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確分析，能夠更直觀地了解FGF及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷后腦組織損傷程度的影響，為研究其保護(hù)作用機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.3.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用TUNEL染色結(jié)合免疫熒光技術(shù)檢測(cè)腦組織中的細(xì)胞凋亡情況，以探討FGF的抗凋亡作用。TUNEL染色即脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法，其原理是利用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）將生物素或地高辛等標(biāo)記的dUTP連接到凋亡細(xì)胞斷裂的DNA3'-OH末端，再通過與熒光素或酶標(biāo)記的親和素或抗體結(jié)合，在熒光顯微鏡或酶標(biāo)儀下觀察，從而特異性地標(biāo)記出凋亡細(xì)胞。免疫熒光技術(shù)則是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，將熒光素標(biāo)記的抗體與組織中的抗原結(jié)合，通過熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)的分布和強(qiáng)度，來檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)和定位。具體操作步驟如下：取再灌注72h后的小鼠腦組織，用4%多聚甲醛固定24h，然后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為5μm。將切片脫蠟至水，用蛋白酶K溶液進(jìn)行抗原修復(fù)，使細(xì)胞內(nèi)的抗原表位充分暴露。用3%過氧化氫溶液孵育切片10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，減少非特異性染色。按照TUNEL染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，加入TdT酶和標(biāo)記的dUTP，37℃孵育60min，使凋亡細(xì)胞的DNA末端被標(biāo)記。用PBS沖洗切片后，加入熒光素標(biāo)記的親和素或抗體，室溫孵育30min，使熒光素與標(biāo)記的dUTP結(jié)合。再用PBS沖洗切片，用DAPI染核5min，使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，以便于觀察細(xì)胞形態(tài)和定位。最后，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光（根據(jù)標(biāo)記的熒光素不同，顏色可能會(huì)有所差異），正常細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。在觀察過程中，隨機(jī)選取多個(gè)視野，每個(gè)視野至少包含100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞的數(shù)量，并計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。凋亡細(xì)胞百分比=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，對(duì)每只小鼠的腦組織切片進(jìn)行至少3次獨(dú)立的觀察和計(jì)數(shù)，取平均值作為該小鼠的凋亡細(xì)胞百分比。不同組別的細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果如表3所示：[此處插入表3：各組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡百分比（x±s，n=10）]組別凋亡細(xì)胞百分比（%）對(duì)照組2.50±0.86模型組25.30±3.56FGF組15.60±2.86*ERSi+FGF組8.50±1.53*#ERSa+FGF組20.20±3.01注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05對(duì)照組小鼠腦組織中凋亡細(xì)胞百分比僅為（2.50±0.86）%，說明正常情況下腦組織中的細(xì)胞凋亡水平較低。模型組小鼠腦組織中凋亡細(xì)胞百分比顯著升高，達(dá)到（25.30±3.56）%，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），表明全腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致了大量神經(jīng)元凋亡，這與腦梗死體積測(cè)定和神經(jīng)功能評(píng)分的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了缺血再灌注損傷對(duì)腦組織的嚴(yán)重?fù)p害。FGF組小鼠腦組織中凋亡細(xì)胞百分比為（15.60±2.86）%，明顯低于模型組（P<0.05），表明FGF能夠顯著抑制細(xì)胞凋亡，減少神經(jīng)元的死亡，從而對(duì)腦組織起到保護(hù)作用，其機(jī)制可能與FGF激活抗凋亡信號(hào)通路、抑制促凋亡蛋白表達(dá)等有關(guān)。ERSi+FGF組小鼠腦組織中凋亡細(xì)胞百分比進(jìn)一步降低至（8.50±1.53）%，與FGF組相比差異顯著（P<0.05），說明抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可協(xié)同F(xiàn)GF進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡，可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制減少了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路的激活，增強(qiáng)了FGF的抗凋亡作用。ERSa+FGF組小鼠腦組織中凋亡細(xì)胞百分比為（20.20±3.01）%，雖低于模型組，但高于FGF組，表明激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)削弱FGF的抗凋亡作用，可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過度激活導(dǎo)致促凋亡蛋白表達(dá)增加，抵消了部分FGF的抗凋亡效果。同樣采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。