熱空氣調(diào)節(jié)對(duì)甜櫻桃果實(shí)苯丙烷類代謝的分子機(jī)制的研究目錄TOC\o"1-3"\h\u19481摘要 熱空氣調(diào)節(jié)對(duì)甜櫻桃果實(shí)苯丙烷類代謝分子機(jī)制的研究前言甜櫻桃是指歐洲甜櫻桃（Prunusaviumlinn.）,又名大櫻桃，為薔薇科李屬櫻桃亞屬植物[1]。甜櫻桃果實(shí)由于含有豐富的營養(yǎng)，色澤光亮、顏色鮮艷且其口味酸甜可口深受大眾喜愛，又因?yàn)槠洚a(chǎn)期較短，同期水果種類較少，易于銷售，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但由于種植地區(qū)較為集中，異地銷售要經(jīng)過長(zhǎng)途運(yùn)輸。但是由于甜櫻桃果肉較軟、果皮較薄、汁液多，不耐儲(chǔ)運(yùn)。在運(yùn)輸及貯藏過程中極易受到微生物的感染及受到擠壓腐爛而造成廢棄，且由于運(yùn)輸時(shí)間過長(zhǎng)及條件不適造成果實(shí)品質(zhì)下降，口感變差，營養(yǎng)物質(zhì)損失。[2]目前大多數(shù)的方法通過是物理、化學(xué)、生物和綜合防治等控制甜櫻桃果實(shí)采后微生物侵染產(chǎn)生的腐爛問題，通過氣調(diào)貯藏、減壓冷庫貯藏及噴灑化學(xué)保鮮劑等方法解決甜櫻桃的枯梗、果實(shí)脫水軟化及口味變差等問題[3]褐變是影響甜櫻桃外觀品質(zhì)的主要因素，同時(shí)也影響營養(yǎng)物質(zhì)的含量和口感。果蔬組織發(fā)生的主要是酶促褐變，酶促褐變是指花青素等多酚類物質(zhì)在多酚氧化酶的作用下與氧氣發(fā)生的生化反應(yīng)。[4]水果和蔬菜在采后脫離母體之后，組織中仍然進(jìn)行活躍的新陳代謝活動(dòng)，在酶的作用下由這種正常的代謝過程而形成色素。花青素是植物呈色的主要色素之一，是黃酮類多酚化合物，[5]是果蔬發(fā)生酶促褐變的重要反應(yīng)底物。目前對(duì)花青素的生物合成途徑已經(jīng)普遍產(chǎn)生共識(shí)。首先是L-苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、4-香豆酰CoA連接酶（4CL）作用下轉(zhuǎn)化為4-香豆酰CoA，這一段被稱為苯丙烷類代謝途徑。之后，4-香豆酰CoA經(jīng)過查爾酮合酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）和黃烷酮-3-羥化酶（F3H）先后作用轉(zhuǎn)化成二羥黃酮醇。無色黃酮醇再經(jīng)過二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）、無色花色素雙加氧酶催化合成花青素，這個(gè)復(fù)雜的階段被稱為黃酮類代謝途徑。[6]由于人們環(huán)境保護(hù)和食品安全意識(shí)的不斷提高,運(yùn)用化學(xué)保鮮劑延長(zhǎng)果蔬貯藏期的方法因?yàn)槠滟M(fèi)用昂貴且藥物殘留正逐漸的被拋棄,相反，物理和生物處理方法因?yàn)楦咝?、無藥物殘留以及可以大規(guī)模實(shí)施開始受到青睞。[7]目前，采用較多的為物理處理方法或者物理結(jié)合生物處理方法，本實(shí)驗(yàn)將采用物理熱處理方法對(duì)甜櫻桃的褐變進(jìn)行研究。較多的實(shí)驗(yàn)研究證明果蔬采后進(jìn)行合適的熱處理，通過改變酶的活性和不同物質(zhì)的含量可以達(dá)到延緩成熟衰老、減輕冷害、防止病蟲害等的目的。[8]孔祥佳等研究發(fā)現(xiàn)熱空氣處理降低冷藏橄欖果實(shí)的冷害率。[9]王靜等用55℃熱水處理哈密瓜減輕冷害程度[10]陸振中等研究發(fā)現(xiàn)適宜的熱空氣處理有效保持了中華壽桃果實(shí)品質(zhì)。[11]屠康等通過熱空氣處理，有效延緩金冠蘋果的后熟衰老,和控制微生物病害的發(fā)生。[12]曹明明等證明適宜的熱水處理可以降低葡萄的抗氧化活性和發(fā)病率[13]本實(shí)驗(yàn)以新鮮甜櫻桃為材料，研究了熱空氣(44℃，114min)處理過[14]，后又常溫下分別貯藏1、2、3、4、5天的甜櫻桃果實(shí)的主要品質(zhì)指標(biāo)和相關(guān)酶含量的變化情況，以期通過采后提高甜櫻桃的貯存時(shí)間，為甜櫻桃的儲(chǔ)藏運(yùn)輸及延長(zhǎng)貨架期提供有價(jià)值的理論依據(jù)。