ICS11.220

B41

團體標準

T/CVMAXXXXX—XXXX

山羊痘病毒屬病毒分子生物學檢測方法

Goatpoxvirusisamolecularbiologicaldetectionmethodofthevirus

（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布

T/CVMAXX—XXXX

山羊痘病毒屬病毒分子生物學檢測方法

1范圍

本文件規(guī)定了山羊痘病毒屬分子生物學檢測試劑、儀器設備、實驗操作步驟。

本文件適用于牛組織、分泌物和培養(yǎng)物中山羊痘病毒屬病毒的核酸檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范

3試劑

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，實驗用水應符合GB/T6682中相關規(guī)定。常規(guī)PCR檢測試劑

見附錄B；實時熒光PCR檢測(SYBRGreen法）試劑見附錄C。

4儀器用具

高速冷凍離心機、電子天平、PCR儀、熒光PCR儀、水平電泳系統(tǒng)、-20℃低溫冰箱和-80℃超低溫冰

箱、凝膠成像分析系統(tǒng)、pH計、微波爐、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、可調移

液器（2.5μL，10μL，20μL-100μL，200μL，1000μL）和可調移液器槍頭、滅菌離心管、研

缽等。

5樣品采集

樣品采集按照NY/T541進行。對于病死牛，取皮膚損傷病灶、皮膚結痂處、肺臟、氣管、淋巴結、

消化道黏膜等組織；對于活牛，用棉拭子分別采集同一只牛的唾液、精液和皮膚結節(jié)，放在含有保護液

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（50%甘油生理鹽水）的同一滅菌離心管中，加蓋，編號。

6樣品處理

6.1組織樣品

每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約1.0g，剪碎后取適量于研磨器中研磨，加入1.0mL生

理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至無菌離心管中，置高速冷凍離心機內10,000×g離心2min，取上清液

100μL于1.5mL無菌離心管中。

6.2分泌物和排泄物樣品

將唾液/精液/皮膚結節(jié)棉拭子在振蕩器上充分混合，捻動、擠壓干后棄去拭子。10,000×g離心5

min，吸取上清100μL于1.5mL無菌離心管中。

6.3培養(yǎng)物樣品

將培養(yǎng)物10,000×g離心5min，取上清100μL于1.5mL無菌離心管中。

7病毒DNA的提取

7.1若選用附錄A中所列試劑提取病毒DNA，則參照以下步驟進行操作。

7.1.1取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入裂解液600μL，充分顛倒混勻，室溫靜置3

min～5min；

7.1.2將液體吸入吸附柱中，10,000×g離心30s；

7.1.3棄去收集管中液體，加入600μL洗滌液，10,000×g離心30s；

7.1.4重復上述步驟7.1.3進行洗滌；

7.1.5棄去收集管中液體，10,000×g離心2min，以除去殘留的洗滌液；

7.1.6將吸附柱移入新的1.5mL無菌離心管中，向柱中央加入洗脫液50μL，室溫靜置1min，10,000

×g離心30s，無菌離心管中液體為模板DNA。

7.2若使用病毒DNA試劑盒提取病毒DNA，則按試劑盒說明書進行操作。

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8檢測鑒定

8.1常規(guī)PCR檢測

以含山羊痘病毒屬病毒材料作為陽性對照，以不含山羊痘病毒屬病毒的健康牛組織作為陰性對照，

同時以雙蒸水代替模板作為空白對照。分別提取樣品和對照的總DNA進行PCR檢測，具體操作見附錄B。

8.2實時熒光PCR檢測(SYBRGreen法）

以含山羊痘病毒屬病毒材料作為陽性對照，以不含山羊痘病毒屬病毒的健康牛組織作為陰性對照，

同時以雙蒸水代替模板作為空白對照。分別提取樣品和對照的總DNA進行實時熒光PCR檢測，具體操作

見附錄C。

9結果判定

樣品檢測時，檢測流程及結果判定按照下述原則進行：

----常規(guī)PCR初步篩檢，若檢測結果為陰性，則判定樣品不攜帶山羊痘病毒屬病毒；若檢測結果為

陽性，則采用PCR產物序列測定或實時熒光PCR進行驗證；

----若驗證結果為陽性，則判定樣品攜帶山羊痘病毒屬病毒；若驗證結果為陰性，則判定樣品不含

山羊痘病毒屬病毒。

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附錄A

(規(guī)范性附錄)