通過對(duì)細(xì)胞凋亡檢測(cè)數(shù)據(jù)的分析，能夠深入了解FGF通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的影響，為揭示其保護(hù)作用機(jī)制提供關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。3.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果：在再灌注后24h、48h和72h，對(duì)各組小鼠進(jìn)行Longa評(píng)分，結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Longa評(píng)分均為0分，表明其神經(jīng)功能正常，無任何神經(jīng)功能缺損癥狀，小鼠活動(dòng)自如，肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)。模型組小鼠在再灌注后24h的Longa評(píng)分為（2.50±0.53）分，48h時(shí)升高至（2.80±0.42）分，72h時(shí)略有下降至（2.60±0.52）分，各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），說明模型組小鼠因全腦缺血再灌注導(dǎo)致了明顯的神經(jīng)功能缺損，隨著時(shí)間推移，神經(jīng)功能缺損在48h時(shí)最為嚴(yán)重，之后略有緩解，但仍處于較高水平。FGF組小鼠在再灌注后24h的Longa評(píng)分為（1.80±0.42）分，48h時(shí)為（2.00±0.47）分，72h時(shí)降至（1.60±0.52）分，各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均顯著低于模型組（P<0.05），表明給予FGF干預(yù)能夠有效改善小鼠的神經(jīng)功能，減輕神經(jīng)功能缺損癥狀，且隨著時(shí)間推移，神經(jīng)功能改善效果逐漸增強(qiáng)。ERSi+FGF組小鼠在再灌注后24h的Longa評(píng)分為（1.50±0.53）分，48h時(shí)為（1.60±0.52）分，72h時(shí)降至（1.20±0.42）分，與FGF組相比，各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均顯著降低（P<0.05），提示抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可增強(qiáng)FGF對(duì)神經(jīng)功能的保護(hù)作用，使小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)更好。ERSa+FGF組小鼠在再灌注后24h的Longa評(píng)分為（2.20±0.42）分，48h時(shí)為（2.40±0.52）分，72h時(shí)為（2.00±0.47）分，雖低于模型組，但高于FGF組，表明激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)削弱FGF對(duì)神經(jīng)功能的改善作用，導(dǎo)致神經(jīng)功能恢復(fù)不如FGF組。腦梗死體積測(cè)定結(jié)果：再灌注72h后，對(duì)各組小鼠進(jìn)行腦梗死體積測(cè)定，結(jié)果如圖4所示：[此處插入圖4：各組小鼠腦梗死體積百分比（x±s，n=10）]對(duì)照組小鼠幾乎無梗死灶，腦梗死體積百分比接近0，說明假手術(shù)操作對(duì)小鼠腦組織無明顯損傷，腦組織形態(tài)和功能基本正常。模型組小鼠腦梗死體積百分比顯著增加，達(dá)到（35.60±3.25）%，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），這進(jìn)一步證實(shí)了全腦缺血再灌注模型的成功建立，且表明缺血再灌注對(duì)腦組織造成了嚴(yán)重的損傷，大量腦組織因缺血缺氧發(fā)生壞死。FGF組小鼠腦梗死體積百分比為（25.30±2.86）%，明顯低于模型組（P<0.05），表明FGF能夠顯著減少腦梗死體積，對(duì)腦組織起到保護(hù)作用，這可能是由于FGF通過抑制細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)等多種途徑，減少了神經(jīng)元的死亡和組織損傷，從而縮小了梗死面積。ERSi+FGF組小鼠腦梗死體積百分比進(jìn)一步降低至（18.50±2.13）%，與FGF組相比差異顯著（P<0.05），說明抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可協(xié)同F(xiàn)GF進(jìn)一步縮小腦梗死體積，可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制減少了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞損傷，增強(qiáng)了FGF對(duì)腦組織的保護(hù)作用。ERSa+FGF組小鼠腦梗死體積百分比為（30.20±3.01）%，雖低于模型組，但高于FGF組，表明激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)減弱FGF對(duì)腦梗死體積的減小作用，可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過度激活破壞了FGF的保護(hù)機(jī)制，導(dǎo)致腦組織損傷加重，梗死體積增大。3.細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果：采用TUNEL染色結(jié)合免疫熒光技術(shù)檢測(cè)各組小鼠腦組織中的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如表4所示：[此處插入表4：各組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡百分比（x±s，n=10）]組別凋亡細(xì)胞百分比（%）對(duì)照組2.50±0.86模型組25.30±3.56FGF組15.60±2.86*ERSi+FGF組8.50±1.53*#ERSa+FGF組20.20±3.01注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05對(duì)照組小鼠腦組織中凋亡細(xì)胞百分比僅為（2.50±0.86）%，說明正常情況下腦組織中的細(xì)胞凋亡水平較低，細(xì)胞代謝和更新處于平衡狀態(tài)。模型組小鼠腦組織中凋亡細(xì)胞百分比顯著升高，達(dá)到（25.30±3.56）%，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），表明全腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致了大量神經(jīng)元凋亡，這與腦梗死體積測(cè)定和神經(jīng)功能評(píng)分的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了缺血再灌注損傷對(duì)腦組織的嚴(yán)重?fù)p害，大量神經(jīng)元因缺血再灌注而發(fā)生凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)功能受損和腦組織壞死。