1、.,1,第六章動物細胞工程制藥,.,2,一、動物細胞的形態(tài)通常將離體培養(yǎng)的細胞分為貼壁細胞、懸浮細胞、兼性貼壁細胞。1、貼壁細胞：細胞的生長必須有給以貼附的支持物表面，細胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面生長、增殖。當細胞在該表面生長后，一般形成兩種形態(tài)：成纖維樣細胞型、上皮樣細胞型。2、懸浮細胞：細胞的生長不依賴于支持物表面，可在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長。如血液中的淋巴細胞。3、兼性貼壁細胞：有些細胞的生長不嚴格地以來于支持物，它既可以貼附于支持物表面上生長，也可以在培養(yǎng)基中呈懸浮狀態(tài)良好地生長。,第一節(jié)動物細胞的形態(tài)與生理特點,.,3,二、動物細胞細胞的生理特點1、細胞的分

2、裂周期長：一般需要12-48h，隨不同的種屬不同而不同。2、細胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象。細胞生長需要于基質(zhì)上貼附，伸展后才能生長繁殖。3、正常二倍體細胞的壽命是有限的。隨著年齡增大而細胞的培養(yǎng)代數(shù)會減少。4、對周圍的環(huán)境十分敏感。5、對培養(yǎng)基的要求高：需要12種必需氨基酸、8種以上的維生素、多種無機鹽和微量元素、葡萄糖、多種細胞生長因子、貼壁因子等才能生長。6、蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細菌不同。,.,4,第二節(jié)生產(chǎn)用動物細胞的獲得一、生產(chǎn)用動物細胞的獲得什么樣的細胞才能允許用以生產(chǎn)人用的藥品，這一直是一個引起人們爭論的熱點。用于生產(chǎn)的動物細胞有：原代細胞、已建立的二倍體細胞系、

3、可無限期傳代的轉(zhuǎn)化細胞系、以及用這些細胞進行融合和重組的工程細胞。1、原代細胞：直接取動物組織、器官，經(jīng)過粉碎、消化而獲得的細胞懸液。2、二倍體細胞系：原代細胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆，而從多種細胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細胞株。,.,5,二倍體細胞株仍具有正常細胞的特點：A、2n染色體核型B、具有明顯的貼壁依賴和接觸抑制C、只有有限的增殖能力、一般可連續(xù)傳代培養(yǎng)50代。D、無致瘤性3、轉(zhuǎn)化細胞系：是通過某個轉(zhuǎn)化過程形成的，常常由于染色體的斷裂變成了異倍體，而失去了正常細胞的特點，獲得了無限增殖的能力。,.,6,二、基因工程細胞的構(gòu)建和篩選1、真核細胞基因表達載體的構(gòu)建目前一般選

4、擇的載體有：（1）病毒載體：牛痘病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和桿狀病毒等。牛痘病毒：構(gòu)建多價疫苗；腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒：用于基因治療；桿狀病毒：作載體用于外源基因表達。桿狀病毒作為載體的優(yōu)點：是雙DNA，易于重組；插入7-8個bp的DNA不會影響正常病毒粒子的形成；多角體蛋白質(zhì)和病毒粒子的形成無直接關系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子；多角體蛋白基因有強啟動子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的20-30%；用顯微鏡可以看到多角體，可以此為標記物來挑選陽性克??；如果用家蠶桿狀病毒，可以在家蠶體內(nèi)直接表達外源基因。,.,7,（2）質(zhì)粒載體常用穿梭質(zhì)粒載體：能在細菌和哺乳動物細胞

