1、.,1,植物源農(nóng)藥的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定,張龍來Email：7982233302014.10.20,.,2,一、基本概念1、提?。豪眠m當(dāng)?shù)娜軇┗蚍椒?，將所要成分盡可能從原料中完全提出的過程。2、分離：將提取物中所含的各種成分一一分開，并將得到的單體加以精制的過程。,第一節(jié)植物源農(nóng)藥的提取,.,3,水親水性有機(jī)溶劑親脂性有機(jī)溶劑,二、提取方法,超臨界流體萃取法（SFE）,水蒸氣蒸餾法,溶劑提取法,升華法,壓榨法,溶劑,.,4,（一）溶劑提取法根據(jù)天然成分的溶解性不同，選用對(duì)所需成分溶解度大而對(duì)其他成分溶解度小的溶劑，將所需成分從生物材料中溶解出來的一種提取方法。,.,5,溶劑提取是指溶劑進(jìn)入生物

2、體細(xì)胞，溶解或分散其有用物質(zhì)而變成浸出物的全過程。包括浸潤(rùn)、解吸和擴(kuò)散三個(gè)階段。,1、溶劑提取法的原理,選擇溶劑依據(jù)相似相溶原理。,.,6,浸潤(rùn)：滲透階段溶劑通過細(xì)胞壁滲透到細(xì)胞中。,解吸：溶解階段細(xì)胞內(nèi)容物與細(xì)胞組織之間有親和力，溶劑破除這種親和力。,擴(kuò)散：置換階段利用細(xì)胞內(nèi)的滲透力產(chǎn)生的壓差而抽提出來，用溶劑占領(lǐng)內(nèi)容物的位置而將內(nèi)容物置換出來。,.,7,擴(kuò)散過程表達(dá)式：,dt:擴(kuò)散時(shí)間,F：擴(kuò)散面積，以粉碎度表示,濃度差,D：擴(kuò)散系數(shù),ds:在dt時(shí)間內(nèi)的擴(kuò)散量,.,8,2、選擇溶劑的要點(diǎn)*對(duì)所要成分溶解度大*沸點(diǎn)適中容易回收*低毒安全*廉價(jià)天然產(chǎn)物成分中，萜、甾等大環(huán)、稠環(huán)化合物極性小，

3、易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等易溶于水、乙醇等極性溶劑中；酸堿性成分因存在狀態(tài)不同溶解性不同。最常用的溶劑為乙醇。,.,9,3、溶劑的分類*強(qiáng)極性溶劑：水*親水性有機(jī)溶劑：能與水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮）*親脂性有機(jī)溶劑：不與水任意混溶，可分層（正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、環(huán)己烷、石油醚）常用溶劑的極性大小順序：石油醚四氯化碳苯氯仿乙醚乙酸乙酯正丁醇丙酮100,簡(jiǎn)單的一次萃取，可基本分離。10，數(shù)次乃至10余次萃取，CCD法2，100次以上萃取，DCCC法，HSCCC法1，不能分離,可以根據(jù)PC法計(jì)算值，選擇理想的分離條件。,.,43,2.沉淀分離法,根據(jù)溶解度的不同，控制溶液條件

4、使溶液中的化合物或離子分離的方法統(tǒng)稱為沉淀分離法。方法的主要依據(jù)是溶度積原理。,.,44,根據(jù)沉淀劑的不同，沉淀分離也可以分成用無機(jī)沉淀劑的分離法、用有機(jī)沉淀劑的分離法和共沉淀分離富集法。沉淀分離法和共沉淀分離法的區(qū)別主要是：沉淀分離法主要使用于常量組分的分離（毫克量級(jí)以上）；而共沉淀分離法主要使用于痕量組分的分離（小于1mg/mL）。常用的沉淀分離方法及試劑1、無機(jī)沉淀劑氫氧化物、硫化物、其它沉淀劑。2、有機(jī)沉淀劑草酸、銅試劑、銅鐵試。,.,45,3.結(jié)晶和重結(jié)晶,在化學(xué)里面，熱的飽和溶液冷卻后，溶質(zhì)以晶體的形式析出，這一過程叫結(jié)晶。重結(jié)晶是將晶體溶于溶劑或熔融以后，又重新從溶液或熔體中結(jié)晶

