青島微藻產(chǎn)業(yè)學會

團體標準

T/QMISXXX-2022

耐高溫金藻規(guī)?；瘮U繁操作規(guī)程

（Operatingproceduresforscale-up

cultivationtechnologyoftheheat?tolerance

Isochrysissp.）

(征求意見稿)

2022-××-××發(fā)布2022-××-××實施

青島微藻產(chǎn)業(yè)協(xié)會發(fā)布I

耐高溫金藻規(guī)?；瘮U繁操作規(guī)程

1范圍

本操作規(guī)程規(guī)定了耐高溫金藻規(guī)?；瘮U繁操作規(guī)程的范圍、術語和定義，耐高溫金藻種質(zhì)來源、高

溫適應性、培養(yǎng)條件、設施和工具、培養(yǎng)、收獲等內(nèi)容。

本操作規(guī)程適用于漁業(yè)苗種生產(chǎn)和養(yǎng)殖中的耐高溫金藻培養(yǎng)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB11893總磷的測定鉬酸銨分光光度法

GB11913溶解氧的測定電化學探頭法

GB6920pH值的測定玻璃電極法

GB11607漁業(yè)水質(zhì)標準

GB3907海水水質(zhì)標準

3術語和定義

3.1耐高溫金藻定義

本規(guī)程中耐高溫金藻是指耐高溫湛江等鞭金藻（Isochrysiszhangjiangensis），藻種保藏號CCTCCNO:

M2019629，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學）。本規(guī)程中耐高溫是指湛江等鞭金藻在室外

培養(yǎng)環(huán)境中可耐受不高于35℃的溫度條件。下列術語和定義適用于本操作規(guī)程。

3.2指數(shù)生長期

藻細胞迅速生長繁殖。在生長條件合適的環(huán)境中，細胞個體尺寸不斷擴大，所含的干物質(zhì)量增加，

達到一定的限度，細胞即分裂產(chǎn)生子細胞。子細胞以幾何級數(shù)增加，生長與分裂。

3.3一級藻種培養(yǎng)

一級保種培養(yǎng)是以3～5L廣口瓶或三角燒瓶作培養(yǎng)容器，用消毒紗布和紙張封口的一種培養(yǎng)方

式，其目的主要是為后續(xù)二級、三級培養(yǎng)做好藻種的準備，一般每天需要搖晃震蕩培養(yǎng)容器。

3.4二級擴種培養(yǎng)

光生物反應器在二級擴種培養(yǎng)培養(yǎng)過程發(fā)揮著至關重要的作用：其中柱式光生物反應器主要由種子

罐、氣體發(fā)生裝置、控制裝置與光源等組成，具有傳質(zhì)效率快、微藻培養(yǎng)密度高等優(yōu)點；平板光生物反

T/QMISxxx-2022

應器主要由種子罐、氣體發(fā)生裝置、控制裝置等組成，具有光照表面積大、光照利用率高、微藻培養(yǎng)密

度高等優(yōu)勢。特殊情況下，可采用容積為50L～100L塑料桶等封閉式培養(yǎng)，培養(yǎng)期間連續(xù)充入空氣。

3.5三級規(guī)?；囵B(yǎng)

本規(guī)程中耐高溫金藻三級培養(yǎng)初始接種密度約為103cells/μL，控制溫度約為25-35℃，培養(yǎng)池pH為

7.5-8.5，主要采用面積為20m2～40m2的培養(yǎng)池或光孵化器。由于有充足的光照和空氣流通（通氣量

~0.1vvm，通氣時間每天約為12h），藻類的繁殖比較快。

3.6土池培養(yǎng)

主要是在指三級培養(yǎng)在養(yǎng)殖塘施肥、接種耐高溫金藻的過程。

3.7批式培養(yǎng)

指在一定的容器中進行，根據(jù)藻類的營養(yǎng)需要加入特定的培養(yǎng)液并接種，當藻類細胞生長繁殖達到

較高的密度后，一次全部收獲或做進一步擴大培養(yǎng)，是耐高溫金藻類常用的培養(yǎng)方法。

3.8半連續(xù)培養(yǎng)

