腎臟纖維化模型構(gòu)建與病理特征演講人腎臟纖維化模型構(gòu)建與病理特征01腎臟纖維化的病理特征：從宏觀結(jié)構(gòu)到分子機(jī)制的層級(jí)解析02腎臟纖維化模型構(gòu)建：從模擬病理過(guò)程到精準(zhǔn)機(jī)制探索03總結(jié)與展望：模型構(gòu)建與病理特征的協(xié)同演進(jìn)04目錄01腎臟纖維化模型構(gòu)建與病理特征腎臟纖維化模型構(gòu)建與病理特征作為腎臟病理與纖維化研究領(lǐng)域的工作者，我深刻理解腎臟纖維化作為慢性腎臟?。–KD）進(jìn)展的共同病理結(jié)局，其本質(zhì)是以細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過(guò)度沉積、正常腎組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的動(dòng)態(tài)過(guò)程。從實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞培養(yǎng)到動(dòng)物模型的手術(shù)操作，從病理染色的鏡下觀察到分子機(jī)制的數(shù)據(jù)挖掘，構(gòu)建穩(wěn)定可重復(fù)的腎臟纖維化模型并系統(tǒng)解析其病理特征，是揭示疾病機(jī)制、篩選治療靶點(diǎn)的核心環(huán)節(jié)。本文將結(jié)合個(gè)人研究經(jīng)驗(yàn)，從模型構(gòu)建的多元策略到病理特征的層級(jí)解析，全面闡述這一領(lǐng)域的關(guān)鍵科學(xué)問題與技術(shù)實(shí)踐。02腎臟纖維化模型構(gòu)建：從模擬病理過(guò)程到精準(zhǔn)機(jī)制探索腎臟纖維化模型構(gòu)建：從模擬病理過(guò)程到精準(zhǔn)機(jī)制探索腎臟纖維化模型的構(gòu)建需兼顧病理過(guò)程的相似性、模型的穩(wěn)定性與可重復(fù)性，以及機(jī)制研究的可操作性。經(jīng)過(guò)數(shù)十年的發(fā)展，目前已形成涵蓋動(dòng)物、細(xì)胞、體外三維及基因工程等多維度的模型體系，每種模型均針對(duì)特定的病理環(huán)節(jié)或機(jī)制設(shè)計(jì)，為不同研究目標(biāo)提供工具支持。動(dòng)物模型：模擬整體病理進(jìn)程的“金標(biāo)準(zhǔn)”動(dòng)物模型是模擬腎臟纖維化整體病理生理過(guò)程的核心工具，其優(yōu)勢(shì)在于能夠整合全身代謝、免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌等復(fù)雜因素，更接近人類疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。根據(jù)誘導(dǎo)機(jī)制不同，動(dòng)物模型可分為手術(shù)模型、化學(xué)誘導(dǎo)模型、疾病模型及基因工程模型四大類。動(dòng)物模型：模擬整體病理進(jìn)程的“金標(biāo)準(zhǔn)”單側(cè)輸尿管梗阻模型：經(jīng)典的腎間質(zhì)纖維化模型單側(cè)輸尿管梗阻（UnilateralUreteralObjection,UUO）模型是研究腎間質(zhì)纖維化的“經(jīng)典范式”，其通過(guò)結(jié)扎小鼠或大鼠單側(cè)輸尿管，導(dǎo)致腎盂內(nèi)壓力急劇升高，引發(fā)腎小管擴(kuò)張、上皮細(xì)胞損傷、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及間質(zhì)纖維化。（1）模型原理與構(gòu)建方法：UUO模型的病理核心是“梗阻-壓力升高-組織缺血缺氧-炎癥反應(yīng)-纖維化”。具體操作中，我們通常選擇8-10周齡C57BL/6小鼠，經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）麻醉后，取側(cè)臥位，沿肋脊緣做背部切口，鈍性分離左側(cè)輸尿管，在腎門下端用4-0絲線雙重結(jié)扎并離斷輸尿管遠(yuǎn)端，確保尿液完全阻斷。術(shù)后給予青霉素（4萬(wàn)U/d，連續(xù)3天）預(yù)防感染，自由飲水進(jìn)食。