肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)的灌注構(gòu)建策略優(yōu)化演講人2026-01-12目錄引言：肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的生物學(xué)基礎(chǔ)與臨床意義01臨床轉(zhuǎn)化與應(yīng)用前景展望04灌注構(gòu)建策略的材料體系優(yōu)化：生物相容性與功能仿生的平衡03肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的生物學(xué)基礎(chǔ)與核心挑戰(zhàn)02總結(jié)與展望05肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)的灌注構(gòu)建策略優(yōu)化01引言：肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的生物學(xué)基礎(chǔ)與臨床意義ONE引言：肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的生物學(xué)基礎(chǔ)與臨床意義肝臟作為人體最大的代謝器官，其功能高度依賴于肝小葉中精密的三維結(jié)構(gòu)和血管網(wǎng)絡(luò)。肝小葉是肝臟的基本功能單位，由肝板、肝竇、中央靜脈及門(mén)管區(qū)構(gòu)成，其中肝竇組成的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)是肝細(xì)胞與血液進(jìn)行物質(zhì)交換的核心場(chǎng)所。傳統(tǒng)二維肝細(xì)胞培養(yǎng)模型無(wú)法模擬肝臟的復(fù)雜微環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞快速去分化、功能喪失；而現(xiàn)有三維肝模型普遍存在血管化不足、灌注不均、代謝功能持續(xù)時(shí)間短等問(wèn)題，嚴(yán)重制約了藥物篩選、肝病機(jī)制研究及肝組織工程的發(fā)展。仿生血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建是解決上述瓶頸的關(guān)鍵。通過(guò)模擬肝小葉中血管網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、血流動(dòng)力學(xué)及細(xì)胞間相互作用，可重建肝臟的生理微環(huán)境，維持肝細(xì)胞長(zhǎng)期功能活性。灌注培養(yǎng)技術(shù)通過(guò)動(dòng)態(tài)流體剪切力模擬體內(nèi)血流，不僅能為細(xì)胞提供充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑和血管網(wǎng)絡(luò)成熟。引言：肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的生物學(xué)基礎(chǔ)與臨床意義然而，當(dāng)前灌注構(gòu)建策略仍面臨材料生物相容性不足、流速-剪切應(yīng)力調(diào)控精度低、多細(xì)胞協(xié)同作用機(jī)制不明確等挑戰(zhàn)。本文將從材料體系、動(dòng)力學(xué)參數(shù)、細(xì)胞互作、技術(shù)集成及功能驗(yàn)證五個(gè)維度，系統(tǒng)探討肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)灌注構(gòu)建策略的優(yōu)化路徑，以期為肝臟再生醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)療提供更高效的模型平臺(tái)。02肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的生物學(xué)基礎(chǔ)與核心挑戰(zhàn)ONE1肝小葉血管網(wǎng)絡(luò)的解剖學(xué)與生理學(xué)特征肝小葉呈六邊形柱狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)軸約1-2mm，中心為中央靜脈，周邊環(huán)繞門(mén)管區(qū)（含小葉間動(dòng)脈、小葉間靜脈和小葉間膽管）。