5、內(nèi)都能擴增。,2、基因載體的導入和高效表達工程細胞株的篩選,DNA導入動物細胞的常用方法,.,8,高效表達工程細胞株的篩選：依靠構(gòu)建載體內(nèi)的選擇標記采用相應的篩選系統(tǒng)：HAT選擇系統(tǒng)：篩選tk+、hgprt+的轉(zhuǎn)化細胞；G418（geneticin）選擇系統(tǒng)：篩選neor的轉(zhuǎn)化細胞；MTX選擇系統(tǒng)：篩選dhfr+的轉(zhuǎn)化細胞。對選出的細胞要進行克隆和亞克隆使其純化在多數(shù)情況下要利用其擴增系統(tǒng)，不斷增加其基因拷貝數(shù)，從而獲得能高效表達的穩(wěn)定的工程細胞株。,三、常用生產(chǎn)用動物細胞的特性（自學）,.,9,四、細胞庫的建立除原代細胞外，其他的細胞株、細胞系，無論是二倍體細胞、轉(zhuǎn)化細胞、融合細胞還是經(jīng)重組

6、的工程細胞，一旦建立后都要建立細胞庫加以保存。按照我國和美國FDA的規(guī)定，用于生產(chǎn)的工程細胞必須建立2個細胞庫：（1）原始細胞庫（mastercellbank,MCB）；（2）生產(chǎn)用細胞庫（manufacturersworkingcellbank,MWCB）或叫工作細胞庫（workingcellbank,WCB）。,.,10,貯藏細胞的檔案資料：細胞系歷史：來源、動物的年齡、性別、細胞分離方法、所用培養(yǎng)材料（來源于人的還需該人的病史）細胞的特性：形態(tài)、生長特性增倍時間、分種批；種源的特性：核型、同功酶、細胞抗原、特異的標記染色體；用于生產(chǎn)用的重組細胞：載體構(gòu)建的資料、基因拷貝數(shù)、表達產(chǎn)物的性質(zhì)

7、、產(chǎn)量及其穩(wěn)定性。各種有害因子的檢查結(jié)果：細菌、真菌、支原體、各種病毒，包括反轉(zhuǎn)錄病毒。MWCB細胞還需確定其最高使用的傳代數(shù)。,.,11,一、動物細胞的培養(yǎng)條件1、器材的清洗和消毒（1）器材的清洗：用過的器材需要經(jīng)過浸泡、刷洗、泡酸、沖洗4個步驟。用3%磷酸三鈉日夜浸泡過夜。新玻璃器材必須先泡酸。（2）器材的消毒滅菌：所有培養(yǎng)用的器材和液體必須進行嚴格的消毒滅菌處理，方法有：物理消毒-紫外線、干熱、濕熱、過濾；化學法-化學消毒劑和抗生素。,第三節(jié)動物細胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基,.,12,2、水質(zhì)由于動物細胞對微量的有毒元素、過多的金屬離子、微生物的污染很敏感。所以細胞培養(yǎng)用的水必須經(jīng)過特殊處理，

8、才能使用。方法有：蒸餾、離子交換、電滲析、反滲透、中空纖維過濾。3、pH最適pH7.27.4，常在培養(yǎng)基中加入緩沖系統(tǒng)：Na2HPO4/NaH2PO4，NaHCO3/CO2，Tricine-glycine等。4、滲透壓理想滲透壓為290-300mOsm/kg，一般用NaCl的增減來調(diào)節(jié)。每增加或減少1mg/ml，可使培養(yǎng)基的滲透壓增加或減少32mOsm/kg。5、溫度哺乳動物最佳溫度為370.5，昆蟲為27。6、空氣必須給以足夠的氧氣，一般低于空氣中氧的飽和值的60%。,.,13,二、動物細胞培養(yǎng)基的種類和組成動物細胞對培養(yǎng)基的要求較高，且隨著細胞的種屬不同而差異很大。常常需要花很多的時間和精

9、力去對個別的細胞系進行研究，以便配置適宜于這一細胞特殊需要的培養(yǎng)基。用動物細胞制藥之所以成本高，培養(yǎng)基的復雜和昂貴是其主要原因。培養(yǎng)基包括1、天然培養(yǎng)基指在細胞培養(yǎng)的早期使用，如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。2、合成培養(yǎng)基采用成分明確的化學試劑配成的培養(yǎng)基。優(yōu)點：成分明確，組分穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)供應。,.,14,合成培養(yǎng)基的組成：氨基酸類：12種必須氨基酸。它們是：精氨酸、胱氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、奔丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。維生素：A、脂溶性的：VA、VD、VE、VK。B、水溶性的：VB族、VC等糖類：C源，是能量來源。葡萄糖、谷氨酰胺。