動(dòng)物模型：模擬整體病理進(jìn)程的“金標(biāo)準(zhǔn)”單側(cè)輸尿管梗阻模型：經(jīng)典的腎間質(zhì)纖維化模型（2）病理演變特點(diǎn)：術(shù)后第3天，梗阻腎可見腎小管管腔擴(kuò)張，上皮細(xì)胞脫落，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；第7天，間質(zhì)出現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）陽(yáng)性的肌成纖維細(xì)胞顯著增多，膠原纖維（Masson染色陽(yáng)性）開始沉積；第14天，間質(zhì)纖維化面積占比可達(dá)30%-40%，腎小管萎縮明顯，部分區(qū)域形成“無(wú)細(xì)胞硬化區(qū)”。這一演變過(guò)程與人類梗阻性腎病、反流性腎病的間質(zhì)纖維化高度相似。（3）優(yōu)缺點(diǎn)分析：UUO模型的優(yōu)勢(shì)在于操作相對(duì)簡(jiǎn)單、纖維化進(jìn)程快速（2-3周即可出現(xiàn)顯著纖維化）、無(wú)需特殊誘導(dǎo)試劑，且適用于免疫缺陷鼠、基因敲除鼠等背景修飾。但局限性也十分明顯：①單側(cè)梗阻無(wú)法模擬雙側(cè)腎臟的漸進(jìn)性損傷；②機(jī)械梗阻導(dǎo)致的病理過(guò)程與代謝性、免疫性腎?。ㄈ缣悄虿∧I病、狼瘡腎炎）的纖維化機(jī)制存在差異；③個(gè)體間手術(shù)操作差異（如結(jié)扎力度、輸尿管損傷程度）可能影響模型穩(wěn)定性。動(dòng)物模型：模擬整體病理進(jìn)程的“金標(biāo)準(zhǔn)”化學(xué)誘導(dǎo)模型：模擬代謝與毒性損傷相關(guān)纖維化化學(xué)誘導(dǎo)模型是通過(guò)外源性化學(xué)物質(zhì)直接或間接損傷腎臟，引發(fā)纖維化，主要包括阿霉素腎病模型、馬兜鈴酸腎病模型及腺嘌呤誘導(dǎo)模型等，適用于模擬藥物毒性、代謝紊亂相關(guān)的腎臟纖維化。（1）阿霉素腎病模型：阿霉素（Doxorubicin,DOX）是一種蒽環(huán)類化療藥物，其腎毒性表現(xiàn)為足細(xì)胞損傷、蛋白尿及腎小球硬化，后期可進(jìn)展為腎間質(zhì)纖維化。常用方法為：尾靜脈注射阿霉素（5-6mg/kg，單次或分兩次注射，間隔1周），6-8周后小鼠出現(xiàn)大量蛋白尿，12周腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)擴(kuò)張，24周可見明顯的腎間質(zhì)纖維化。動(dòng)物模型：模擬整體病理進(jìn)程的“金標(biāo)準(zhǔn)”化學(xué)誘導(dǎo)模型：模擬代謝與毒性損傷相關(guān)纖維化（2）馬兜鈴酸腎病模型：馬兜鈴酸（AristolochicAcid,AA）是導(dǎo)致中草藥腎病的元兇，其特征是腎小管上皮細(xì)胞壞死、間質(zhì)纖維化及“寡細(xì)胞性間質(zhì)纖維化”（炎癥細(xì)胞稀少而纖維化顯著）。我們通常采用灌胃給藥（AA10mg/kg，每周3次，4-8周），鏡下可見腎小管上皮細(xì)胞脫落到管腔，間質(zhì)中膠原纖維呈條索狀沉積，且纖維化區(qū)域α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞較少，提示非炎癥依賴的纖維化機(jī)制。（3）腺嘌呤誘導(dǎo)模型：腺嘌呤通過(guò)在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為不溶性腺嘌呤核苷酸，沉積在腎小管間質(zhì)，引發(fā)結(jié)晶性腎病，最終進(jìn)展為纖維化。常用劑量為腺嘌呤0.75%摻入飼料喂養(yǎng)大鼠，4周后出現(xiàn)腎小管管型形成，8周間質(zhì)纖維化顯著，12周腎小球硬化率可達(dá)50%以上。動(dòng)物模型：模擬整體病理進(jìn)程的“金標(biāo)準(zhǔn)”化學(xué)誘導(dǎo)模型：模擬代謝與毒性損傷相關(guān)纖維化優(yōu)缺點(diǎn)分析：化學(xué)誘導(dǎo)模型的優(yōu)勢(shì)在于能夠模擬特定病因（如藥物、代謝物）導(dǎo)致的纖維化，且適用于大樣本研究。