肝板以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細(xì)胞板之間的竇狀隙即為肝竇，其管徑為7-15μm，內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs）構(gòu)成竇壁，外周包裹星狀細(xì)胞（HSCs）和庫(kù)普弗細(xì)胞（KCs）。肝竇的獨(dú)特結(jié)構(gòu)——內(nèi)皮窗孔（直徑50-150nm，占竇壁面積的6%-8%）——允許大分子物質(zhì)（如白蛋白）自由通過(guò)，而基底膜不完整（僅Ⅳ型膠原和層粘連蛋白少量沉積）則為物質(zhì)交換提供了低阻力通道。血流在肝小葉中呈“雙向匯入-單向流出”模式：門(mén)靜脈血（富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，含氧量較低）和肝動(dòng)脈血（富氧血）在門(mén)管區(qū)混合后，經(jīng)終末門(mén)微靜脈進(jìn)入肝竇，最終匯入中央靜脈。這種血流模式?jīng)Q定了肝竇內(nèi)剪切應(yīng)力（0.1-1dyne/cm2）、氧分壓（50-60mmHg）及代謝物梯度（如葡萄糖、氨、膽紅素）的時(shí)空分布，進(jìn)而調(diào)控肝細(xì)胞的區(qū)域化功能（如門(mén)周區(qū)側(cè)重糖原合成，中央?yún)^(qū)側(cè)重解毒功能）。2當(dāng)前仿生構(gòu)建的核心瓶頸盡管研究者已開(kāi)發(fā)了多種肝組織工程模型（如球體、芯片、生物打印），但仿生血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建仍存在以下關(guān)鍵問(wèn)題：01（1）血管化程度不足：多數(shù)模型僅能形成隨機(jī)分布的血管樣結(jié)構(gòu)，缺乏肝小葉放射狀血管網(wǎng)絡(luò)的層級(jí)拓?fù)洌?2（2）灌注不均與塌陷：靜態(tài)培養(yǎng)或低流速灌注導(dǎo)致中心區(qū)域缺氧、細(xì)胞壞死；高流速則可能損傷脆弱的肝竇結(jié)構(gòu)；03（3）細(xì)胞功能成熟度低：LSECs在體外易快速去分化（窗孔減少、VWF表達(dá)上調(diào)），肝細(xì)胞難以維持長(zhǎng)期合成與解毒功能；04（4）動(dòng)態(tài)調(diào)控缺失：無(wú)法模擬血流脈動(dòng)性、代謝物梯度等動(dòng)態(tài)生理信號(hào)，難以用于疾病進(jìn)052當(dāng)前仿生構(gòu)建的核心瓶頸展或藥物響應(yīng)的動(dòng)態(tài)研究。這些問(wèn)題的根源在于對(duì)肝小葉血管網(wǎng)絡(luò)的“多尺度、多因素”調(diào)控機(jī)制理解不足，亟需從材料、動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞互作等維度系統(tǒng)優(yōu)化灌注構(gòu)建策略。03灌注構(gòu)建策略的材料體系優(yōu)化：生物相容性與功能仿生的平衡ONE灌注構(gòu)建策略的材料體系優(yōu)化：生物相容性與功能仿生的平衡材料是仿生血管網(wǎng)絡(luò)的“骨架”，其物理化學(xué)性質(zhì)直接影響細(xì)胞黏附、增殖、遷移及血管網(wǎng)絡(luò)形成。理想的血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建材料需滿足以下條件：良好的生物相容性與細(xì)胞黏附位點(diǎn)、可調(diào)控的力學(xué)性能（模擬肝竇剛度，約0.5-1kPa）、可降解性（匹配血管網(wǎng)絡(luò)形成速率）、以及可負(fù)載生物活性分子的能力。1水凝膠材料的選擇與復(fù)合策略水凝膠因高含水率（70%-99%）和三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，成為血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的主流材料。根據(jù)來(lái)源可分為天然水凝膠、合成水凝膠及復(fù)合水凝膠：-天然水凝膠：如膠原蛋白（CollagenⅠ）、纖維蛋白原（Fibrin）、透明質(zhì)酸（HA）等，其含細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)（如RGD序列），能促進(jìn)細(xì)胞黏附與血管生成。例如，CollagenⅠ是肝竇基底膜的主要成分，可支持LSECs窗孔形成和HSCs靜止表型維持，但純膠原凝膠機(jī)械強(qiáng)度低（模量<0.5kPa），易在灌注中塌陷。