5、的過程。重結(jié)晶可以使不純凈的物質(zhì)獲得純化，或使混合在一起的鹽類彼此分離。,.,46,重結(jié)晶提純法的一般過程1、溶劑選擇2、固體物質(zhì)的溶解3、雜質(zhì)的除去4、晶體的析出5、晶體的收集和洗滌6、晶體的干燥,.,47,4.膜分離,利用膜的選擇性分離實(shí)現(xiàn)料液的不同組分的分離、純化、濃縮的過程稱作膜分離,液膜分離過程分為乳化液膜和固定液膜的分離過程；合成膜的分離過程包括微過濾、超過濾、反滲透、氣體滲透分離、滲透蒸發(fā)、滲析及電滲析等過程。,.,48,二：柱色譜1.吸附柱色譜,吸附分類,物理吸附：無選擇性吸附，吸附-解吸附發(fā)生迅速，吸附劑如硅膠、氧化鋁、活性炭等；化學(xué)吸附：不可逆吸附，如堿性氧化鋁對(duì)酚酸性成分

6、的吸附；酸性硅膠對(duì)生物堿的吸附等；半化學(xué)吸附：聚酰胺對(duì)酚酸類、醌類的氫鍵吸附。,.,49,吸附原理：相似相吸,影響吸附過程的三要素：吸附劑（固定相）溶質(zhì)（被分離物質(zhì)）溶劑（洗脫劑、展開劑、流動(dòng)相）,.,50,2、硅膠、氧化鋁,極性吸附劑：載樣量大，吸附力強(qiáng)硅膠：有中性、酸性之分，適用于各類成分分離。氧化鋁：有中性、酸性、堿性之分，不適合于分離酸性成分，多用于分離生物堿。,.,51,被分離物質(zhì)吸附力與結(jié)構(gòu)的關(guān)系,被分離物質(zhì)極性大，吸附力強(qiáng)，難洗脫，Rf值小。,官能團(tuán)極性大小排列順序：-COOHAr-OHR-OHR-NH2、RNHR、RNRRRCONRRRCHORCORRCOORRORRH,溶劑（

7、洗脫劑）的極性與洗脫力的關(guān)系洗脫劑極性越大，洗脫力越強(qiáng)；,.,52,大黃酸,大黃素,大黃酚,酸性最強(qiáng),酸性其次,酸性最弱,溶于NaHCO3,溶于Na2CO3,溶于NaOH,.,53,例：從黃花夾竹桃果仁中分離到七種強(qiáng)心苷成分，根據(jù)極性大小推測(cè)從硅膠柱上的洗脫順序。,單乙酰黃夾次苷BR=COCH3,其它R=H,.,54,3、活性炭-非極性吸附劑,吸附力與結(jié)構(gòu)的關(guān)系,分子量大者分子量小者芳香族脂肪族，活性炭和芳香族均有平面型分子的緣故。含OH、COOH、NH2多者少者,.,55,3、活性炭-非極性吸附劑,溶劑的洗脫力,吡啶15%酚/醇7%酚/H2O醇含水醇H2O,黃酮、生物堿的富集，糖的分離，脫色

8、等。,應(yīng)用,.,56,4、聚酰胺（Polyamide）,由己酰胺聚合成的一類高分子化合物。,分離原理：主要通過酰胺與酚、酸、醌等化合物形成氫鍵，吸附能力取決于氫鍵的強(qiáng)弱。,.,57,2.分配柱色譜,液-液柱色譜法，其固定相和流動(dòng)相均為液體，液態(tài)固定相又稱固定液，被涂漬在惰性材料載體上構(gòu)成固定相。分配柱色譜法的優(yōu)點(diǎn)是：穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性好，適用樣品的類型廣等。,.,58,固定相極性小于流動(dòng)相，如HPLC反相色譜柱、反相薄層色譜板。固定相：硅膠的硅醇基與烷基結(jié)合，如RP-2、RP-8、RP-18，親脂性：RP-18RP-8RP-2流動(dòng)相（洗脫劑）：MeOH-H2O；CH3CN-H2O洗脫順序：分離極

9、性大的成分，極性大者先被洗脫出來。,.,59,固定相的表面修飾,.,60,3.離子交換色譜,離子交換色譜中的固定相是一些帶電荷的基團(tuán)，這些帶電基團(tuán)通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結(jié)合。如果流動(dòng)相中存在其他帶相反電荷的離子，按照質(zhì)量作用定律，這些離子將與結(jié)合在固定相上的反離子進(jìn)行交換。固定相基團(tuán)帶正電荷的時(shí)候，其可交換離子為陰離子，這種離子交換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團(tuán)帶負(fù)電荷，可用來與流動(dòng)相交換的離子就是陽離子，這種離子交換劑叫做陽離子交換劑。,.,61,陰離子交換柱的功能團(tuán)主要是NH2，及NH3：陽離子交換劑的功能團(tuán)主要是SO3H及COOH。其中-NH3離子交換柱及-SO3H離子交