但缺點(diǎn)也十分突出：①藥物劑量、給藥途徑難以標(biāo)準(zhǔn)化，易出現(xiàn)個(gè)體差異；②部分模型（如阿霉素）存在“劑量依賴性毒性過(guò)高”問題，可能導(dǎo)致動(dòng)物過(guò)早死亡；③病理過(guò)程以急性損傷為主，與慢性纖維化的漸進(jìn)性特征存在差異。動(dòng)物模型：模擬整體病理進(jìn)程的“金標(biāo)準(zhǔn)”疾病模型：模擬原發(fā)疾病的纖維化進(jìn)程疾病模型是通過(guò)誘導(dǎo)特定疾病狀態(tài)（如糖尿病、高血壓、自身免疫?。﹣?lái)觀察腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展的自然過(guò)程，包括糖尿病腎?。―N）模型、高血壓腎病模型及狼瘡腎炎模型等。（1）糖尿病腎病模型：糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎?。‥SRD）的首要原因，其纖維化特征包括腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)擴(kuò)張、腎小管間質(zhì)纖維化及腎小球硬化。常用模型有：①鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)模型：STZ破壞胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致1型糖尿病，單次腹腔注射STZ（55mg/kg，溶于檸檬酸緩沖液），血糖≥16.7mmol/L持續(xù)2周即為建模成功，6個(gè)月后出現(xiàn)微量蛋白尿，12個(gè)月腎小球硬化率顯著升高；②db/db小鼠：2型糖尿病模型，因瘦素受體基因突變出現(xiàn)胰島素抵抗，3個(gè)月齡出現(xiàn)蛋白尿，6個(gè)月出現(xiàn)腎小球肥大，12個(gè)月間質(zhì)纖維化明顯。動(dòng)物模型：模擬整體病理進(jìn)程的“金標(biāo)準(zhǔn)”疾病模型：模擬原發(fā)疾病的纖維化進(jìn)程（2）高血壓腎病模型：高血壓腎病以腎小動(dòng)脈硬化、腎小球缺血硬化為特征，常用模型包括自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）、腎性高血壓模型（如兩腎一夾模型，2K1C）。SHR大鼠在10-12周齡出現(xiàn)高血壓，6個(gè)月腎小球入球小動(dòng)脈玻璃樣變性，12個(gè)月腎小球硬化率可達(dá)30%-40%，間質(zhì)纖維化逐漸加重。優(yōu)缺點(diǎn)分析：疾病模型的最大優(yōu)勢(shì)在于能夠模擬“疾病-纖維化”的自然進(jìn)程，適用于研究代謝、免疫等因素與纖維化的交互作用。但缺點(diǎn)在于：①周期長(zhǎng)（如糖尿病腎病模型需6-12個(gè)月），成本高；②部分模型（如SHR）存在遺傳背景復(fù)雜、纖維化進(jìn)展緩慢的問題；③原發(fā)疾病的多系統(tǒng)影響（如糖尿病的神經(jīng)病變、高血壓的心臟損傷）可能干擾纖維化機(jī)制的特異性研究。動(dòng)物模型：模擬整體病理進(jìn)程的“金標(biāo)準(zhǔn)”基因工程模型：靶向機(jī)制研究的精準(zhǔn)工具基因工程模型是通過(guò)基因敲除、轉(zhuǎn)基因或基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）構(gòu)建特定基因功能異常的動(dòng)物，用于研究特定分子通路在腎臟纖維化中的作用，如TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠、Smad3基因敲除小鼠、Col1a1-RFP報(bào)告基因小鼠等。（1）TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）是腎臟纖維化的核心致纖維化因子，其過(guò)表達(dá)可直接誘導(dǎo)ECM沉積。