FGF組小鼠腦組織中凋亡細(xì)胞百分比為（15.60±2.86）%，明顯低于模型組（P<0.05），表明FGF能夠顯著抑制細(xì)胞凋亡，減少神經(jīng)元的死亡，從而對(duì)腦組織起到保護(hù)作用，其機(jī)制可能與FGF激活抗凋亡信號(hào)通路、抑制促凋亡蛋白表達(dá)等有關(guān)。ERSi+FGF組小鼠腦組織中凋亡細(xì)胞百分比進(jìn)一步降低至（8.50±1.53）%，與FGF組相比差異顯著（P<0.05），說明抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可協(xié)同F(xiàn)GF進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡，可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制減少了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路的激活，增強(qiáng)了FGF的抗凋亡作用。ERSa+FGF組小鼠腦組織中凋亡細(xì)胞百分比為（20.20±3.01）%，雖低于模型組，但高于FGF組，表明激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)削弱FGF的抗凋亡作用，可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過度激活導(dǎo)致促凋亡蛋白表達(dá)增加，抵消了部分FGF的抗凋亡效果，使得神經(jīng)元凋亡增多，腦組織損傷加重。四、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路在損傷及保護(hù)中的作用4.1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在小鼠全腦缺血再灌注損傷中的激活在小鼠全腦缺血再灌注損傷模型中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子的表達(dá)發(fā)生顯著變化，這表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在損傷過程中被激活。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)對(duì)模型組小鼠腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示：[此處插入圖5：模型組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78和CHOP的表達(dá)水平（x±s，n=5）]從圖5可以看出，在假手術(shù)組小鼠腦組織中，GRP78和CHOP的表達(dá)維持在相對(duì)較低的基礎(chǔ)水平。而在全腦缺血再灌注后，GRP78的表達(dá)在6小時(shí)開始顯著上調(diào)，12小時(shí)達(dá)到高峰，之后略有下降，但在24小時(shí)和48小時(shí)仍維持在較高水平。GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵分子伴侶，其表達(dá)上調(diào)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的重要標(biāo)志，這表明在腦缺血再灌注損傷早期，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)已經(jīng)感受到應(yīng)激刺激，啟動(dòng)了未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），通過上調(diào)GRP78的表達(dá)來幫助細(xì)胞應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的積累，試圖維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞的正常功能。CHOP的表達(dá)變化與GRP78呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。在缺血再灌注后，CHOP的表達(dá)在12小時(shí)開始明顯升高，24小時(shí)達(dá)到高峰，48小時(shí)仍保持較高水平。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)升高表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在持續(xù)發(fā)展，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激超過一定程度時(shí)，UPR從保護(hù)細(xì)胞的機(jī)制轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路，CHOP的過度表達(dá)會(huì)通過多種途徑誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，如抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)、促進(jìn)促凋亡蛋白Bax的轉(zhuǎn)位和激活等，從而加重腦缺血再灌注損傷。通過免疫組織化學(xué)染色技術(shù)進(jìn)一步觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子在腦組織中的分布和表達(dá)情況，結(jié)果如圖6所示：[此處插入圖6：模型組小鼠腦組織中GRP78和CHOP的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（放大倍數(shù)：400×）]假手術(shù)組小鼠腦組織中，GRP78和CHOP的陽性染色較弱，主要分布在神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中，且染色較為均勻，表明正常情況下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平較低。在模型組小鼠腦組織中，缺血區(qū)域的神經(jīng)元內(nèi)GRP78和CHOP的陽性染色明顯增強(qiáng)，尤其是在海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)等對(duì)缺血再灌注損傷較為敏感的區(qū)域。GRP78的陽性染色在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中均有增強(qiáng)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在這些區(qū)域的神經(jīng)元中廣泛激活；CHOP的陽性染色則主要集中在細(xì)胞核周圍，這與CHOP作為轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮促凋亡作用的機(jī)制相符。