DNA提取試劑的配制

A.1保護液（50%生理鹽水）

將生理鹽水緩慢倒入盛有甘油的容器中，按1:1體積比充分混合。

A.2裂解液

異硫氰酸胍236.4g

氯化鈉23.2g

0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液（EDTA）（pH=8.0）40mL

滅菌雙蒸水加至2000mL

EDTA（0.5mol/L,pH=8.0）溶液配制

EDTA18.61g

滅菌雙蒸水80mL

氫氧化鈉調pH至8.0

滅菌雙蒸水加至100mL

A.3洗滌液

磷酸氫二鈉143.2g

磷酸二氫鉀62.4g

氯化鈉18g

滅菌雙蒸水加至2000mL

再加入6000mL無水乙醇，充分混勻。

A.4洗脫液

磷酸氫二鈉143.2g

磷酸二氫鉀62.4g

滅菌雙蒸水加至2000mL

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附錄B

（資料性）

常規(guī)PCR檢測

B.1相關試劑

B.1.1DNA提取相關試劑的配制

見附錄A。

B.1.210×PCR緩沖液的配制

Trisbase6.06g

KCl18.64g

TritonX-1005mL

加無核酸酶滅菌蒸餾水至400mL，用HCl調pH值至9.0（25℃），定容至500mL。高壓滅菌冷卻

后置于2℃~8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

B.1.3引物序列

根據已報道的山羊痘病毒屬病毒基因組序列設計1對用于特異性擴增的熒光染料引物。

山羊痘病毒屬引物序列及目的片段長度

引物引物序列(5′→3′)預期片段大小/bp

正向引物AATCGTATGCCGATGCGGA

231

反向引物AATCATATCCCCCTGTGTACGAAT

B.2常規(guī)PCR檢測

B.2.1總DNA的提取

見正文第7部分“病毒DNA的提取”。

B.2.2PCR擴增

PCR反應體系見表B.1，每個反應設置3個重復。

PCR反應條件：95℃3min，95℃30s，59℃30s，72℃30s，共35個循環(huán)；72℃7min，

擴增產物置于4℃保存。

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表B.1PCR反應體系

名稱加樣量/μL

Buffermix12.5

正向引物1.0

反向引物1.0

DNA模板2.0

ddH2O8.5

總計25.0

B.2.3陰性對照、陽性對照和空白對照的設置

B.2.3.1陽性對照：以含山羊痘病毒屬病毒材料作為陽性對照；

B.2.3.2陰性對照：以不含山羊痘病毒屬病毒的健康牛組織作為陰性對照；

B.2.3.3空白對照：以雙蒸水代替模板作為空白對照。

B.2.4瓊脂糖凝膠電泳

制備1.5%的瓊脂糖凝膠，對PCR產物進行電泳。電泳結束后，在溴化乙錠（EB，濃度為0.5μg/mL）

溶液染色10min，再在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察是否擴增出預期的特異性DNA電泳帶，拍照并作記錄。