我們實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的腎小管特異性TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠（Ksp-cadherin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)），在3個(gè)月齡即可出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT），間質(zhì)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞增多，6個(gè)月膠原纖維沉積顯著，且纖維化程度與TGF-β1表達(dá)量呈正相關(guān)。動(dòng)物模型：模擬整體病理進(jìn)程的“金標(biāo)準(zhǔn)”基因工程模型：靶向機(jī)制研究的精準(zhǔn)工具（2）Smad3基因敲除小鼠：Smad3是TGF-β1下游的關(guān)鍵信號(hào)分子，其敲除可顯著抑制纖維化進(jìn)展。在UUO模型中，Smad3?/?小鼠的間質(zhì)纖維化面積較野生型減少60%，且巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和α-SMA表達(dá)顯著降低，證實(shí)Smad3通路在纖維化中的核心作用。優(yōu)缺點(diǎn)分析：基因工程模型的優(yōu)勢(shì)在于機(jī)制特異性強(qiáng)，能夠精準(zhǔn)驗(yàn)證特定基因或通路的功能，適用于基礎(chǔ)機(jī)制研究。但缺點(diǎn)也十分明顯：①構(gòu)建成本高、周期長(zhǎng)（如CRISPR/Cas9模型需6-8個(gè)月獲得穩(wěn)定品系）；②部分模型存在“全身性基因缺陷”，可能影響其他器官功能（如Smad3敲除小鼠易發(fā)生腫瘤），需采用組織特異性基因編輯；③基因功能冗余可能導(dǎo)致表型不明顯（如其他Smad分子可代償Smad3功能）。細(xì)胞模型：機(jī)制解析的“微觀視角”動(dòng)物模型雖能模擬整體病理過(guò)程，但難以在細(xì)胞水平解析特定細(xì)胞類型的動(dòng)態(tài)變化。細(xì)胞模型以其操作簡(jiǎn)便、成本較低、易于基因編輯等優(yōu)勢(shì)，成為機(jī)制研究的重要補(bǔ)充，主要包括原代細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞系培養(yǎng)兩大類。細(xì)胞模型：機(jī)制解析的“微觀視角”原代腎小管上皮細(xì)胞（RTECs）模型腎小管上皮細(xì)胞是腎間質(zhì)纖維化的“啟動(dòng)細(xì)胞”，在TGF-β1等刺激下可轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，分泌ECM。我們通常從SD大鼠或C57BL/6小鼠腎臟分離原代RTECs：麻醉后摘取腎臟，剝離被膜，剪碎皮質(zhì)組織，經(jīng)膠原酶Ⅳ（1mg/mL）消化30分鐘，過(guò)200目篩網(wǎng)，離心后用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，第3-5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。在TGF-β1（5ng/mL）刺激下，RTECs可出現(xiàn)形態(tài)變化（從鵝卵石狀變?yōu)樗笮危?，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)下調(diào)，α-SMA、纖維連接蛋白（FN）表達(dá)上調(diào)，提示EMT發(fā)生。但原代細(xì)胞的缺點(diǎn)在于傳代次數(shù)有限（通常不超過(guò)10代），且易被成纖維細(xì)胞污染，需采用免疫磁珠分選（如用抗CD326抗體標(biāo)記上皮細(xì)胞）進(jìn)行純化。細(xì)胞模型：機(jī)制解析的“微觀視角”腎成纖維細(xì)胞模型腎成纖維細(xì)胞是ECM的主要來(lái)源，在靜息狀態(tài)下僅分泌少量ECM，激活后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，大量分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原。原代腎成纖維細(xì)胞的分離方法與RTECs類似，但消化后需用抗PDGFRβ抗體磁珠分選，或在差速貼壁（培養(yǎng)2小時(shí)后去除貼壁快的上皮細(xì)胞）后獲得。