1、報(bào)告基因分析技術(shù)一、報(bào)告基因報(bào)告基因(reporter gene)是指其表達(dá)產(chǎn)物易被檢測(cè)，且易與內(nèi)源性背景蛋白相區(qū)別的基因。報(bào)告基因技術(shù)是通過(guò)把已確定的順式調(diào)控序列剪接到報(bào)告基因上來(lái)控制基因的活性，這些反應(yīng)元件可以對(duì)宿主細(xì)胞中基因調(diào)控和表達(dá)的變化起反應(yīng)，從而就可以直觀地“報(bào)道”細(xì)胞內(nèi)與基因表達(dá)有關(guān)的信號(hào)級(jí)聯(lián)。報(bào)告基因的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)背景活性低，而且可以將細(xì)胞表面的信號(hào)放大,產(chǎn)生一個(gè)高敏感、易檢測(cè)的反應(yīng)。報(bào)告基因的選擇依賴于所使用的細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)的性質(zhì)，以及對(duì)相應(yīng)檢測(cè)方法的可行性。報(bào)告基因通常是在報(bào)告基因載體質(zhì)粒中與被檢測(cè)基因序列相連, 先讓質(zhì)粒在大腸桿菌中進(jìn)行增殖, 再提取質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)染入感興趣的真

2、核細(xì)胞中。作為報(bào)告基因必須具備以下特點(diǎn)：1、由原核基因編碼的基因產(chǎn)物必須與同轉(zhuǎn)染前真核細(xì)胞內(nèi)任何相似的產(chǎn)物相區(qū)別；2、細(xì)胞內(nèi)其它的基因產(chǎn)物不會(huì)干擾報(bào)告基因產(chǎn)物的檢測(cè)；3、報(bào)告基因編碼的產(chǎn)物的檢測(cè)應(yīng)該快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高而且重現(xiàn)性好。報(bào)告基因的種類很多，根據(jù)對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物的分析檢測(cè)方法的不同，可將其分為體外報(bào)告基因和體內(nèi)報(bào)告基因。前者的分析需要在含有報(bào)告分子的細(xì)胞裂解液或細(xì)胞、組織培養(yǎng)液（分泌型報(bào)告基因）中進(jìn)行報(bào)告分子的定量。較典型的有氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因（CAT）、人生長(zhǎng)激素基因（hGH）及分泌型堿性磷酸酶基因（SEAP）等。后者的分析可以在活的細(xì)胞或組織中，或在已經(jīng)組化固定的組織或細(xì)胞中進(jìn)行

3、。較典型的如綠色熒光蛋白基因（GFP）。而-半乳糖苷酶基因（-Gal）和螢火蟲(chóng)熒光素酶基因既可以在體外分析也可以在體內(nèi)分析。二、報(bào)告基因的種類2.1 氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶報(bào)告基因 ( chlormnphenicol acetyltransferase, CAT) 氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶報(bào)告基因 (CAT)：該報(bào)告基因來(lái)源于大腸桿菌轉(zhuǎn)位子9，是第1個(gè)用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性的報(bào)告基因。氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶可催化乙酰CoA的乙?；D(zhuǎn)移到氯霉素3羥基，而使氯霉素解毒。CAT在哺乳細(xì)胞無(wú)內(nèi)源性表達(dá)，性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期較短，適于瞬時(shí)表達(dá)研究。可用同位素、熒光素和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzymelinkedimmunosorb

4、antassay，ELISA）檢測(cè)其活性，也可進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting）和免疫組織化學(xué)分析。CAT與其他報(bào)告基因相比，線性范圍較窄，靈敏性較低。檢測(cè)方法：1. 轉(zhuǎn)染后 2472 h，用 D-PBSA 液洗滌細(xì)胞。2. 將培養(yǎng)板置于冰上，每孔中加入 1 mL 的 Tris/Triton。3. 將培養(yǎng)板-70 冷凍 2 h。4. 于 37 下解凍培養(yǎng)板，然后將其置于冰上。5. 將細(xì)胞裂解物移至微量離心管中，以最大速度離心 5 min。6. 收集上清液，65 加熱 10 min，以滅活 CAT 抑制物質(zhì)。7. 最大速度離心 3 min 后收集上清液（細(xì)胞裂解物），將上清液保存在

5、-70。8. 從每一樣品中取 5150L 細(xì)胞裂解物，移至一個(gè) 3.5 mL 多聚丙烯閃爍杯中，并且加入足夠的 0.1mol/L Tris，終末體積為 150L。9. 設(shè)空白杯，加入 150L 0.1mol/LTris 液，作為陰性對(duì)照。10. 陽(yáng)性對(duì)照：（a）取 5 個(gè)閃爍杯，各加入 150L 0.1mol/LTris。（b）將 5L 的 CAT 標(biāo)準(zhǔn)液加入到每個(gè)閃爍杯中，繪制 1、5、10、20、50mU 的 CAT 標(biāo)準(zhǔn)曲線。11. 在所有樣品杯（包括對(duì)照）中，加入 100L 以下混合液：（a）84L 超純水（b）10L 0.1mol/LTris（c）1L 的氯霉素（d）5L（50nCi

6、）的14C-CoA12. 擰緊杯蓋，于 37 下孵育 2 h。13. 向所有閃爍杯中加入 3 mL Econofluor，擰緊杯蓋。14. 上下倒置混勻閃爍杯中成分。15. 室溫下孵育 2 h。16. 在一個(gè)液閃計(jì)數(shù)儀上測(cè)定 30s 閃爍次數(shù)。注意事項(xiàng)：1. 在表達(dá)質(zhì)粒擴(kuò)增與制備一步，要特別注意其純度（不能含RNA和染色體DNA）以免影響轉(zhuǎn)化效率2. 制備方法最好選用溶菌酶加Triton10，然后氯化艷梯度離心。3. 一定要有對(duì)照組用CAT酶代替細(xì)胞提取液，來(lái)驗(yàn)證反應(yīng)及層析等過(guò)程的可行性，或用Psv:CAT和Psv。cAT表達(dá)質(zhì)粒驗(yàn)證轉(zhuǎn)化及重組兩步的正確性。4. 在制備細(xì)胞提取液中最好選用超聲