1.材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1材料與試劑甜櫻桃：挑選同等成熟度、大小適中、色澤均勻，無病蟲害和無機(jī)械損傷的新鮮果實(shí)。50mmol/L、pH8.8硼酸緩沖液；0.1mol/L、pH8.8硼酸緩沖液；提取緩沖液（含40g/LPVP、2mmmol/LEDTA和5mmol/Lβ-巰基乙醇）；20mmol/Ll-苯丙氨酸溶液；6mol/L鹽酸溶液；0.2mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0，含25%甘油和0.1mol/LDTT)；15μmol/LMgSO4溶液；50μmol/mLATP；1μmol/mLCoA；0.15μmol/mLp-香豆酸；1μmol/L的脫氫櫟精；1μmol/LNADPH；6μmol/L的葡萄糖-6-磷酸；1%HCl-甲醇溶液；1.1.2儀器與設(shè)備GL立式高速冷凍離心機(jī)：鹽城市凱特試驗(yàn)儀器有限公司移液槍：德國EppendorfBCD-206TXZ冷藏冷凍柜：青島海爾股份有限公司UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司電子天平HZ1002A∶慈溪紅鉆衡器設(shè)備有限公司雙列四孔儀表恒溫水浴鍋∶上海樹立儀器儀表有限公司1.2原料處理將實(shí)驗(yàn)用的甜櫻桃果實(shí)平均分為5組，每一組又分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。將實(shí)驗(yàn)組果實(shí)放入44℃培養(yǎng)箱進(jìn)行熱處理114min(由預(yù)實(shí)驗(yàn)確定)，對(duì)照處理組放置2-4℃條件下進(jìn)行貯藏。再分別在恒溫箱21℃條件下放置1~5天，每組用保鮮膜包裝標(biāo)志好之后放于液氮中冷凍一天，取出后置于-20℃冷凍庫中保存。1.3指標(biāo)的測(cè)定及實(shí)驗(yàn)方法1.3.1苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測(cè)定稱取甜櫻桃果實(shí)5.0g，放于研缽中，向其中加入5.0ml提取緩沖液（含40g/LPVP、2mmmol/LEDTA和5mmol/Lβ-巰基乙醇），在冰浴條件下迅速研磨成勻漿。將勻漿全部轉(zhuǎn)移至離心管中，于離心機(jī)4℃、3000r/min條件下離心30min，取上清液，將上清液于4℃下保藏。分別向2支試管中各加入3.0ml50mmol/L硼酸緩沖液（pH8.8）、0.5mL20mmol/Ll-苯丙氨酸溶液。其中一支試管加入0.5ml上清液，另一支試管中加入0.5ml經(jīng)煮沸失活的上清液作為對(duì)照。然后，將2支試管置于37℃水浴鍋中保溫60min。保溫結(jié)束后馬上向2支試管中各加入0.1ml6mol/L鹽酸溶液使反應(yīng)結(jié)束。用蒸餾水調(diào)零，分別測(cè)定2支試管中的溶液在波長(zhǎng)290nm處的吸光度值。重復(fù)三次。[15]酶活性表示為U/mgprotein（U）。1.3.22,4-香豆酰-輔酶A連接酶(4CL)活性的測(cè)定稱取甜櫻桃果實(shí)3.0g，放入研缽中，向其中加入5ml4℃預(yù)冷的0.2mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0，含25%甘油和0.1mol/LDTT)，在冰浴條件下迅速研磨成勻漿，將勻漿全部轉(zhuǎn)移至離心管，在4℃條件下11250rpm下離心20min，取上清液，4℃條件下保存?zhèn)溆?。[16]取2支試管，分別向其中加入0.45ml15μmol/LMgSO4溶液，0.15mL50μmol/mLATP，0.15ml1μmol/mLCoA和0.5ml上清液，一支試管中加入0.15μmol/mLp-香豆酸，另一支試管作為對(duì)照不加，在333nm處測(cè)定其吸光度值，以每分鐘吸光度值變化0.01為1個(gè)4CL活力單位(U)酶活性表示為U/mgprotein。