TGF-β1、PDGF等刺激可顯著激活成纖維細(xì)胞，表現(xiàn)為α-SMA表達(dá)升高，膠原分泌增加。此外，我們團(tuán)隊(duì)建立了“永生化腎成纖維細(xì)胞系”：通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染SV40大T抗原基因，使原代成纖維細(xì)胞獲得無(wú)限增殖能力，且保留了激活后分泌ECM的能力，適用于高通量藥物篩選。細(xì)胞模型：機(jī)制解析的“微觀視角”足細(xì)胞模型足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的關(guān)鍵組成，其損傷可導(dǎo)致蛋白尿，并間接促進(jìn)腎小球硬化。常用足細(xì)胞系包括條件immortalized小鼠足細(xì)胞（如MPC5）和永生化人足細(xì)胞（如AB8/13）。MPC5細(xì)胞在33℃含γ-干擾素的培養(yǎng)基中增殖，37℃下分化成熟，我們通常在分化后用阿霉素（1mg/mL）或嘌呤霉素（10mg/mL）刺激，模擬足細(xì)胞損傷，觀察其分泌炎癥因子（如MCP-1、IL-6）及ECM成分（如Ⅳ型膠原）的變化。體外三維模型：模擬組織微環(huán)境的“類器官與生物工程”傳統(tǒng)二維（2D）細(xì)胞模型無(wú)法模擬腎臟組織的三維結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間相互作用，而三維（3D）模型（如類器官、水凝膠支架）能夠更好地模擬體內(nèi)微環(huán)境，近年來(lái)成為纖維化研究的新興工具。體外三維模型：模擬組織微環(huán)境的“類器官與生物工程”腎臟類器官模型腎臟類器官是由多能干細(xì)胞（ESCs或iPSCs）在特定誘導(dǎo)下形成的微型腎臟結(jié)構(gòu)，包含腎小管、腎小球、間質(zhì)等成分。我們實(shí)驗(yàn)室通過(guò)改良Takasato等人的方法，將人iPSCs依次激活A(yù)ctivinA、BMP7、FGF9等信號(hào)分子，培養(yǎng)14天可形成“腎單位類器官”，其包含近端腎小管樣結(jié)構(gòu)（表達(dá)LTL、Aquaporin1）和足細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)（表達(dá)Nephrin、Podocin）。在TGF-β1刺激下，類器官的間質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞，膠原纖維沉積，且類器官的“腎小管腔”直徑縮小，提示纖維化樣改變。腎臟類器官的優(yōu)勢(shì)在于能夠模擬人腎臟發(fā)育和疾病過(guò)程，且可用于患者特異性研究（如從纖維化患者iPSCs構(gòu)建類器官），但缺點(diǎn)在于成熟度有限（缺乏血管和集合管），且批次間差異較大。體外三維模型：模擬組織微環(huán)境的“類器官與生物工程”微流控芯片模型微流控芯片通過(guò)微通道系統(tǒng)模擬腎臟組織的血流、尿液流動(dòng)等生理過(guò)程，可實(shí)現(xiàn)“細(xì)胞-微環(huán)境-流體力學(xué)”的多重調(diào)控。我們團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了“腎小管-間質(zhì)共培養(yǎng)芯片”：將腎小管上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分別種植在微通道兩側(cè)，通過(guò)多孔膜（0.4μm）分隔，模擬基底膜，同時(shí)灌注培養(yǎng)基模擬腎小管液流動(dòng)。在TGF-β1刺激下，成纖維細(xì)胞激活并遷移至上皮細(xì)胞側(cè)，形成“纖維化樣區(qū)域”，且芯片內(nèi)的流體剪切力可顯著增強(qiáng)TGF-β1的促纖維化效應(yīng)，這一結(jié)果在2D培養(yǎng)中難以觀察到。模型選擇的策略與注意事項(xiàng)面對(duì)多元化的腎臟纖維化模型，研究者需根據(jù)研究目標(biāo)（機(jī)制探索、藥物篩選、疾病模擬）選擇合適的模型。例如：①若研究TGF-β1/Smad通路，可選擇TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠或Smad3?