10、使用葡萄糖時，要加入丙酮酸鈉；有些還要加入核糖和脫氧核糖、醋酸鈉。無機鹽：主要是保持滲透壓、緩沖pH的變化，并積極參與細胞代謝。一般加入NaCl,KCl,MgSO4,CaCl2,NaH2PO4,NaHCO3等。還有FeSO4,CuSO4,ZnSO4等,.,15,其他成分：合成核酸的前體物質(zhì)，如腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、胸苷。還要加入動物血清，如5-10%的小牛血清，作用機理不明。加入動物血清可能主要是為了：A提供細胞生長增殖所需要的各種生長因子和激素；B提供有利于細胞貼壁所需要的貼附因子和伸展因子；C提供可識別金屬、激素、維生素、脂類的結(jié)合蛋白；D提供細胞生長所必需的脂肪酸和微量元素；E提供良好

11、的pH緩沖系統(tǒng)。,.,16,3、無血清培養(yǎng)基優(yōu)點：A、提高細胞培養(yǎng)的可重復性避免了由于血清批次之間的差異；B、避免了由于血清帶來的病毒、真菌、支原體微生物等的污染；C、供應充足、穩(wěn)定；D、產(chǎn)品易于純化；E、避免了血清中某些因素對有些細胞的毒性；F、減少了血清中某些蛋白對生物測定的干擾，便于實驗結(jié)果的分析。,.,17,無血清培養(yǎng)基中一般需要加入：A、激素和生長因子；B、結(jié)合蛋白；C、貼附和伸展因子；D、其他利于細胞生長的因子和元素：如消除氧自由基損害的谷胱苷肽，微量元素如硒等。,.,18,一、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法根據(jù)培養(yǎng)細胞的種類分為原代細胞培培養(yǎng)和傳代細胞培養(yǎng)，也可以根據(jù)培養(yǎng)容器和方式的不

12、同分為靜止培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、中空纖維培養(yǎng)、固體床和流化床培養(yǎng)等。1、懸浮培養(yǎng)：適用于一切非貼壁細胞的培養(yǎng)，也適應于兼性貼壁細胞。優(yōu)點：操作簡便。培養(yǎng)條件比較均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴大培養(yǎng)規(guī)模。缺點：由于細胞體積小，很難采取灌流培養(yǎng)，因此細胞密度一般比較低。,第四節(jié)動物細胞培養(yǎng)的方式和操作方法,.,19,2、貼壁培養(yǎng)適用于貼壁細胞和兼性貼壁細胞。優(yōu)點：適應于細胞種類廣，因為生產(chǎn)中使用的大多數(shù)細胞都是貼壁細胞，較易采用灌流培養(yǎng)，細胞密度高。缺點：操作比較麻煩，需要合適的貼壁材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易單一，傳質(zhì)和傳氧較差。不便進行擴大培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)在傳代和擴大培養(yǎng)時需要用

13、酶將細胞從基質(zhì)上消化下來。常用的消化物有：胰酶、EDTA、胰酶檸檬酸鹽、胰酶-EDTA聯(lián)合使用。其他如膠原酶、鏈霉蛋白酶、木瓜酶等。他們的作用主要是使細胞間質(zhì)和一些促使細胞貼壁的蛋白因子水解，使細胞從基質(zhì)分離成單個細胞。,.,20,3、貼壁懸浮培養(yǎng)（也稱假懸浮培養(yǎng)）是將貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)二者結(jié)合，優(yōu)勢互補，形成更理想、更適應于工業(yè)化生產(chǎn)的培養(yǎng)方法。（1）微載體培養(yǎng)采用葡聚糖SephadexA50微顆小粒培養(yǎng)貼壁細胞。優(yōu)點：可創(chuàng)造相當大的貼附面積，供細胞貼附生長增殖。由于載體體積小，比重輕，可經(jīng)輕度攪拌即可微小顆粒攜帶細胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)，充分發(fā)揮懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點。,葡聚糖凝膠專用柱,.,