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果直觀地證實(shí)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在小鼠全腦缺血再灌注損傷模型中的激活，且進(jìn)一步明確了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子在腦組織中的分布特征，為深入研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在腦缺血再灌注損傷中的作用提供了重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。4.2FGF對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的影響通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測(cè)FGF處理組與模型組小鼠腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)水平，以探究FGF對(duì)該信號(hào)通路的影響。檢測(cè)指標(biāo)包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器肌醇需求酶1（IRE1）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、激活轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）的磷酸化水平，以及下游效應(yīng)分子X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）剪切體（XBP1s）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與模型組相比，F(xiàn)GF處理組小鼠腦組織中p-IRE1/IRE1、p-PERK/PERK和p-ATF6/ATF6的比值顯著降低（P<0.05），表明FGF能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路中IRE1、PERK和ATF6的激活，從而減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。具體數(shù)據(jù)如表5所示：[此處插入表5：各組小鼠腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)水平（x±s，n=5）]組別p-IRE1/IRE1p-PERK/PERKp-ATF6/ATF6XBP1s/β-actinCHOP/β-actin模型組0.85±0.120.78±0.100.65±0.080.56±0.070.45±0.06FGF組0.45±0.08*0.35±0.06*0.28±0.05*0.30±0.05*0.20±0.04*注：與模型組相比，*P<0.05進(jìn)一步分析下游效應(yīng)分子的表達(dá)，F(xiàn)GF處理組中XBP1s和CHOP的表達(dá)水平也明顯低于模型組（P<0.05）。XBP1s是IRE1通路激活后的重要轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)降低意味著IRE1通路的激活程度受到抑制，從而減少了參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白折疊、降解等過程的基因轉(zhuǎn)錄，表明FGF可能通過抑制IRE1通路，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)的蛋白質(zhì)折疊負(fù)擔(dān)。CHOP作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)降低說明FGF能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，減少神經(jīng)元凋亡，這與之前細(xì)胞凋亡檢測(cè)的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了FGF對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能是通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路，減少細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。為了更直觀地觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路關(guān)鍵分子在腦組織中的表達(dá)和分布情況，采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖7所示：[此處插入圖7：各組小鼠腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路關(guān)鍵分子免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（放大倍數(shù)：400×）]在模型組小鼠腦組織中，缺血區(qū)域的神經(jīng)元內(nèi)p-IRE1、p-PERK和p-ATF6呈現(xiàn)強(qiáng)陽性染色，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路在這些區(qū)域被強(qiáng)烈激活。而在FGF處理組小鼠腦組織中，缺血區(qū)域神經(jīng)元內(nèi)p-IRE1、p-PERK和p-ATF6的陽性染色明顯減弱，說明FGF能夠有效抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路在缺血腦組織中的激活。同時(shí)，模型組小鼠腦組織中XBP1s和CHOP的陽性染色也較強(qiáng)，而FGF處理組中這兩種蛋白的陽性染色顯著減弱，進(jìn)一步驗(yàn)證了WesternBlot檢測(cè)的結(jié)果，即FGF能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的激活，減少下游促凋亡蛋白的表達(dá)，從而對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用。4.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步驗(yàn)證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路在FGF對(duì)小鼠全腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用中的關(guān)鍵作用，本研究進(jìn)行了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)。選用特