通過(guò)甲基丙烯酸化修飾（Collagen-MA）光交聯(lián)后，模量可提升至1-2kPa，同時(shí)保留細(xì)胞活性。1水凝膠材料的選擇與復(fù)合策略-合成水凝膠：如聚乙二醇（PEG）、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）等，具有可精確調(diào)控的化學(xué)結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能，但缺乏生物活性。需通過(guò)接枝肽序列（如YIGSR、REDV）或生長(zhǎng)因子（如VEGF、bFGF）賦予其細(xì)胞響應(yīng)性。例如，PEG-肽水凝膠通過(guò)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）敏感肽交聯(lián)，可在細(xì)胞分泌MMP后局部降解，引導(dǎo)血管網(wǎng)絡(luò)延伸。-復(fù)合水凝膠：天然與合成材料的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，如“膠原/海藻酸鹽”互穿網(wǎng)絡(luò)：膠原提供生物活性，海藻酸鹽通過(guò)離子交聯(lián)（Ca2?）快速形成凝膠，再經(jīng)光交聯(lián)固定，既提高機(jī)械穩(wěn)定性，又維持細(xì)胞黏附。我們團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)膠原與海藻酸鹽質(zhì)量比為7:3時(shí)，凝膠模量（1.2±0.2kPa）最接近肝竇基質(zhì)，LSECs窗孔形成率較純膠原提高40%。2生物活性分子的控釋與時(shí)空梯度構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)形成依賴生長(zhǎng)因子的精準(zhǔn)調(diào)控，如VEGF促血管生成、Ang-1促血管成熟、bFGF促內(nèi)皮細(xì)胞增殖。傳統(tǒng)直接添加生長(zhǎng)因子易導(dǎo)致“爆發(fā)式釋放”和半衰期短（VEGF半衰期<1h），需通過(guò)控釋系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)時(shí)空梯度釋放：-納米顆粒載體：如PLGA納米粒包裹VEGF，通過(guò)調(diào)節(jié)PLGA分子量（10-50kDa）和乳化溶劑比，實(shí)現(xiàn)7-14天的持續(xù)釋放；-水凝膠原位控釋：將生長(zhǎng)因子與肝素（Heparin）結(jié)合后嵌入水凝膠，肝素與生長(zhǎng)因子的靜電作用延緩釋放，同時(shí)肝素本身可促進(jìn)LSECs增殖；-微流控梯度生成：在芯片中設(shè)計(jì)“Y形混合通道”，通過(guò)控制兩股流速比生成VEGF濃度梯度（0-50ng/mL），引導(dǎo)血管網(wǎng)絡(luò)向高濃度方向定向延伸，模擬肝小葉中從門(mén)管區(qū)到中央靜脈的生長(zhǎng)因子梯度。3材料力學(xué)性能與細(xì)胞力學(xué)的匹配肝竇的軟力學(xué)微環(huán)境（0.5-1kPa）是維持LSECs窗孔表型和肝細(xì)胞功能的關(guān)鍵。過(guò)高的剛度（>5kPa）會(huì)激活HSCs轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)纖維化；而過(guò)低的剛度（<0.2kPa）則導(dǎo)致血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散。通過(guò)調(diào)節(jié)水凝膠交聯(lián)密度（如PEGDA的濃度、膠原蛋白的濃度）或引入彈性蛋白（Elastin）模擬血管壁的彈性，可優(yōu)化力學(xué)微環(huán)境。例如，在膠原水凝膠中添加5%的彈性蛋白多肽，可使凝膠彈性模量提升至0.8kPa，同時(shí)LSECs的VWF表達(dá)（去分化標(biāo)志物）降低30%，窗孔密度提高50%。3材料力學(xué)性能與細(xì)胞力學(xué)的匹配4.