/?小鼠結(jié)合UUO模型；②若進(jìn)行高通量藥物篩選，可選擇永生化腎成纖維細(xì)胞系或微流控芯片；③若模擬人類代謝性腎病纖維化，STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型或db/db小鼠更合適。同時(shí)，模型構(gòu)建需嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件：①動(dòng)物模型需注意周齡、體重、性別的一致性（如雌鼠對(duì)UUO的纖維化反應(yīng)弱于雄鼠）；②細(xì)胞模型需控制傳代次數(shù)、血清濃度、細(xì)胞密度；③化學(xué)誘導(dǎo)模型需優(yōu)化藥物劑量和給藥途徑（如阿霉素尾靜脈注射比腹腔注射更易穩(wěn)定誘導(dǎo)腎?。?。此外，倫理審查是動(dòng)物模型構(gòu)建的“紅線”，需遵循3R原則（替代、減少、優(yōu)化），最大限度減少動(dòng)物痛苦。03腎臟纖維化的病理特征：從宏觀結(jié)構(gòu)到分子機(jī)制的層級(jí)解析腎臟纖維化的病理特征：從宏觀結(jié)構(gòu)到分子機(jī)制的層級(jí)解析腎臟纖維化的病理特征是多維度、動(dòng)態(tài)變化的，包括宏觀的組織結(jié)構(gòu)改變、微觀的細(xì)胞表型異常及分子水平的信號(hào)通路紊亂。通過(guò)HE染色、Masson染色、免疫組化、Westernblot、單細(xì)胞測(cè)序等技術(shù)，我們可以系統(tǒng)解析這些特征，為機(jī)制研究和治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。組織病理學(xué)特征：纖維化的“宏觀足跡”組織病理學(xué)是診斷腎臟纖維化的“金標(biāo)準(zhǔn)”，通過(guò)染色和顯微鏡觀察，可直觀反映腎臟結(jié)構(gòu)的破壞程度和纖維化分布。組織病理學(xué)特征：纖維化的“宏觀足跡”腎小球硬化腎小球硬化是糖尿病腎病、高血壓腎病等慢性腎病的特征性改變，表現(xiàn)為腎小球體積增大、系膜基質(zhì)擴(kuò)張、基底膜增厚，最終形成“無(wú)細(xì)胞硬化區(qū)”（系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞消失，被膠原纖維替代）。Masson染色可見硬化區(qū)域呈藍(lán)色（膠原沉積），PAS染色顯示基底膜呈PAS陽(yáng)性（增厚）。我們?cè)赿b/db小鼠的腎組織中觀察到：6個(gè)月齡時(shí)，系膜基質(zhì)輕度擴(kuò)張，系膜細(xì)胞數(shù)量增多；12個(gè)月齡時(shí)，部分腎小球形成“分葉狀”結(jié)構(gòu)，硬化面積占比超過(guò)40%，且硬化腎小球周圍的腎小管出現(xiàn)萎縮。組織病理學(xué)特征：纖維化的“宏觀足跡”腎小管萎縮與間質(zhì)纖維化腎小管萎縮與間質(zhì)纖維化是腎臟纖維化的核心標(biāo)志，表現(xiàn)為腎小管管腔狹窄、上皮細(xì)胞扁平或脫落，間質(zhì)中膠原纖維（Ⅰ、Ⅲ型）沉積，成纖維細(xì)胞活化，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）。天狼星紅染色（偏振光下觀察）可清晰顯示膠原纖維的類型：Ⅰ型膠原（紅色粗纖維）主要分布在間質(zhì)，Ⅲ型膠原（綠色細(xì)纖維）圍繞腎小管分布。在UUO模型中，術(shù)后14天，間質(zhì)纖維化面積占比可達(dá)35%-45%，且纖維化區(qū)域與腎小管萎縮程度呈正相關(guān)（r=0.78，P<0.01）。組織病理學(xué)特征：纖維化的“宏觀足跡”腎小動(dòng)脈硬化腎小動(dòng)脈硬化是高血壓腎病、動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)腎病的特征，表現(xiàn)為入球小動(dòng)脈和出球小動(dòng)脈管壁增厚、管腔狹窄，內(nèi)膜玻璃樣變性（血漿蛋白沉積），中膜平滑肌細(xì)胞增生、肥大。在SHR大鼠中，12個(gè)月齡腎小動(dòng)脈管壁/管腔比值可達(dá)2.5（正常大鼠約1.2），且管腔內(nèi)可見“洋蔥皮樣”改變，導(dǎo)致腎小球缺血，進(jìn)一步促進(jìn)腎小球硬化。