指當培養(yǎng)的藻細胞達到一定密度時，根據(jù)藻類的生長狀態(tài)和對藻類的需求量收獲一部分密度高藻

液，并補充等量的新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

3.9連續(xù)培養(yǎng)

指在培養(yǎng)容器內(nèi)不斷取出達到一定密度的藻細胞培養(yǎng)液的同時，加入等量新的培養(yǎng)液。培養(yǎng)液的交

換量根據(jù)藻細胞的生長密度人為控制。一般適用于室內(nèi)封閉式進行，采用人工光源日光源、自動控制、

充氣培養(yǎng)。

4培養(yǎng)條件、設施和工具

4.1培養(yǎng)用水質(zhì)條件

培養(yǎng)水質(zhì)應符合GB11607、GB3907標準。

4.2培養(yǎng)設施

主要有保種室、培養(yǎng)室等設施，并配有顯微鏡、生物培養(yǎng)箱、空調(diào)等設備。

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4.3培養(yǎng)容器

保種和小型培養(yǎng)的容器主要有0.1～5L的三角燒瓶，二級培養(yǎng)主要采用10～20L玻璃廣口瓶或塑

料桶、50～100L的塑料桶等；三級大面積培養(yǎng)主要采用水泥池、光生物反應器、土池等。

5耐高溫金藻擴繁簡易流程

藻種保存培養(yǎng)→培養(yǎng)液制備→一級培養(yǎng)→二級培養(yǎng)→三級培養(yǎng)

6藻種保存

6.1耐高溫金藻各級培養(yǎng)消毒

培養(yǎng)過程的容器、工具都必須經(jīng)過消毒。藻種保存及各級培養(yǎng)消毒方法如下：

藻種保存、一級培養(yǎng)二級培養(yǎng)三級培養(yǎng)

保存和培養(yǎng)高濃度微將保種室中培養(yǎng)的藻高溫消毒：將經(jīng)120目化學藥劑消毒：將經(jīng)將池子沖洗干凈，加

藻藻種的房間，一般種擴種到3～5L的玻棉袋過濾培養(yǎng)水燒開120目棉袋過濾培養(yǎng)經(jīng)過濾的水到水位

采用0.1～1L的三角璃瓶，用水需經(jīng)過脫脂注入桶內(nèi)密封，冷卻水注入桶內(nèi)，煮沸或80～120m，充氣潑灑

燒瓶培養(yǎng)，用水需經(jīng)棉過濾煮沸，煮沸后維后加培養(yǎng)液，接種培加漂白片有效氯20～經(jīng)80目過濾的漂白粉

過脫脂棉過濾煮沸，持5分鐘～10分鐘，封養(yǎng)。充氣管、氣石煮50mg/L，充氣-停氣-50～100mg/L，用漂

煮沸后維持5分鐘～閉冷卻后使用。培養(yǎng)母沸消毒，煮沸5～10分密封，12～24小時后白水將池壁和過道淋

10分鐘，封閉冷卻后液放入高壓滅菌鍋中，鐘。充氣加硫代硫酸鈉中洗，充氣30～60分鐘

使用。將洗凈的三角加溫到121℃，維持20和，加培養(yǎng)液，接種后停氣，12～24小時

燒瓶、培養(yǎng)母液放入分鐘。玻璃容器瓶口上培養(yǎng)。充氣管、氣石后潑灑硫代硫酸鈉，

高壓滅菌鍋中，加溫放一普通的玻璃漏斗，煮沸消毒或漂白精消充氣1小時左右施肥

到121℃，維持20分加水煮沸5分鐘～10分毒，培養(yǎng)母液煮沸，接種。

鐘，滅菌后放入烘箱，鐘，消毒完畢即用消毒煮沸5～10分鐘。

加熱至120℃后，恒溫的紙或消毒的紗布包

2小時進行干燥消毒。扎瓶口。

6.2接種

6.2.1藻種質(zhì)量

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藻種無污染，主要借助水色、觸摸、味道、鏡檢等有無異常判斷。指數(shù)生長期，耐高溫金藻藻液應