[17]重復(fù)測(cè)定3次。1.3.3二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)活性的測(cè)定稱取1.0g甜櫻桃果實(shí)，放入研缽中，加入液氮迅速研磨均勻，再加入5ml-20℃的丙酮，使其充分混勻，將混合液全部轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下，13000rpm離心20min，收集全部沉淀，沉淀用4ml混合溶液[0.1mol/L硼酸緩沖液(pH8.8),0.1gPVPP,5mmol/L抗壞血酸]溶解，收集全部溶液轉(zhuǎn)移到離心管中。在4℃條件下，12000rpm離心20min，取上清液，4℃保存?zhèn)溆?。取一支試管，向其中加?.5ml上清液，0.6ml由1000mmol/LTris緩沖液（pH7.4）、1μmol/L的脫氫櫟精、1μmol/LNADPH、0.5mol的酶提液、1單位的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶以及6μmol/L的葡萄糖-6-磷酸組成的反應(yīng)液，將試管在34℃水浴鍋中保溫1h，用1ml的乙酸乙酯提取3次，合并提取液，用0.2ml的蒸餾水抽提3次。乙酸乙酯部分用氮?dú)獯蹈桑缓蠹尤?.5ml的正丁醇-鹽酸（95:5，v/v）快速攪拌充分溶解，之后在水浴鍋中34℃保溫30min，測(cè)定溶液在波長(zhǎng)550nm處的吸光度，酶活性表示為U/mgprotein[18]1.3.4花青素含量的測(cè)定稱取2.0g甜櫻桃果實(shí)，放入研缽中，加入少許經(jīng)預(yù)冷的溫度為4℃的1%HCl-甲醇溶液，在冰浴條件下迅速研磨成勻漿，將勻漿全部轉(zhuǎn)入20ml刻度試管中。用1%HCl-甲醇溶液沖洗研缽，一并轉(zhuǎn)移到試管中，定容至刻度，混合均勻，于4℃溫度下避光提取20min,提取期間不斷搖晃，過濾之后收集濾液，棄掉沉淀。以1%HCl-甲醇溶液作為空白參比調(diào)零，分別測(cè)定濾液在波長(zhǎng)600nm、530nm處的吸光度值，重復(fù)三次。每克甜櫻桃果實(shí)在波長(zhǎng)530nm和600nm處吸光度值的差額是指甜櫻桃果實(shí)的花青素含量。[15]1.3.5色度值和色調(diào)值的測(cè)定在甜櫻桃果實(shí)的表面選擇三個(gè)不同的點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量，可得到每個(gè)測(cè)定點(diǎn)的L*、a*、b*。色度值由（a*2+b*2)1/2計(jì)算所得，色調(diào)值由arctan(b*/a*)計(jì)算所得。[19]2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析2.1熱空氣處理對(duì)甜櫻桃果實(shí)PAL活性的影響苯丙氨酸解氨酶是連接初級(jí)代謝和苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的酶，是關(guān)鍵酶和限速酶[20],也是合成花青素的首要關(guān)鍵酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)過熱空氣處理的實(shí)驗(yàn)組的PAL活性在第一天出現(xiàn)了上升，之后的4天里保持穩(wěn)定，有輕微的下降。對(duì)照組的PAL活性在前三天都有明顯的上升，在第四天和第五天保持穩(wěn)定，有輕微的上升。兩組之間相比較，第一天出現(xiàn)了較小的差距，第二天和第三天差距不斷地拉大，在第四天和第五天兩組都保持穩(wěn)定，差距只有輕微的加大。所以，熱空氣處理對(duì)甜櫻桃的PAL活性有很明顯的抑制作用。圖SEQ圖\*ARABIC1甜櫻桃果實(shí)中PAL活性變化Fig.1ChangesofPALactivityinsweetcherryfruit2.2熱空氣處理對(duì)甜櫻桃果實(shí)4CL活性的影響4CL作用于苯丙烷代謝途徑最后一步反應(yīng)，以C4H酶的催化產(chǎn)物羥基香豆酸為底物，催化其生成相應(yīng)的硫酯，[21]是甜櫻桃果實(shí)酚類物質(zhì)合成的控制關(guān)鍵。