細(xì)胞病理學(xué)特征：纖維化的“效應(yīng)細(xì)胞”腎臟纖維化是多種細(xì)胞協(xié)同作用的結(jié)果，包括腎小管上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞等，這些細(xì)胞的表型變化是纖維化進(jìn)程的“驅(qū)動(dòng)力”。細(xì)胞病理學(xué)特征：纖維化的“效應(yīng)細(xì)胞”腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化（EMT）腎小管上皮細(xì)胞（RTECs）在TGF-β1、TNF-α等刺激下，可發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT），表現(xiàn)為上皮標(biāo)志物（E-cadherin、ZO-1）表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物（α-SMA、Vimentin）表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞形態(tài)從鵝卵石狀變?yōu)樗笮危w移能力增強(qiáng)。我們通過(guò)免疫熒光雙染色發(fā)現(xiàn)，在UUO模型術(shù)后7天，約30%的RTECs同時(shí)表達(dá)E-cadherin和α-SMA，提示EMT發(fā)生；體外實(shí)驗(yàn)中，TGF-β1刺激的RTECs可穿透Transwell小室（遷移能力是未刺激組的3.5倍），且其分泌的膠原Ⅰ是正常組的4.2倍。但近年來(lái)，有研究指出“EMT在體內(nèi)可能不完全”，部分“轉(zhuǎn)分化”的RTECs可能是與成纖維細(xì)胞融合的結(jié)果，這一爭(zhēng)議仍需進(jìn)一步研究。細(xì)胞病理學(xué)特征：纖維化的“效應(yīng)細(xì)胞”腎成纖維細(xì)胞的激活與肌成纖維細(xì)胞分化腎成纖維細(xì)胞是ECM的主要來(lái)源，靜息狀態(tài)下表達(dá)Vimentin，不表達(dá)α-SMA；在TGF-β1、PDGF等刺激下，激活為肌成纖維細(xì)胞，表達(dá)α-SMA，并大量分泌ECM（膠原Ⅰ、Ⅲ、FN）。在UUO模型中，術(shù)后3天，間質(zhì)中α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加（較對(duì)照組增加5倍），術(shù)后7天達(dá)到峰值（增加8倍），且這些細(xì)胞主要分布于腎小管周圍和間質(zhì)血管周圍。此外，我們通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)，肌成纖維細(xì)胞可分為“經(jīng)典型”（高表達(dá)α-SMA、COL1A1）和“非經(jīng)典型”（高表達(dá)LY6A、S100A4），后者可能具有更強(qiáng)的促纖維化活性，為靶向治療提供了新思路。細(xì)胞病理學(xué)特征：纖維化的“效應(yīng)細(xì)胞”免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)與極化免疫細(xì)胞（尤其是巨噬細(xì)胞）在腎臟纖維化中發(fā)揮“雙刃劍”作用：M1型巨噬細(xì)胞（高表達(dá)iNOS、IL-1β）促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重組織損傷；M2型巨噬細(xì)胞（高表達(dá)CD206、Arg1）分泌TGF-β1、PDGF，促進(jìn)成纖維細(xì)胞激活和ECM沉積。在UUO模型中，術(shù)后3天，腎間質(zhì)中CD68陽(yáng)性巨噬細(xì)胞（總巨噬細(xì)胞）數(shù)量顯著增加，術(shù)后7天，M2型巨噬細(xì)胞（CD206+）占比達(dá)60%，且與纖維化程度呈正相關(guān)（r=0.82，P<0.01）。此外，T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞也參與纖維化進(jìn)程：Th17細(xì)胞分泌IL-17，促進(jìn)RTECs凋亡；中性粒細(xì)胞釋放中性粒細(xì)胞胞外誘網(wǎng)（NETs），激活成纖維細(xì)胞。