1、.,志賀氏菌的檢驗,.,一、流行病學簡介,一種古老的腸道傳染性腹瀉。19世紀曾出現(xiàn)全世界菌痢的大流行。1899年，日本人志賀氏首先發(fā)現(xiàn)菌痢是由痢疾桿菌引起。第一次世界大戰(zhàn)期間（1914-1918年），德國死于痢疾者約4萬余人，并進一步證實痢疾桿菌是菌痢流行的病原。,.,細菌性痢疾歷年來一直是我國夏秋季發(fā)病率最高的腸道傳染病。近年來報道非洲及中美洲流行的痢疾志賀菌病死率達5%-15%。我國屬發(fā)展中國家，人民的生活條件雖然在不斷改善，但由于部分地區(qū)衛(wèi)生知識普及不夠，食品衛(wèi)生管理、監(jiān)督不力，使得志賀菌的感染在我國傳染病中多年來一直處于較高的地位。,.,每年均有志賀菌感染暴發(fā)的報告，每次暴發(fā)的發(fā)病人數(shù)

2、在數(shù)十人到上千人不等。多數(shù)由于食物和飲水污染引起。1994年5月11日，江蘇省無錫市發(fā)生一起26所小學的學生因課間餐食用豆奶導致1345人食物中毒的事故，后經(jīng)調(diào)查是一起志賀菌和致病性大腸桿菌混合感染引起的食物中毒，此次爆發(fā)波及范圍之大，發(fā)病人數(shù)之多，在我國歷史上頗為少見。,.,志賀菌致病力強，少量細菌進入人體即可引起發(fā)病。是否發(fā)病，取決于細菌數(shù)量、致病力（粘附、侵襲力、毒素）和人體的抵抗力。各種志賀菌都可以產(chǎn)生強烈的內(nèi)毒素，是引起全身毒血癥的主要因素。志賀菌還可產(chǎn)生外毒素（志賀毒素），具有神經(jīng)毒、細胞毒和腸毒性作用，能引起更嚴重的臨床表現(xiàn)如溶血性尿毒綜合癥等。,.,二、生物學特性,（一）、形態(tài)

3、與染色革蘭氏陰性短桿菌、無莢膜，無芽胞，無鞭毛23um*0.50.7um,.,（二）、培養(yǎng)特性,1、需氧或兼氧性厭氧，最適溫度37，PH7.27.42、在普通瓊脂和SS平板上，能形成圓形、微凸、光滑濕潤、無色半透明、邊緣整齊、在中等大小的菌落3、宋氏志賀氏菌菌落較大，較不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可遲發(fā)酵乳糖，菌落呈玫瑰紅色。4、在肉湯中呈均勻混濁生長，無菌膜。,.,（三）、生化反應(yīng),1、發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，除宋氏志賀氏菌外，均不發(fā)酵乳糖。2、不發(fā)酵側(cè)金盞花醇、肌醇、水楊苷。3、不產(chǎn)生H2S，不分解尿素，V-P試驗陰性，不能利用檸檬酸鹽。4、甲基紅陽性。,.,（四）、抗原結(jié)構(gòu),1、抗原

4、構(gòu)成：O抗原：群特異性抗原：A、B、C、DK抗原：除B群外，一般有K抗原,.,2、志賀氏菌的分群與血清型,志賀氏菌分為四群：A群（痢疾志賀氏菌）：110型B群（福氏志賀氏菌）：16型+X、Y兩個變種，C群（鮑氏志賀氏菌）：115型D群（宋內(nèi)氏志賀氏菌）：1個型,.,三、志賀氏菌檢驗GB4789.5-2012,1.以原國標為基礎(chǔ)，保持與原標準的連續(xù)性考慮基層單位方法的可操作性，對增菌步驟、培養(yǎng)條件盡可能簡化；生化反應(yīng)方面亦盡量沿用原標準中的方法2.與國際接軌的原則該標準的起草內(nèi)容主要參考了國際標準組織ISO標準，部分參考采用了美國FDA、NMKL等標準,.,3.與現(xiàn)有已頒布的新版國家標準協(xié)調(diào)統(tǒng)一

5、參考了已頒布的2008版國標，在樣品的前處理步驟，培養(yǎng)條件的選擇，文字描述等方面盡量保持一致。,.,GB/T4789.5-2003標準不足處,1.采用GN增菌肉湯,37需氧培養(yǎng),4小時后大腸菌的生長速度大大超過志賀氏菌,檢測效果較差2.使用的分離平板SS對志賀1型有抑制3.檢驗方法與現(xiàn)行的其它國家的標準存在差異,.,增菌：用GN增菌液使處于瀕死狀態(tài)的細菌恢復活力,選擇性平板分離培養(yǎng)：XLD+MAC/顯色培養(yǎng)基,生化試驗：可采用API20E或VITEK2,血清學鑒定：特異性診斷血清鑒定到種。,志賀氏菌操作流程,.,修改的內(nèi)容,增菌部分志賀氏菌增菌液（新生霉素0.5g/mL）原國標：GNISO：志

6、賀氏菌增菌液（新生霉素0.5g/mL）FDA：志賀氏菌增菌液（新生霉素0.5g/mL和3g/mL）NMKL：志賀氏菌增菌液（新生霉素0.5g/mL）,.,培養(yǎng)條件：41.51厭氧培養(yǎng)原國標：37需氧培養(yǎng)ISO：41.5厭氧培養(yǎng)FDA：42（除宋內(nèi)其他志賀菌)和44（宋內(nèi)）厭氧培養(yǎng)NMKL：42厭氧培養(yǎng),.,分離用平板原國標：HE或SS;MAC或EMBISO：MAC、XLD、HEFDA：MACNMKL：MAC、XLD、HE,.,（一）增菌培養(yǎng),用志賀氏菌增菌液增菌,41.5，16h20h厭氧培養(yǎng)。,.,智能厭氧微需氧培養(yǎng)系統(tǒng),.,（二）分離培養(yǎng),取增菌后的GN增菌液或志賀氏增菌肉湯分別劃線接種于