10、換劑屬于強(qiáng)離子交換劑，它們?cè)诤軓V泛的pH范圍內(nèi)都有離子交換能力；-NH2及-COOH離子交換柱屬于弱離子交換劑，只有在一定的pH值范圍內(nèi)，才能有離子交換能力。離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離，例如，氨基酸自動(dòng)分析儀中的色譜柱，多肽的分離、蛋白質(zhì)的分離，核苷酸、核苷和各種堿基的分離等。,.,62,4、凝膠層析（GelPenetrationChromatography,GPC）,葡聚糖凝膠,交聯(lián)葡聚糖是由一定平均分子量的葡聚糖和交聯(lián)劑（一般為環(huán)氧氯丙烷）以醚橋的形式互相交聯(lián)形成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)高分子材料，是水不溶性的白色球狀顆粒，酸性環(huán)境能水解，堿中穩(wěn)定。,在樣品通過一定孔徑的凝膠固定相時(shí)

11、，由于流經(jīng)路徑的不同，使不同相對(duì)分子量的組分得以分離的方法。,.,63,表面有孔隙，其大小決定于聚糖與交聯(lián)劑的配比及反應(yīng)條件。,商品型號(hào)即按凝膠的交聯(lián)度大小分類，并以吸水量來表示，英文字母G代表葡聚糖凝膠，后面的數(shù)字表示每克凝膠吸水量，再乘以10的值，G-25的吸水量為每克2.5ml。,交聯(lián)度大網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密孔隙越小吸水膨脹越少。,.,64,凝膠的型號(hào)與使用范圍,.,65,層析原理,絕大部分在水溶液中進(jìn)行，凝膠顆粒在適當(dāng)溶劑中浸泡，待充分膨脹后裝入層析柱，加樣后用同一溶液洗脫。在洗脫過程中，較小的分子滲入凝膠，較大的分子隨溶液流動(dòng)，分子量小的物質(zhì)（阻滯作用大）可通過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入粒子內(nèi)部，然后擴(kuò)

12、散出來，故流程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢，后流出色譜柱，分子量大的物質(zhì)沉凝膠粒子間孔隙，隨洗脫液移動(dòng)，流程短，移動(dòng)速度快，先流出色譜柱。,.,66,不同的化合物由于其大小差異，在流經(jīng)GPC柱時(shí)，不同分子量的化合物流經(jīng)體積不同（大分子不能或難以進(jìn)入凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，直接從凝膠顆粒之間穿過，保留時(shí)間短；而小分子恰恰相反，保留時(shí)間較長(zhǎng)）而得以分離。,.,67,常用術(shù)語Vt床體積，凝膠裝柱以后，柱床所占的體積。Vo外水體積，柱床內(nèi)存在于凝膠外面的水相體積。Vi內(nèi)水體積，凝膠顆粒內(nèi)部所含的水相體積。Vg凝膠本身體積。相互關(guān)系：Vt=Vo+Vi+VgVe洗脫體積，自樣品加入時(shí)算起，至流出組分最大濃度出現(xiàn)時(shí)，所流出的

13、體積。,.,68,同一類型化合物，洗脫特征與組分分子量有關(guān)。Ve=K1-K2logM說明不同組分流經(jīng)凝膠柱時(shí)，按分子量大小順序流出，分子量大的，洗脫體積小，最先流出，當(dāng)條件固定時(shí)，Ve重現(xiàn)性很好。,按此特性可測(cè)大分子物質(zhì)的分子量。,.,69,用已知分子量的物質(zhì)分別相繼上柱（5mg），流出液按每管24ml收集，通過硫酸蒽酮顯色，再經(jīng)紫外檢測(cè)，分別求得洗脫體積Ve。再用藍(lán)色葡聚糖測(cè)出柱床的外水體積Vo，按Ve/Vo與分子量對(duì)數(shù)關(guān)系作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后將待測(cè)物質(zhì)分子量用少水溶解上柱，在同樣條件下測(cè)定Ve，根據(jù)Ve/Vo，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得物質(zhì)分子量。,局限性：1、要有標(biāo)準(zhǔn)樣。2、不同的待測(cè)物質(zhì)要有不

14、同的標(biāo)準(zhǔn)樣。,.,70,操作技術(shù)：,溶脹：不同凝膠溶脹時(shí)間不一樣，G-100室溫下最小水化時(shí)間72h，除微顆粒。目的：充分吸水，各孔隙舒張，以利于物質(zhì)分子通過。,裝柱：柱內(nèi)加少量洗脫液，排除底部氣泡，然后將凝膠漿倒入，讓其自然沉降，打開出口，柱床表面不再下沉即緊密。裝好的柱應(yīng)不含氣泡，柱床表面平坦。,.,71,平衡：用3倍床體積洗脫液讓柱平衡流動(dòng)2-3天，至流速恒定。,加樣：平衡后，床表面應(yīng)有12cm的洗脫液，用吸管沿柱壁加入，打開出口，當(dāng)上面液體剛好全部滲入柱內(nèi)時(shí)，滴加洗脫液，注意不能振動(dòng)床表面。,上樣品要體積小，濃度大，這樣峰形好。,.,72,洗脫：一般用水和電解質(zhì)溶液，如酸、堿、鹽的溶液