均勻，細胞無附壁。

6.2.2接種濃度

接種時間在早上8:00～10:00。接種的藻類在指數(shù)生長期，一級培養(yǎng)接種濃度為1:5～1:10，當一級

種子細胞濃度達到5000cells/μL時可接入二級擴種培養(yǎng)；二級培養(yǎng)接種濃度1:10～1:50，而當二級種子

細胞濃度約為2000-3000cells/μL時可接入三級擴種培養(yǎng)；三級培養(yǎng)根據(jù)天氣、擴繁規(guī)模來接種，接種

濃度1:15～1:30。

6.3培養(yǎng)液配置

選擇合適容積的容器，按照6.1描述的方法進行滅菌、干燥及消毒。準確稱量硝酸鉀、磷酸氫二鉀、

檸檬酸鐵、尿素，使用消毒海水定容，將液體放入高壓滅菌鍋中，加溫到121℃，維持20分鐘。滅菌冷

卻后加入維生素B1及維生素B12。

附表1耐高溫金藻規(guī)?；瘮U繁培養(yǎng)液配方

培養(yǎng)液名稱培養(yǎng)液配方

成份一級培養(yǎng)用量二級培養(yǎng)用量三級培養(yǎng)用量

硝酸鉀（KNO3）60.00g50.00g20.00g

磷酸二氫鉀（KH2PO4）5.00g5.00g3.00g

檸檬酸鐵（FeC6H5O7）0.5g0.5g0.30g

耐高溫金藻

培養(yǎng)液尿素（NH2CONH2）/10.00g10.00g

維生素B10.10mg0.05mg/

維生素B120.01mg0.005mg/

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消毒海水1m31m31m3

7日常管理

7.1觀察與處理

定期進行顯微鏡檢查，從藻細胞的形態(tài)、懸浮、污染情況等了解細胞生長是否正常。注意觀察藻液

顏色，有無附壁、沉淀、菌膜和敵害生物現(xiàn)象，如發(fā)現(xiàn)異常，立即去除，及時接種培養(yǎng)。

7.1.1一級培養(yǎng)

保種室保持干凈，注意天氣變化，調(diào)控溫度室內(nèi)溫度保持在27～35℃，鹽度30g/L，光照用日光

燈調(diào)節(jié)在100μmolm-2s-1左右，每天搖晃4～6次。如附圖1所示。

7.1.2二級培養(yǎng)

二級培養(yǎng)室保持良好采光通風，光照采用自然光照結合人工光源，光照強度調(diào)節(jié)在100μmolm-2s-1

左右。柱式反應器使用時加入占總體積2/3的培養(yǎng)基加藻液，隨后蓋上塞子與插入玻璃通氣管，打開氣

體發(fā)生裝置通入所需氣體，調(diào)整通氣量。調(diào)整室內(nèi)空氣與反應器光照強度。將平板光反應器與地面垂直

放置，將其平行置于兩排燈管之中，調(diào)整氣體流量計與溫度。如附圖1所示。

7.1.3三級培養(yǎng)

三級培養(yǎng)區(qū)注意池子的消毒、過道的消毒，尤其在夏季高溫要注意通風和光照，及時開窗、用遮光

簾或遮陽布等設施，調(diào)節(jié)溫度避免高于35℃。檢查充氣量、藻種培養(yǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)污染及時處理。施肥

是將營養(yǎng)鹽用淡水或中和的消毒水融化，全池潑灑。如附圖1所示。

7.2營養(yǎng)鹽補充

鏡檢三級培養(yǎng)藻細胞狀態(tài)、pH值、水溫及藻細胞濃度變化，根據(jù)藻細胞鏡檢狀態(tài)及培養(yǎng)液中檢測到

的營養(yǎng)鹽濃度等情況及時補充營養(yǎng)鹽。

8投喂

8.1鮮活藻體投喂

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在接種3～5天后，根據(jù)耐高溫金藻生長情況，及時進行補充培養(yǎng)液或進行投喂。耐高溫金藻經(jīng)各