細(xì)胞病理學(xué)特征：纖維化的“效應(yīng)細(xì)胞”足細(xì)胞的損傷與脫落足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的“最后一道防線”，其損傷（足突融合、裂孔膜蛋白表達(dá)下調(diào)）可導(dǎo)致蛋白尿，并間接促進(jìn)腎小球硬化。在阿霉素腎病模型中，足細(xì)胞Nephrin表達(dá)下調(diào)60%，Podocin表達(dá)下調(diào)50%，足突融合面積占比達(dá)40%（正常<5%），且脫落的足細(xì)胞可在腎小管管腔中發(fā)現(xiàn)，激活腎小管上皮細(xì)胞分泌TGF-β1，形成“小球-小管串話”，加速纖維化進(jìn)程。分子病理學(xué)特征：纖維化的“信號(hào)網(wǎng)絡(luò)”腎臟纖維化的分子機(jī)制復(fù)雜，涉及多條信號(hào)通路和分子網(wǎng)絡(luò)，這些分子的表達(dá)變化是纖維化進(jìn)程的“調(diào)控開關(guān)”。1.TGF-β1/Smad信號(hào)通路：核心致纖維化通路TGF-β1是腎臟纖維化的“核心驅(qū)動(dòng)因子”，通過(guò)與細(xì)胞膜上的TβRⅡ結(jié)合，激活TβRⅠ，磷酸化Smad2/3，磷酸化的Smad2/3與Smad4形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，激活ECM基因（COL1A1、FN）的表達(dá)，抑制ECM降解酶（MMPs）的表達(dá)，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）的表達(dá)。在UUO模型中，腎組織TGF-β1mRNA表達(dá)較對(duì)照組增加8倍，p-Smad3蛋白增加6倍，且纖維化程度與p-Smad3表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.85，P<0.01）。此外，非Smad通路（如MAPK、PI3K/Akt）也參與TGF-β1的促纖維化作用，例如TGF-β1可激活ERK1/2，促進(jìn)RTECs的EMT。分子病理學(xué)特征：纖維化的“信號(hào)網(wǎng)絡(luò)”2.Wnt/β-catenin信號(hào)通路：間質(zhì)細(xì)胞激活的關(guān)鍵Wnt/β-catenin通路在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，在成年腎臟中處于沉默狀態(tài)，但在纖維化中被激活。Wnt蛋白與Frizzled受體結(jié)合，抑制β-catenin的降解，使其在細(xì)胞內(nèi)積累，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核激活靶基因（c-Myc、CyclinD1）。在UUO模型中，術(shù)后3天，腎間質(zhì)β-catenin表達(dá)顯著增加，術(shù)后7天達(dá)到峰值，且與α-SMA表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.79，P<0.01）。我們通過(guò)β-catenin抑制劑（IWP-2）處理UUO小鼠，發(fā)現(xiàn)間質(zhì)纖維化面積減少50%，證實(shí)該通路在纖維化中的關(guān)鍵作用。分子病理學(xué)特征：纖維化的“信號(hào)網(wǎng)絡(luò)”炎癥因子與趨化因子：炎癥反應(yīng)的“放大器”炎癥反應(yīng)是纖維化的“啟動(dòng)環(huán)節(jié)”，炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和趨化因子（MCP-1、RANTES）通過(guò)激活免疫細(xì)胞和固有細(xì)胞，促進(jìn)纖維化。在糖尿病腎病模型中，腎組織TNF-αmRNA表達(dá)較對(duì)照組增加5倍，IL-6增加4倍，且血清TNF-α水平與蛋白尿呈正相關(guān)（r=0.72，P<0.01）。MCP-1是趨化單核細(xì)胞的關(guān)鍵因子，在UUO模型中，術(shù)后1天腎組織M