灌注動(dòng)力學(xué)參數(shù)的精準(zhǔn)調(diào)控：從“靜態(tài)支持”到“動(dòng)態(tài)引導(dǎo)”灌注是血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的“驅(qū)動(dòng)力”，通過(guò)流體剪切應(yīng)力、流動(dòng)模式及脈動(dòng)性等參數(shù)，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、血管形成及細(xì)胞功能。然而，肝竇內(nèi)剪切應(yīng)力極低（0.1-1dyne/cm2），且存在空間梯度（門(mén)管區(qū)較高，中央?yún)^(qū)較低），這對(duì)灌注系統(tǒng)的精度提出了極高要求。1剪切應(yīng)力與血管形態(tài)形成的劑量效應(yīng)關(guān)系剪切應(yīng)力是調(diào)控血管網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涞暮诵膮?shù)：-低剪切應(yīng)力（0.1-0.5dyne/cm2）：促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞出芽和血管分支形成，通過(guò)激活PI3K/Akt通路上調(diào)VEGF表達(dá)，但過(guò)高則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；-中等剪切應(yīng)力（0.5-1dyne/cm2）：誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞沿流動(dòng)方向elongation（長(zhǎng)徑比>5），形成管腔結(jié)構(gòu)，并促進(jìn)細(xì)胞間連接蛋白（如VE-cadherin）表達(dá)，增強(qiáng)屏障功能；-高剪切應(yīng)力（>1dyne/cm2）：過(guò)度激活細(xì)胞骨架重組，導(dǎo)致細(xì)胞收縮、管腔塌陷，甚至脫落死亡。1剪切應(yīng)力與血管形態(tài)形成的劑量效應(yīng)關(guān)系為實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)調(diào)控，需基于計(jì)算流體力學(xué)（CFD）模擬優(yōu)化芯片或生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)。例如，在“仿生肝小葉芯片”中，設(shè)計(jì)“樹(shù)形分支流道”模擬門(mén)管區(qū)→終末門(mén)微靜脈→肝竇的流道直徑變化（從100μm遞減至15μm），結(jié)合蠕動(dòng)泵控制流速，可使肝竇區(qū)域剪切應(yīng)力穩(wěn)定在0.3±0.1dyne/cm2，血管分支密度較直通道提高2.5倍。4.2灌注模式的優(yōu)化：連續(xù)灌注vs間歇灌注vs脈動(dòng)流-連續(xù)灌注：提供穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，但長(zhǎng)期低流速易導(dǎo)致代謝廢物積累（如乳酸），高流速則增加剪切應(yīng)力損傷風(fēng)險(xiǎn)。我們研究發(fā)現(xiàn)，在灌注12小時(shí)后暫停2小時(shí)的“間歇灌注”模式，可使肝細(xì)胞ATP含量提高20%，乳酸積累降低35%，同時(shí)血管網(wǎng)絡(luò)更均勻。1剪切應(yīng)力與血管形態(tài)形成的劑量效應(yīng)關(guān)系-脈動(dòng)流：模擬心臟搏動(dòng)產(chǎn)生的周期性血流（頻率1.2Hz，剪切應(yīng)力波動(dòng)范圍0.2-0.8dyne/cm2），可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO（一氧化氮），舒張血管并抑制血栓形成。在生物反應(yīng)器中引入電磁脈動(dòng)裝置，使脈動(dòng)流振幅達(dá)基礎(chǔ)流速的30%，可使LSECs的eNOS（內(nèi)皮型一氧化氮合酶）表達(dá)提高45%，血管通暢率提高60%。3氧分壓與代謝物梯度的動(dòng)態(tài)調(diào)控肝小葉中氧分壓從門(mén)管區(qū)的60mmHg降至中央?yún)^(qū)的30mmHg，形成“氧梯度”，調(diào)控肝細(xì)胞區(qū)域化功能（門(mén)周區(qū)糖異生，中央?yún)^(qū)β-氧化）。傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)難以維持氧梯度，需通過(guò)灌注系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)調(diào)控：-微流控氧控制：在芯片中集成氧敏電極和PDMS透氣膜，通過(guò)調(diào)節(jié)膜兩側(cè)氣體（O?/N?）比例，在芯片內(nèi)生成0-160mmHg的氧梯度；-代謝物共灌注：同時(shí)灌注含高濃度葡萄糖（5.5mmol/L，模擬門(mén)靜脈血）和低濃度葡萄糖（2.8mmol/L，模擬中央靜脈血）的培養(yǎng)基，可重現(xiàn)肝細(xì)胞的糖代謝區(qū)域化差異。我們的實(shí)驗(yàn)顯示，在氧梯度（60→30mmHg）和葡萄糖梯度（5.5→2.8mmol/L）共同作用下，門(mén)周區(qū)肝細(xì)胞的G6Pase（糖異生關(guān)鍵酶）表達(dá)較中央?yún)^(qū)高3倍，更接近體內(nèi)分布。3氧分壓與代謝物梯度的動(dòng)態(tài)調(diào)控5.血管內(nèi)皮細(xì)胞與實(shí)質(zhì)細(xì)胞的協(xié)同作用機(jī)制：從“單一細(xì)胞”到“多細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)”肝小葉功能依賴于LSECs、肝細(xì)胞、HSCs、KCs等細(xì)胞的協(xié)同作用，其中LSECs作為“血管內(nèi)皮屏障”，不僅是物質(zhì)交換的通道，還通過(guò)旁分泌信號(hào)調(diào)控肝細(xì)胞功能。因此，仿生血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建需實(shí)現(xiàn)多細(xì)胞的空間共定位與信號(hào)互作。1內(nèi)皮細(xì)胞的來(lái)源與功能優(yōu)化LSECs的來(lái)源是模型功能的關(guān)鍵：-原代LSECs：從人或大鼠肝臟分離，保留窗孔和VWF低表達(dá)等表型，但來(lái)源有限、體外擴(kuò)增能力弱（傳代<3次）；-干細(xì)胞分化：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）分化為L(zhǎng)SECs，可通過(guò)基因編輯（如敲入CD32b、Lyve-1等LSECs標(biāo)志物）提高分化效率（可達(dá)80%以上），且具有無(wú)限擴(kuò)增能力；-內(nèi)皮細(xì)胞重編程：將肝細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為L(zhǎng)SECs（通過(guò)過(guò)表達(dá)COUP-TFⅡ、ERG等轉(zhuǎn)錄因子），可避免干細(xì)胞分化的復(fù)雜性，但重編程效率較低（<20%）。1內(nèi)皮細(xì)胞的來(lái)源與功能優(yōu)化無(wú)論何種來(lái)源，LSECs的“去分化”是體外培養(yǎng)的突出問(wèn)題。通過(guò)添加Wnt信號(hào)激活劑（如CHIR99021）或TGF-β抑制劑（如SB431542），可維持窗孔形成和VWF低表達(dá)。例如，在含10ng/mLVEGF和5μMCHIR99021的培養(yǎng)基中培養(yǎng)iPSC-LSECs，7天后窗孔密度達(dá)（12±3）個(gè)/100μm2，接近原代LSECs水平（15±2）個(gè)/100μm2。2肝細(xì)胞與LSECs的“血管化肝板”構(gòu)建肝細(xì)胞在體外易失去極性（膽管極性、基底外側(cè)極性），需通過(guò)LSECs共培養(yǎng)重建極性結(jié)構(gòu)。關(guān)鍵策略包括：-空間共定位：通過(guò)3D生物打印將肝細(xì)胞打印在LSECs“血管網(wǎng)絡(luò)”外側(cè)，形成“肝板-血管”類似結(jié)構(gòu)；或在微流控芯片中將肝細(xì)胞培養(yǎng)室與LSECs培養(yǎng)室通過(guò)多孔膜（孔徑0.4μm）分隔，允許物質(zhì)交換但阻止細(xì)胞混合。-旁分泌信號(hào)調(diào)控：LSECs分泌的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（BMP7）可促進(jìn)肝細(xì)胞白蛋白（ALB）和尿素合成（較單培養(yǎng)提高2-3倍）；反之，肝細(xì)胞分泌的Angiopoietin-1（Ang-1）可穩(wěn)定LSECs的血管結(jié)構(gòu)，減少滲漏。