培養(yǎng)階段，最終達到苗種及養(yǎng)殖生產(chǎn)單位所要求的藻種濃度和質(zhì)量。投喂的指數(shù)生長期藻種為宜，投喂

耐高溫金藻的藻種濃度約在~103cells/μL左右。

8.2冷凍藻體投喂

8.2.1冷凍保存

培養(yǎng)出來的耐高溫金藻如果暫時不能投喂時，利用離心、濃縮設備收集藻類，-18℃以下冷凍保存，

以備隨時投喂使用。

8.2.2冷凍后投喂

附圖1耐高溫金藻各級培養(yǎng)示意圖

藻種保存與一級培養(yǎng)二級培養(yǎng)圖三級培養(yǎng)圖

藻株保存一級培養(yǎng)二級培養(yǎng)三級培養(yǎng)

9記錄

9.1藻種記錄

包括藻細胞數(shù)、色澤、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。

9.2養(yǎng)殖過程記錄

包括一級、二級、三級培養(yǎng)中藻細胞數(shù)、色澤、氣味、污染雜菌及培養(yǎng)條件。

9.3記錄一般保存兩年

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前言

金藻作為高值化開發(fā)利用的重要藻類，也是餌料微藻的典型代表。溫度是影響水產(chǎn)養(yǎng)殖生物生長的

重要環(huán)境因子，微藻的耐高溫特性對水產(chǎn)養(yǎng)殖有著重要科學意義，為指導耐高溫金藻的水產(chǎn)應用及規(guī)范

性擴繁操作，提高社會效益，制定本標準。

本標準按GB/T1.1《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。

本標準由寧波大學提出，青島微藻產(chǎn)業(yè)學會歸口管理。

本標準起草單位：寧波大學，福建省大來種苗科技有限公司

本標準主要起草人：徐繼林、曹嘉懿、周成旭、程鵬飛、周海波

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耐高溫金藻規(guī)?；瘮U繁操作規(guī)程

1范圍

本操作規(guī)程規(guī)定了耐高溫金藻規(guī)?；瘮U繁操作規(guī)程的范圍、術語和定義，耐高溫金藻種質(zhì)來源、高

溫適應性、培養(yǎng)條件、設施和工具、培養(yǎng)、收獲等內(nèi)容。

本操作規(guī)程適用于漁業(yè)苗種生產(chǎn)和養(yǎng)殖中的耐高溫金藻培養(yǎng)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB11893總磷的測定鉬酸銨分光光度法

GB11913溶解氧的測定電化學探頭法

GB6920pH值的測定玻璃電極法

GB11607漁業(yè)水質(zhì)標準

GB3907海水水質(zhì)標準

3術語和定義

3.1耐高溫金藻定義

本規(guī)程中耐高溫金藻是指耐高溫湛江等鞭金藻（Isochrysiszhangjiangensis），藻種保藏號CCTCCNO:

M2019629，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學）。本規(guī)程中耐高溫是指湛江等鞭金藻在室外

培養(yǎng)環(huán)境中可耐受不高于35℃的溫度條件。下列術語和定義適用于本操作規(guī)程。

3.2指數(shù)生長期

藻細胞迅速生長繁殖。在生長條件合適的環(huán)境中，細胞個體尺寸不斷擴大，所含的干物質(zhì)量增加，

達到一定的限度，細胞即分裂產(chǎn)生子細胞。子細胞以幾何級數(shù)增加，生長與分裂。

3.3一級藻種培養(yǎng)

一級保種培養(yǎng)是以3～5L廣口瓶或三角燒瓶作培養(yǎng)容器，用消毒紗布和紙張封口的一種培養(yǎng)方

式，其目的主要是為后續(xù)二級、三級培養(yǎng)做好藻種的準備，一般每天需要搖晃震蕩培養(yǎng)容器。

3.4二級擴種培養(yǎng)