B.2.5結果判斷

如果陰性對照和空白對照無特異性擴增，陽性對照在231bp大小處有擴增條帶，待測樣品出現(xiàn)與陽

性對照一致的擴增條帶，則判定為陽性。

如果陰性對照和空白對照無特異性擴增，陽性對照在231bp大小處有擴增條帶，待測樣品未出現(xiàn)與

陽性對照一致的擴增條帶，則判定為陰性。

如果采用PCR產物序列測定方法進一步確認，當序列測定得到的核苷酸序列與已知的山羊痘病毒

屬病毒DNA序列一致時，則判定樣品攜帶山羊痘病毒屬病毒；若序列不一致，則判定樣品不攜帶山羊

痘病毒屬病毒。

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附錄C

（資料性）

實時熒光PCR檢測(SYBRGreen法）

C.1試劑

C.1.1DNA提取相關試劑的配制

見附錄A。

C.1.210×PCR緩沖液的配制

Trisbase6.06g

KCl18.64g

TritonX-1005mL

加無核酸酶滅菌蒸餾水至400mL，用HCL調pH值至9.0（25℃），定容至500mL。高壓滅菌冷

卻后置于2℃~8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

C.1.3引物序列

山羊痘病毒屬引物序列及目的片段長度

引物引物序列(5′→3′)預期片段大小/bp

正向引物TGGGAAAAGGTAGAAAAATCAGGAGG

141

反向引物ATCCGCATCGGCATACGATT

C.2實時熒光PCR檢測

C.2.1總DNA的提取

見正文第7部分“病毒DNA的提取”。

C.2.2實時熒光PCR反應體系(SYBRGreen法）

實時熒光PCR反應體系見表C.1，每個反應設置3個重復。

表C.1PCR反應體系

名稱加樣量/μL

2xPCR緩沖液（MIX）12.5

正向引物（10μmol/L）0.75

反向引物（10μmol/L）0.75

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模板DNA（0.1μg~2μg）2.0

熒光染料50xROX0.5

ddH2O8.5

合計25

C.2.3實時熒光PCR檢測(SYBRGreen法）

在各實時熒光PCR反應管中加入上述試劑后，將管蓋蓋緊，離心5s-10s。將離心后的實時熒光

PCR反應管放入實時熒光PCR檢測系統(tǒng)內，記錄樣本拜訪順序。實時熒光PCR反應程序為：95℃15min，

1個循環(huán)；95℃15s，60℃30s，72℃30s，40個循環(huán)，在每次循環(huán)的延伸時收集熒光。檢測結束

后，根據擴增曲線和Ct值判定結果。每個樣品設置三個平行的反應體系，檢測過程中應分別設立陰性

對照、陽性對照和空白對照。以含山羊痘病毒屬病毒材料作為陽性對照，以不含山羊痘病毒屬病毒的健

康牛組織作為陰性對照，同時以雙蒸水代替模板作為空白對照。

C.2.4結果判斷與描述

C.2.4.1結果分析條件設定

直接讀取檢測結果。閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整。

C.2.4.2對照結果的判定

空白對照：無熒光增幅現(xiàn)象。

陰性對照：無熒光增幅現(xiàn)象。

陽性對照：有熒光增幅現(xiàn)象。

否則，實驗視為無效。

C.2.4.3檢測結果的判定

同時進行的陰性、陽性、空白對照實驗結果正常，檢測樣品無熒光增幅現(xiàn)象，判斷樣品中未檢出山

羊痘病毒屬病毒。

同時進行的陰性、陽性、空白對照實驗結果正常，檢測樣品有熒光增幅現(xiàn)象，且Ct值≤35，則判斷

樣品中檢出山羊痘病毒屬病毒。

同時進行的陰性、陽性、空白對照實驗結果正常，若檢測樣品中熒光增幅曲線的Ct值在35~40之

間，則應重新進行實時熒光PCR反應。再次擴增后的結果Ct值仍在35~40之間，可判斷樣品中檢出山

羊痘病毒屬病毒，否則可判斷樣品中未檢出山羊痘病毒屬病毒。

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前??言

本文件按GB/T1.1-2020給出的規(guī)則起草。

請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。

本文件由中國獸醫(yī)協(xié)會提出并歸口。

本文件起草單位：中國動物疫病預防控制中心、禾旭（鄭州）生物技術有限公司。

本文件主要起草人：孫雨、宋曉暉、王傳彬、王睿男、孫航、馬英、畢一鳴、黃輝、姚強、劉近、

楊轉、姬杰菲、殷笑丹、楊曉帆、石書霞、魯龍、徐秀杰、蘇揚、李凱武、陰思晴

T/CVMAXX—XXXX

山羊痘病毒屬病毒分子生物學檢測方法

1范圍

本文件規(guī)定了山羊痘病毒屬分子生物學檢測試劑、儀器設備、實驗操作步驟。

本文件適用于牛組織、分泌物和培養(yǎng)物中山羊痘病毒屬病毒的核酸檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范

3試劑

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，實驗用水應符合GB/T6682中相關規(guī)定。常規(guī)PCR檢測試劑

見附錄B；實時熒光PCR檢測(SYBRGreen法）試劑見附錄C。

4儀器用具

高速冷凍離心機、電子天平、PCR儀、熒光PCR儀、水平電泳系統(tǒng)、-20℃低溫冰箱和-80℃超低溫冰

箱、凝膠成像分析系統(tǒng)、pH計、微波爐、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、可調移

液器（2.5μL，10μL，20μL-100μL，200μL，1000μL）和可調移液器槍頭、滅菌離心管、研

缽等。

5樣品采集

樣品采集按照NY/T541進行。對于病死牛，取皮膚損傷病灶、皮膚結痂處、肺臟、氣管、淋巴結、

消化道黏膜等組織；對于活牛，用棉拭子分別采集同一只牛的唾液、精液和皮膚結節(jié)，放在含有保護液

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（50%甘油生理鹽水）的同一滅菌離心管中，加蓋，編號。

6樣品處理

6.1組織樣品

每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約1.0g，剪碎后取適量于研磨器中研磨，加入1.0mL生

理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至無菌離心管中，置高速冷凍離心機內10,000×g離心2min，取上清液

100μL于1.5mL無菌離心管中。

6.2分泌物和排泄物樣品

將唾液/精液/皮膚結節(jié)棉拭子在振蕩器上充分混合，捻動、擠壓干后棄去拭子。10,000×g離心5

min，吸取上清100μL于1.5mL無菌離心管中。

6.3培養(yǎng)物樣品

將培養(yǎng)物10,000×g離心5min，取上清100μL于1.5mL無菌離心管中。

7病毒DNA的提取

7.1若選用附錄A中所列試劑提取病毒