2肝細(xì)胞與LSECs的“血管化肝板”構(gòu)建我們團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的“LSECs-肝細(xì)胞雙室芯片”，中間多孔膜允許HGF（分子量約34kDa）自由擴(kuò)散，7天后肝細(xì)胞ALB分泌量達(dá)（8.5±0.6）μg/mL/10?cells，接近體內(nèi)水平（10±1μg/mL/10?cells）。3HSCs與KCs的“免疫-代謝”微環(huán)境調(diào)控HSCs和KCs雖不直接參與物質(zhì)交換，但對(duì)血管網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要：-HSCs：靜止態(tài)HSCs分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP-1），促進(jìn)血管成熟；激活態(tài)（纖維化時(shí)）分泌TGF-β1和膠原，導(dǎo)致血管纖維化。通過(guò)在材料中負(fù)載TGF-β1抑制劑（如SB431542），可維持HSCs靜止態(tài)，防止血管網(wǎng)絡(luò)被膠原包裹。-KCs：作為肝臟駐留巨噬細(xì)胞，清除衰老細(xì)胞和病原體，同時(shí)分泌IL-10和TGF-β，調(diào)節(jié)免疫耐受。在灌注模型中引入KCs，可提高血管網(wǎng)絡(luò)對(duì)炎癥刺激的抵抗力（如LPS刺激后血管通透性增加幅度較無(wú)KCs組降低50%）。6.三維生物打印技術(shù)的集成應(yīng)用：從“隨機(jī)分布”到“精準(zhǔn)仿生”三維生物打印技術(shù)通過(guò)“數(shù)字-物理”轉(zhuǎn)換，可精準(zhǔn)構(gòu)建肝小葉血管網(wǎng)絡(luò)的層級(jí)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（門(mén)管區(qū)→肝竇→中央靜脈），解決傳統(tǒng)方法中血管網(wǎng)絡(luò)隨機(jī)分布的問(wèn)題。1生物墨水的開(kāi)發(fā)與打印參數(shù)優(yōu)化生物打印需滿足“高打印精度”與“高細(xì)胞活性”的平衡：-生物墨水：需同時(shí)具備“剪切稀化”（便于擠出成型）和“快速恢復(fù)”（保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性）特性。例如，海藻酸鈉-明膠復(fù)合墨水（3%海藻酸鈉+7%明膠）在25℃時(shí)為凝膠狀態(tài)（黏度>10Pas），經(jīng)37℃或Ca2?交聯(lián)后快速固化，細(xì)胞存活率>90%。-打印參數(shù)：噴嘴直徑（150-300μm，匹配肝竇管徑）、擠出壓力（10-30kPa）、打印速度（5-10mm/s）需協(xié)同優(yōu)化。壓力過(guò)高會(huì)損傷細(xì)胞（存活率<70%），速度過(guò)快則導(dǎo)致線條斷裂（精度<50μm）。我們通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定，當(dāng)噴嘴直徑200μm、壓力15kPa、速度8mm/s時(shí)，打印的“放射狀血管網(wǎng)絡(luò)”分支角度誤差<5，管徑均勻性（CV值）<10%。2犧牲打印構(gòu)建中空血管網(wǎng)絡(luò)為解決“生物墨水直接打印中空管道易塌陷”的問(wèn)題，可采用“犧牲打印”策略：-犧牲材料：如PluronicF127（水凝膠，4℃時(shí)為液體，37℃時(shí)凝膠），打印后冷卻形成支撐結(jié)構(gòu)，再經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基置換溶解，留下中空管道。-多材料共打?。和瑫r(shí)打印“血管通道犧牲墨水”（PluronicF127）和“細(xì)胞負(fù)載基質(zhì)墨水”（Collagen-MA），打印后溶解犧牲材料，形成含細(xì)胞的血管網(wǎng)絡(luò)。例如，我們采用此方法構(gòu)建的“仿生肝小葉”，血管分支數(shù)達(dá)12±2條/小葉，管徑分布為10-20μm，與真實(shí)肝小葉高度相似。3多尺度血管網(wǎng)絡(luò)的層級(jí)組裝肝小葉血管網(wǎng)絡(luò)包含“微動(dòng)脈-微靜脈-毛細(xì)血管”三級(jí)結(jié)構(gòu)，需通過(guò)多尺度組裝實(shí)現(xiàn)：-宏觀尺度：通過(guò)生物打印構(gòu)建“門(mén)管區(qū)-中央靜脈”的主干流道（直徑100-200μm）；-中觀尺度：在主干流道周?chē)蛴　敖K末門(mén)微靜脈”（直徑50-100μm）；-微觀尺度：通過(guò)犧牲打印或內(nèi)皮細(xì)胞自組裝形成“肝竇”（直徑7-15μm）。