14、21,理想的微載體應該具備的條件：A、微載體表面性質(zhì)與細胞有良好的相容性，適于細胞附著、伸展和增殖；B、微載體的材料無毒性。對培養(yǎng)細胞無毒性，還要不會產(chǎn)生影響產(chǎn)品和人體健康的有害因子；C、微載體的材料是惰性的，不與培養(yǎng)基成分發(fā)生化學反應，也不會吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分；D、微載體的比重在1.0301.045g/ml，使載體在低速攪拌下可以懸浮，而靜止時又可很快沉淀，便于換液和收集；E、粒徑在60-250m（溶脹后）之間為好，且要盡可能均一，差異不大于20m。有利于細胞均勻分布在各微載體表面；F、具有良好的光學透明性，適于在倒置顯微鏡下觀察細胞在載體上的生長情況；G、基質(zhì)是軟的，避免在攪拌中載體互

15、相摩擦而損傷細胞；H、可耐120高溫。便于采用高壓蒸汽滅菌；I、經(jīng)簡單的適當處理后，可以反復多次使用；J、原料充分。制作簡便，廉價。,.,22,目前微載體的材料有兩類：一類在載體中加入鈦，增加比重，適用于流化床反應器。一類不加鈦，比重較輕，可與固體微載體一樣，用于攪拌罐式生物反應器或氣升式生物反應器。（2）包埋和微囊培養(yǎng)細胞不是貼附在載體表面。而是包裹在或包埋在凝膠載體或微囊內(nèi)。如果包埋的凝膠載體較大，就稱為巨載體培養(yǎng)。微囊培養(yǎng)是在包埋培養(yǎng)的基礎上衍生而來的，即將包埋的顆粒經(jīng)液化處理而成為微囊。,.,23,包埋材料的類型：A、人工合成的高分子聚合物：聚丙烯酰胺、環(huán)氧樹脂、聚氨基甲酸酯、聚乙烯醇

16、等。B、糖類：纖維素、瓊脂、瓊脂糖、K卡拉膠、海藻酸鈣、脫乙酰幾丁質(zhì)等。C、蛋白質(zhì)：膠原、明膠、纖維蛋白等。這些材料是靠溫度的變化來變相的，如海藻酸鈣，在鈉鹽時是液態(tài)。形成鈣鹽時則形成凝膠。凝膠的制備常常是在形成凝膠后，再用另外一種電荷相反的材料與之作用，使載體外形成一層聚合膜，然后再使膜內(nèi)的載體液化。,.,24,包埋和微囊培養(yǎng)的優(yōu)點：A、包埋或包裹在載體或微囊內(nèi)的細胞可獲得保護，避免了剪切力的損害；B、可獲得較高的細胞密度。一般在107108細胞/ml；C、控制微囊膜的孔徑，可使產(chǎn)物濃縮在微囊內(nèi)，有利于下游產(chǎn)物的純化；D、可采用多種上午反應器進行大規(guī)模培養(yǎng)，如攪拌罐式生物反應器、氣升式生物反

17、應器。用包埋法，當顆粒直徑較大時，可采用固定床式生物反應器。,.,25,（3）結(jié)團培養(yǎng)利用貼壁細胞有結(jié)團的特點，用攪拌反應器和罐流培養(yǎng)的方式獲得高密度的細胞，開創(chuàng)了細胞結(jié)團培養(yǎng)的新方法。其實質(zhì)是用細胞本身作為基質(zhì)，相互貼附后，再用懸浮的方法進行培養(yǎng)，也是一種貼附懸浮培養(yǎng)。為了加速細胞結(jié)團，往往加入一些直接較小的微粒，促使細胞先附著其上，再相互附著。優(yōu)點：操作簡便，節(jié)省了用于微載體的成本。,.,26,二、動物細胞培養(yǎng)的操作方式1、分批式操作有兩種情況：一是將細胞和培養(yǎng)基一次性加入反應器內(nèi)進行培養(yǎng)，使細胞增殖到一定密度，產(chǎn)物達到一定量后將培養(yǎng)基和細胞一并取出。另一種方式是先將細胞和培養(yǎng)基加入反應器