點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)過熱空氣處理過的實(shí)驗(yàn)組的4CL活性第一天有所下降，之后保持平穩(wěn)。對(duì)照組的4CL活性一直保持平穩(wěn)，有輕微的上升。兩組之間相比較，第一天出現(xiàn)較小的差距，之后差距維持平穩(wěn)。所以，熱空氣處理明顯降低4CL貯藏期的活性。圖SEQ圖\*ARABIC2甜櫻桃果實(shí)4CL活性變化Fig.2Changesof4CLActivityinSweetCherryFruits2.3熱空氣處理對(duì)甜櫻桃果實(shí)DFR活性的影響DFR以NADPH為輔因子，催化二氫黃酮醇在C4位發(fā)生立體特異的還原反應(yīng)，將無色黃酮醇轉(zhuǎn)化為無色花青素，是花青素合成過程中的關(guān)鍵酶。[22]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)過熱空氣處理的實(shí)驗(yàn)組的DFR活性第一天保持平穩(wěn)，第二天和第三天有所上升，后兩天在第三天的基礎(chǔ)上保持平穩(wěn)。對(duì)照組的DFR活性前三天在不斷增長(zhǎng)，后兩天保持平穩(wěn)，有輕微的下降。兩組相對(duì)照，第一天產(chǎn)生差距，之后差距加大并保持幾乎不變。所以，熱空氣處理有效的降低了甜櫻桃果實(shí)在貯藏期的DFR的活性。圖SEQ圖\*ARABIC3甜櫻桃果實(shí)DFR活性的變化Fig.3ChangesofDFRActivityinSweetCherryFruits2.4熱空氣處理對(duì)甜櫻桃果實(shí)花青素含量的影響花青素是一類重要的天然色素物質(zhì)，是植物的主要呈色物質(zhì)之一，作為一種酚類物質(zhì)，是甜櫻桃果實(shí)發(fā)生酶促褐變的物質(zhì)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)過熱空氣處理的實(shí)驗(yàn)組的花青素含量每天都有較小的增長(zhǎng)。對(duì)照組的花青素含量在第一天和后兩天又輕微的增長(zhǎng)，而在第二天和第三天增長(zhǎng)迅速。兩組相比較，第一天無明顯差距，之后的四天里差距先增大后減小。所以，熱空氣處理使得甜櫻桃果實(shí)花青素含量明顯減少。圖SEQ圖\*ARABIC4甜櫻桃果實(shí)花青素含量的變化Fig.4ChangesofAnthocyaninContentinSweetCherryFruits2.5熱空氣處理對(duì)甜櫻桃果實(shí)色度值和色調(diào)值的影響色度值和色調(diào)值是果實(shí)褐變的最直接的體現(xiàn)。在色度值方面，熱空氣處理過的實(shí)驗(yàn)組始終高于對(duì)照組，第一天，熱空氣處理過的實(shí)驗(yàn)組稍微高于對(duì)照組，在之后的四天里，兩組之間的數(shù)值差距越來越大，都呈下降趨勢(shì)。在色調(diào)值方面，兩組始終呈下降趨勢(shì)，第一天兩組沒有區(qū)別，在第二天和第三天實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組且差距不斷增大，第四天和第五天差距保持不變。所以，熱空氣處理明顯的減緩了甜櫻桃果實(shí)的顏色變化，延緩褐變的發(fā)生。圖SEQ圖\*ARABIC5甜櫻桃果實(shí)Chroma的變化Fig.5ChangesofChromainSweetCherryFruits圖SEQ圖\*ARABIC6甜櫻桃果實(shí)hue的變化Fig.6Changesofhueinsweetcherryfruit結(jié)論綜合以上指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果，可以看出，在整個(gè)貯藏期間，熱空氣處理有效的降低了甜櫻桃果實(shí)苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）的活性，減少了花青素的積累，減緩了色度值和色調(diào)值的降低。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，熱空氣處理可減緩甜櫻桃果實(shí)褐變的發(fā)生，其原因可能是通過抑制或破壞花青素生物合成途徑的關(guān)鍵酶的活性來減少褐變底物花青素的含量，從而延長(zhǎng)貨架期和保持其營養(yǎng)價(jià)值。