7、XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或R&F志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板上于361培養(yǎng)20h24h，觀察各個平板上生長的菌落形態(tài)若出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察，則繼續(xù)培養(yǎng)至48h再進行觀察。,.,菌落特征,MAC瓊脂：無色至淺粉紅色，半透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊或不齊，直徑23mmXLD瓊脂：粉紅色至無色，半透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊或不齊，直徑12mm,.,R&F志賀氏菌顯色瓊脂：白色，不透明、圓形、邊緣不整齊，直徑1mm3mm，菌落周圍瓊脂顏色變?yōu)樽霞t色,.,志顯,1宋內(nèi)氏典型菌落,XLD,.,2福氏典型菌落,志顯,XLD,.,XLD,3鮑氏典型菌落,志顯,.,XLD,4痢疾典型菌落

8、,志顯,.,5熟肉制品中宋內(nèi)的分離效果,R&F志顯,XLD,.,志顯,6蔬菜制品中宋內(nèi)分離效果,XLD,.,志顯,7鮑氏在生肉中的分離效果,XLD,.,8熟肉制品中福氏的分離效果,志顯,.,（四）初步生化,選取平板上5個或5個以上可疑菌落接種TSI、葡萄糖半固體、營養(yǎng)瓊脂斜面，361培養(yǎng)20h24h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)物中出現(xiàn)以下情況可以棄去a.在三糖鐵瓊脂斜面上蔓延生長b.發(fā)酵乳糖或蔗糖c.不分解葡萄糖和只生長在半固體表面的d.產(chǎn)氣的e.產(chǎn)生硫化氫f.有動力的培養(yǎng)物,.,初步生化:三糖鐵（TSI）,志賀氏菌都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多不發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)生H2S。如圖中2號管的反應(yīng).,.,志賀氏

9、菌屬四個群的生化特征,.,附加生化實驗,由于某些不活潑的大腸埃希氏菌（anaerogenicE.coli）、A-D（Alkalescens-Disparbiotypes堿性-異型）菌的部分生化特征與志賀氏菌相似，并能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集；因此前面生化實驗符合志賀氏菌屬生化特性的培養(yǎng)物還需另加葡萄糖胺、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(36培養(yǎng)24h48h)。志賀氏菌屬和不活潑大腸埃希氏菌、A-D菌的生化特性區(qū)別見表3,.,（五）生化鑒定,增加了API20E診斷試劑條和全自動細菌生化鑒定儀VITEK；,.,.,.,（六）血清學鑒定,1.抗原的準備志賀氏菌屬沒有動力，所以沒有鞭毛抗原?？乖瓨?gòu)

10、造與分型：志賀氏菌屬細菌的抗原結(jié)構(gòu)由菌體抗原（O）及表面抗原（K）組成。O抗原為糖脂蛋白復合物，可分為型特異性抗原和群特異性抗原。志賀氏菌分為4個群，48個血清型（包括亞型及變種）。K抗原在志賀菌屬分類上無意義。,.,菌體（0）抗原1.型特異性抗原：化學組成為多糖，是光滑型菌株所含有的重要抗原。當菌株變?yōu)榇植谛蜁r，此抗原也常隨之消失，根據(jù)所含的型抗原不同，可將志賀菌屬分為A、B、C、D四個群及39個抗原型。2.群特異性抗原：為光滑型菌株的次要抗原，也是菌體抗原的一種。特異性較低，主要存在于B群。根據(jù)所含的群抗原不同，可將一些菌型分為多種亞型。,.,表面抗原（K抗原）在新分離的某些菌株菌體表面含

11、有此種抗原。不耐熱，加熱1001小時即被破壞。具有此種抗原的菌株，可阻止菌體抗原與相應(yīng)免疫血清發(fā)生凝集。,2.凝集反應(yīng),.,3.血清學分型（選做項目）,先用四種志賀氏菌多價血清檢查，如果呈現(xiàn)凝集，則再用相應(yīng)各群多價血清分別試驗。先用B群福氏志賀氏菌多價血清進行實驗，如呈現(xiàn)凝集，再用其群和型因子血清分別檢查，福氏志賀氏菌各型和亞型的型抗原和群抗原鑒別見表4。如果B群多價血清不凝集，則用D群宋內(nèi)氏志賀氏菌血清進行實驗，如呈現(xiàn)凝集，則用其相和相血清檢查；如果B、D群多價血清都不凝集，則用A群痢疾志賀氏菌多價血清及112各型因子血清檢查，如果上述三種多價血清都不凝集，可用C群鮑氏志賀氏菌多價檢查，并進

12、一步用118各型因子血清檢查。,.,志賀氏菌的O抗原,人們原來的認識認為血清學試驗是特異性的，但是志賀氏菌的O抗原和大腸埃希氏菌屬關(guān)系密切，有半數(shù)的菌型與大腸埃希氏菌的某些O抗原完全相同。相同抗原菌屬間存在血清交叉凝集反應(yīng)。因此，生化試驗對于屬的鑒定是非常重要的。,.,志賀氏菌屬與大腸埃希氏菌的O抗原關(guān)系,O抗原完全相同的：O抗原部分相同的:志賀氏菌屬大腸埃希氏菌志賀氏菌屬大腸埃希氏菌A2。112acA11,120.A3。124A2149A43588-51A3164.A558A488，159.A12(3341-55)152A6130B2b147abA7121B3a5444-80A838,23B4b135A10.144B5129A1129C1149A123C453B群1,2,13,16,1