15、及緩沖溶液。加入5cm以上洗脫液時(shí)，可接高位瓶中的洗脫液，洗脫分階段洗脫和梯度洗脫,收集：分部收集器收集。,檢出：蛋白質(zhì)、核苷酸、多肽用紫外光譜儀在280nm、260nm、230nm測(cè)吸光度值，以樣品體積（或管數(shù)）為橫座標(biāo)，吸光度為縱座標(biāo)，畫出洗脫曲線。,.,73,5、大孔樹脂柱色譜,大孔吸附樹脂的吸附實(shí)質(zhì)為一種物體高度分散或表面分子受作用力不均等而產(chǎn)生的表面吸附現(xiàn)象，這種吸附性能是由于范德華引力或生成氫鍵的結(jié)果。同時(shí)由于大孔吸附樹脂的多孔結(jié)構(gòu)使其對(duì)分子大小不同的物質(zhì)具有篩選作用。通過上述這種吸附和篩選原理，有機(jī)化合物根據(jù)吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附樹脂上經(jīng)一定溶劑洗脫而達(dá)到分離、純

16、化、除雜、濃縮等不同目的。吸附樹脂的表面發(fā)生吸附作用后，會(huì)使樹脂表面上溶質(zhì)的濃度高于溶劑內(nèi)溶質(zhì)的濃度，其結(jié)果引起體系內(nèi)放熱和自由能的下降。,.,74,大孔吸附樹脂按其極性大小和所選用的單體分子結(jié)構(gòu)不同，可分為非極性、中極性和極性三類。（1）非極性大孔吸附樹脂非極性大孔吸附樹脂是由偶極矩很小的單體聚合制得的不帶任何功能基，孔表的疏水性較強(qiáng)，可通過與小分子內(nèi)的疏水部分的作用吸附溶液中的有機(jī)物，最適于極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)，也稱為芳香族吸附劑，例如苯乙烯、二乙烯苯聚合物。,.,75,（2）中等極性大孔吸附樹脂中等極性大孔吸附樹脂是含酯基的吸附樹脂，且多功能團(tuán)的甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑。其表面兼有疏水

17、和親水兩部分。既可極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)，又可由非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)，也稱為脂肪族吸附劑，例如聚丙烯酸酯型聚合物。（3）極性大孔吸附樹脂極性大孔吸附樹脂是指含酰胺基、氰基、酚羥基等含氮、氧、硫極性功能基的吸附樹脂，它們通過靜電相互作用吸附極性物質(zhì)，如丙烯酰胺。,.,76,6.親和色譜,親和色譜也稱為親和層析，是一種利用固定相的結(jié)合特性來分離分子的色譜方法。親和色譜在凝膠過濾色譜柱上連接與待分離的物質(zhì)有一定結(jié)合能力的分子，并且它們的結(jié)合是可逆的，在改變流動(dòng)相條件時(shí)二者還能相互分離。親和色譜可以用來從混合物中純化或濃縮某一分子，也可以用來去處或減少混合物中某一分子的含量。,.,77,紙色譜（

18、PC），也叫紙分配色譜（PPC，PaperPartitionChromatography）,(為紙色譜定數(shù)),Rfa、Rfb為A、B兩物質(zhì)在PC上的Rf值,.,78,pH值,對(duì)于酸性、堿性和兩性化合物，pH值可以改變它們的存在狀態(tài)（游離型、解離型），分配比受pH的影響。,.,79,HA+H2O=A-+H3O+,pKa=pH-logA-/HApH=pKa+logA-/HAHA達(dá)到99%解離時(shí)，pH=pKa+2HA達(dá)到99%游離時(shí)，pH=pKa-2,.,80,2)酸堿性成分的分離-pH梯度萃取法,按酸堿性強(qiáng)弱的不同分離酸性、堿性、中性物質(zhì)，改變pH值使酸堿成分呈不同狀態(tài)。,如中藥大黃中的大黃酸、大黃素和大黃酚的分離,.,81,.,82,.,83,1、氣相色譜2、液相色譜3、制備色譜,八、儀器,氣相色譜儀的原理和結(jié)構(gòu),.,84,第三節(jié)天然產(chǎn)物的鑒定,鑒定天然產(chǎn)物所需做的工作1、元素分析由哪些元素組成，各占