18、，待細胞生長至一定密度后，向反應器內(nèi)加入誘導劑或病毒，經(jīng)過一段時間作用后，取出反應物。2、半連續(xù)式操作將細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時間，取出部分培養(yǎng)物，然后補充同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基，或另加新鮮載體，繼續(xù)培養(yǎng)。該方法被廣泛采用，優(yōu)點是：操作簡單、生產(chǎn)效率高，可長期進行生產(chǎn)，反復收獲產(chǎn)品，能使細胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平,.,27,3、灌流式操作將細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷將條件培養(yǎng)基取出，同時不斷補充新鮮培養(yǎng)基。它與連續(xù)式操作不同之處是取出部分條件培養(yǎng)基時，絕大部分細胞仍保留在反應器內(nèi)，而連續(xù)式培養(yǎng)則同時也取

19、出了部分細胞。優(yōu)點：A、細胞可處在較穩(wěn)定的良好環(huán)境中，培養(yǎng)條件較好，有害代謝廢物濃度低；B、可極大地提高細胞密度，使產(chǎn)量大大提高；C、產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間縮短可及時收留在低溫下保存，有利于產(chǎn)品質(zhì)量的提高；D、培養(yǎng)基的比消耗率較低，且產(chǎn)量質(zhì)量提高，生產(chǎn)成本明顯降低。,.,28,一、理想的動物細胞反應器必須具備的要求1、制造生物反應器所采用的一切材料，尤其是與培養(yǎng)基、細胞直接接觸的材料必須無毒性；2、生物反應器的結(jié)構(gòu)必須使之具有良好的傳熱、傳質(zhì)和混合性能；3、密封性能良好，可避免一切外來微生物的污染；4、對培養(yǎng)環(huán)境中多種物理化學參數(shù)能自動檢測和調(diào)控；5、可長期連續(xù)運轉(zhuǎn)；6、容器內(nèi)表面要求光滑，無死角

20、，以減少細胞或微生物的沉積；7、拆裝、連接和清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修；8、設備成本低。,第五節(jié)動物細胞生物反應器及其檢測控制系統(tǒng),.,29,二、動物細胞生物反應器的類型1、攪拌罐式反應器：是借鑒細菌發(fā)酵罐改造而來，是最早的動物細胞生物反應器。特點：能供氧、攪拌速度慢、采用無氣泡系統(tǒng)、配置有進出料系統(tǒng)。2、氣升式生物反應器特點：氣體從罐底的導流管進入，使液體形成循環(huán)流。具有剪切力小、混合均勻、氧和營養(yǎng)的傳遞好、利于密封等優(yōu)點。3、中空纖維式生物反應器該反應器由數(shù)百至數(shù)千根中空纖維集束組成。材料為聚砜或丙烯共聚物。4、透析袋或透析膜式生物反應器主要是能夠?qū)⒎肿恿啃《鴮毎L和產(chǎn)物的產(chǎn)生有抑制作用的乳酸、氨等透析或濾掉。5、固定床或流化床式生物反應器特點：結(jié)構(gòu)簡單，添裝材料是對細胞無毒、又有利于細胞貼附的材料?，F(xiàn)用于大量生產(chǎn)疫苗和基因工程產(chǎn)品。,.,30,一、改進表達載體，提高表達水平和產(chǎn)量1、采用雜交瘤技術，提高細胞表達量。2、采用更強的啟動子和增強子。3、更好地利