光生物反應器在二級擴種培養(yǎng)培養(yǎng)過程發(fā)揮著至關重要的作用：其中柱式光生物反應器主要由種子

罐、氣體發(fā)生裝置、控制裝置與光源等組成，具有傳質(zhì)效率快、微藻培養(yǎng)密度高等優(yōu)點；平板光生物反

T/QMISxxx-2022

應器主要由種子罐、氣體發(fā)生裝置、控制裝置等組成，具有光照表面積大、光照利用率高、微藻培養(yǎng)密

度高等優(yōu)勢。特殊情況下，可采用容積為50L～100L塑料桶等封閉式培養(yǎng)，培養(yǎng)期間連續(xù)充入空氣。

3.5三級規(guī)模化培養(yǎng)

本規(guī)程中耐高溫金藻三級培養(yǎng)初始接種密度約為103cells/μL，控制溫度約為25-35℃，培養(yǎng)池pH為

7.5-8.5，主要采用面積為20m2～40m2的培養(yǎng)池或光孵化器。由于有充足的光照和空氣流通（通氣量

~0.1vvm，通氣時間每天約為12h），藻類的繁殖比較快。

3.6土池培養(yǎng)

主要是在指三級培養(yǎng)在養(yǎng)殖塘施肥、接種耐高溫金藻的過程。

3.7批式培養(yǎng)

指在一定的容器中進行，根據(jù)藻類的營養(yǎng)需要加入特定的培養(yǎng)液并接種，當藻類細胞生長繁殖達到

較高的密度后，一次全部收獲或做進一步擴大培養(yǎng)，是耐高溫金藻類常用的培養(yǎng)方法。

3.8半連續(xù)培養(yǎng)

指當培養(yǎng)的藻細胞達到一定密度時，根據(jù)藻類的生長狀態(tài)和對藻類的需求量收獲一部分密度高藻

液，并補充等量的新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

3.9連續(xù)培養(yǎng)

指在培養(yǎng)容器內(nèi)不斷取出達到一定密度的藻細胞培養(yǎng)液的同時，加入等量新的培養(yǎng)液。培養(yǎng)液的交

換量根據(jù)藻細胞的生長密度人為控制。一般適用于室內(nèi)封閉式進行，采用人工光源日光源、自動控制、

充氣培養(yǎng)。

4培養(yǎng)條件、設施和工具

4.1培養(yǎng)用水質(zhì)條件

培養(yǎng)水質(zhì)應符合GB11607、GB3907標準。

4.2培養(yǎng)設施

主要有保種室、培養(yǎng)室等設施，并配有顯微鏡、生物培養(yǎng)箱、空調(diào)等設備。

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4.3培養(yǎng)容器

保種和小型培養(yǎng)的容器主要有0.1～5L的三角燒瓶，二級培養(yǎng)主要采用10～20L玻璃廣口瓶或塑

料桶、50～100L的塑料桶等；三級大面積培養(yǎng)主要采用水泥池、光生物反應器、土池等。

5耐高溫金藻擴繁簡易流程

藻種保存培養(yǎng)→培養(yǎng)液制備→一級培養(yǎng)→二級培養(yǎng)→三級培養(yǎng)

6藻種保存

6.1耐高溫金藻各級培養(yǎng)消毒

培養(yǎng)過程的容器、工具都必須經(jīng)過消毒。藻種保存及各級培養(yǎng)消毒方法如下：

藻種保存、一級培養(yǎng)二級培養(yǎng)三級培養(yǎng)

保存和培養(yǎng)高濃度微將保種室中培養(yǎng)的藻高溫消毒：將經(jīng)120目化學藥劑消毒：將經(jīng)將池子沖洗干凈，加

藻藻種的房間，一般種擴種到3～5L的玻棉袋過濾培養(yǎng)水燒開120目棉袋過濾培養(yǎng)經(jīng)過濾的水到水位

采用0.1～1L的三角璃瓶，用水需經(jīng)過脫脂注入桶內(nèi)密封，冷卻水注入桶內(nèi)，煮沸或80～120m，充氣潑灑