這為熱空氣處理在果蔬保鮮方面的商用提供理論支持，但在實(shí)際生產(chǎn)中需要結(jié)合不同的具體實(shí)際進(jìn)行研究。近年來，物理方法保鮮果蔬正逐漸被研究者們重視，隨著研究的深入，方法將會(huì)更加的簡(jiǎn)便和完整。參考文獻(xiàn)蔡宇良,李珊,陳怡平,趙桂仿,付潤(rùn)民.不同甜櫻桃品種果實(shí)主要內(nèi)含物測(cè)試與分析[J].西北植物學(xué)報(bào),2005(02):304-310.焦中高，劉杰超，王思新.甜櫻桃采后生理與貯藏保鮮[J].果樹學(xué)報(bào)，2003,206）：498~502蘭士波.歐洲甜櫻桃研究進(jìn)展及開發(fā)利用前景[J].中國林副特產(chǎn),2012(02):89-94.姚森.原花青素及在酶促褐變中的作用研究進(jìn)展[J]飲料工業(yè)2016，16（5）64-68胡雅馨,李京,惠伯棣.藍(lán)莓果實(shí)中主要營養(yǎng)及花青素成分的研究[J].食品科學(xué),2006(10):600-603.王星，羅雙霞，于萍，羅蕾，趙建軍，王彥華，申書興，陳雪平.茄科蔬菜苯丙烷類代謝及相關(guān)基因酶基因研究進(jìn)展.[J]園藝學(xué)報(bào)2017,44（9）1738-1748孟霞，勒燕飛，王嘉智，張利，康英，朱欣偉.甜櫻桃果實(shí)采后貯藏保鮮技術(shù)研究綜述.[J]四川林業(yè)科技2017,38（5）128-147LURIES.Postharvestheattreatments[J].PostharvestBiologyandTechnology,1998,14:257-269.孔祥佳,林河通,鄭俊峰,林藝芬,陳藝暉.熱空氣處理誘導(dǎo)冷藏橄欖果實(shí)抗冷性及其與膜脂代謝的關(guān)系[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,45(04):752-760.王靜，茅林春，李學(xué)文，張輝，張明明，鞠國棟.熱處理降低哈密瓜果實(shí)活性氧代謝減輕冷害[J]農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2016（2）280-286陸振中,徐莉,王慶國.熱空氣處理對(duì)中華壽桃貯藏品質(zhì)的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2010,26(01):375-379.屠康,邵興鋒,趙藝澤.采后熱空氣處理對(duì)金冠蘋果后熟衰老及病害的影響[J].果樹學(xué)報(bào)2006，23（4）562~567曹明明，閻瑞香，馮敘橋，關(guān)文強(qiáng).熱處理對(duì)鮮切玫瑰香葡萄抗氧化活性及生理生化品質(zhì)的影響[J]食品科學(xué)，2012(8)279-284王雷.不同激發(fā)子處理對(duì)甜櫻桃果實(shí)采后青霉病的抑制作用及其機(jī)理研究[學(xué)位論文]2015-南京農(nóng)業(yè)大學(xué)：食品科學(xué)與工程曹建康，姜微波，趙玉梅.果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).中國輕工業(yè)出版社.2007.9范存斐，畢陽，王云飛，任亞琳，楊志敏，王毅.水楊酸對(duì)厚皮甜瓜采后病害及苯丙烷代謝的影響[J]中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(3)584-589.李云萍.紫心甘薯花色苷的積累與合成酶活性的關(guān)系研究[學(xué)位論文]2010-西南大學(xué)：植物學(xué)顧東東.甘薯莖尖色澤、脂溶性提取物抗氧化能力及其與β-胡蘿卜素含量的關(guān)系[學(xué)術(shù)論文]2016-西南大學(xué)：遺傳學(xué)劉佳.美洲南瓜苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因克隆、表達(dá)分析及品種抗灰霉病的研究[學(xué)術(shù)論文]2013-甘肅農(nóng)行大學(xué)：