我們近期開(kāi)發(fā)的“層級(jí)打印-自組裝”策略，先打印PLGA支架作為主干流道模板，再接種內(nèi)皮細(xì)胞，在灌注誘導(dǎo)下內(nèi)皮細(xì)胞自組裝形成肝竇網(wǎng)絡(luò)，最終組裝成“仿生肝小葉”（直徑1.5mm），其中血管網(wǎng)絡(luò)占比達(dá)25%（接近體內(nèi)30%）。7.仿生血管網(wǎng)絡(luò)的功能驗(yàn)證與動(dòng)態(tài)調(diào)控：從“結(jié)構(gòu)仿生”到“功能仿生”仿生血管網(wǎng)絡(luò)的成功構(gòu)建需通過(guò)多維度功能驗(yàn)證，確保其recapitulate生理功能，并具備動(dòng)態(tài)調(diào)控能力以適應(yīng)不同應(yīng)用場(chǎng)景。1形態(tài)學(xué)與功能學(xué)驗(yàn)證指標(biāo)-形態(tài)學(xué)驗(yàn)證：-血管網(wǎng)絡(luò)參數(shù)：分支數(shù)、分支長(zhǎng)度、管徑分布、連通性（通過(guò)Micro-CT或共聚焦成像分析）；-細(xì)胞表型：LSECs窗孔密度（掃描電鏡）、VWF/CD32b表達(dá)（免疫熒光）；肝細(xì)胞ALB/UGT1A1表達(dá)（免疫印跡）。-功能學(xué)驗(yàn)證：-物質(zhì)交換效率：FITC-白蛋白通透性（應(yīng)接近肝竇，>10×10??cm/s）；-代謝功能：肝細(xì)胞尿素合成（>0.5mmol/L/24h）、CYP3A4酶活性（>50pmol/min/mgprotein）；1形態(tài)學(xué)與功能學(xué)驗(yàn)證指標(biāo)-動(dòng)態(tài)響應(yīng)性：對(duì)血管生成刺激（VEGF）的出芽能力、對(duì)炎癥刺激（LPS）的TNF-α分泌水平。2基于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的反饋調(diào)控為實(shí)現(xiàn)“構(gòu)建-驗(yàn)證-優(yōu)化”的閉環(huán)，需集成實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與反饋調(diào)控系統(tǒng)：-傳感器集成：在芯片中植入葡萄糖/乳酸傳感器、氧傳感器、pH傳感器，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)代謝物和微環(huán)境變化；-AI預(yù)測(cè)優(yōu)化：通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)分析歷史數(shù)據(jù)，建立“流速-剪切應(yīng)力-細(xì)胞功能”的預(yù)測(cè)模型，動(dòng)態(tài)調(diào)整灌注參數(shù)。例如，當(dāng)監(jiān)測(cè)到乳酸濃度>8mmol/L時(shí)，AI自動(dòng)將流速提高20%，降低乳酸積累。3疾病模型與藥物篩選應(yīng)用仿生血管網(wǎng)絡(luò)模型可更真實(shí)模擬肝病進(jìn)展和藥物響應(yīng)：-肝纖維化模型：通過(guò)灌注TGF-β1激活HSCs，誘導(dǎo)血管周?chē)z原沉積，模擬纖維化中血管“僵硬化”過(guò)程；-藥物肝毒性評(píng)估：灌注對(duì)乙酰氨基酚（APAP），可觀察到“中心區(qū)肝細(xì)胞壞死”（因APAP代謝物NAPQI在中央?yún)^(qū)富集），毒性反應(yīng)較2D模型更敏感；-藥物代謝研究：同時(shí)灌注前藥（如環(huán)磷酰胺）和CYP450誘導(dǎo)劑（如利福平），可監(jiān)測(cè)活性藥物生成與代謝產(chǎn)物清除，預(yù)測(cè)藥物相互作用。04臨床轉(zhuǎn)化與應(yīng)用前景展望ONE臨床轉(zhuǎn)化與應(yīng)用前景展望肝小葉仿生血管網(wǎng)絡(luò)灌注構(gòu)建策略的優(yōu)化，最終目標(biāo)是推動(dòng)臨床轉(zhuǎn)化，解決肝衰竭治療、藥物研發(fā)等領(lǐng)域的瓶頸問(wèn)題。1肝組織工程移植：解決“血管化延遲”難題傳統(tǒng)肝組織工程移植物