7、波破碎法，離心前要注意檢查破碎程度。凍融法繁瑣有時(shí)破碎不徹底影響結(jié)果。5. 4mmol/L乙酞輔酶A可每次取1.smg溶在500純水中，最好用前配制，配制的溶液可保存于一20，但不可超過(guò)十天。常見(jiàn)載體：2.2 人生長(zhǎng)激素基因（hGH）報(bào)告基因人生長(zhǎng)激素基因（hGH）：是由人腦垂體前葉分泌的一種多肽，屬于分泌型報(bào)告分子，可直接檢測(cè)蛋白水平，可以在96孔板內(nèi)進(jìn)行高通量分析，操作簡(jiǎn)單。檢測(cè)方法：人生長(zhǎng)激素ELISA試劑盒1、取轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液，加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37反應(yīng)60min2、洗板2次，加入生物素化人ANG抗體工作液，37反應(yīng)60min3、洗板3次，加入ABC工作液，37反應(yīng)30min4

8、、洗板5次，加入TMB顯色液，37反應(yīng)5、加入TMB終止液6、30min內(nèi)讀OD值7、計(jì)算樣本中待測(cè)因子的含量2.3 分泌型堿性磷酸酶基因（SEAP）報(bào)告基因分泌型堿性磷酸酶基因（SEAP）：是人胎盤(pán)堿性磷酸酶的突變體，無(wú)內(nèi)源性表達(dá)。SEAP缺乏胎盤(pán)堿性磷酸酶羧基末端的24個(gè)氨基酸。其優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需裂解細(xì)胞，只用培養(yǎng)介質(zhì)即可檢測(cè)酶活性，便于進(jìn)行時(shí)效反應(yīng)試驗(yàn)。以間硝基苯磷酸鹽（PNPP）為底物時(shí)可用標(biāo)準(zhǔn)的比色法測(cè)定酶活性，操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間短，價(jià)格廉價(jià)，但靈敏度低。以黃素腺嘌呤二核苷酸磷酸為底物進(jìn)行比色測(cè)定，其靈敏度增高。SEAP可催化D-熒光素-O-磷酸鹽水解生成D-熒光素，后者又可作為熒光素酶的

9、底物，此即兩步生物發(fā)光法檢測(cè)酶活性的原理。此方法靈敏度高，接近于熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)。還可用一步化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)酶活性。檢測(cè)步驟：常見(jiàn)載體：2.4 綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因綠色熒光蛋白(GFP)是應(yīng)用最多的發(fā)光蛋白。是一類存在于腔腸動(dòng)物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。易于檢測(cè)，靈敏度高；熒光性質(zhì)穩(wěn)定，耐受性強(qiáng)；易于表達(dá)，無(wú)細(xì)胞毒性；可用于活細(xì)胞檢測(cè)。因此，GFP可作為報(bào)告基因用于檢測(cè)基因表達(dá)或調(diào)控，或作為融合標(biāo)簽來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)分子的定位、遷移、構(gòu)象變化以及分子間的相互作用，或者靶向標(biāo)記某些細(xì)胞器。用395 Bin的紫外線和475 nm的藍(lán)光激發(fā)，GFP可在508nm處自行發(fā)射綠色熒光，無(wú)需輔助因子和底

10、物。GFP最大的優(yōu)勢(shì)是無(wú)需損傷細(xì)胞即可研究細(xì)胞內(nèi)事件。1991年克隆了GFP基因，已獲得幾個(gè)突變體，如“紅色遷移”突變體（redshiftmutant），其熒光更強(qiáng)。其他突變體還有藍(lán)色熒光蛋白（BFP）、增強(qiáng)型GFP(EGFP）和去穩(wěn)定EGFP(destabilized EGFP）等。紅色熒光蛋白（RFP）是從珊瑚（Discosoma sp）中分離的發(fā)光蛋白（drFP583或DsRed），可發(fā)射明亮的紅色熒光。這些常用的報(bào)告基因也可被聯(lián)合應(yīng)用，同時(shí)檢測(cè)2個(gè)甚至3個(gè)基因的表達(dá)。報(bào)告基因的選擇依賴于其靈敏性、可靠性及監(jiān)測(cè)的動(dòng)力學(xué)范圍。穩(wěn)定性好的報(bào)告基因適于基因轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)研究和高通量篩選，尤其適用于

11、基因轉(zhuǎn)移的定性研究。檢測(cè)方法： 定性檢測(cè)：可以用常規(guī)的落射熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡觀察； 定量檢測(cè)：免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法 可以在活細(xì)胞中進(jìn)行圖像分析，也可以檢測(cè)固定細(xì)胞中GFP常用載體：2.5 -半乳糖苷酶基因（-Gal）報(bào)告基因-半乳糖苷酶：由大腸桿菌lacZ基因編碼，可催化半乳糖苷水解。最大優(yōu)勢(shì)是易于用免疫組織化學(xué)法觀測(cè)其原位表達(dá)，是最常用的監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染率的報(bào)道基因之一。以鄰-硝基苯-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）為底物可用標(biāo)準(zhǔn)的比色法檢測(cè)酶活性，其檢測(cè)動(dòng)力學(xué)范圍為6個(gè)數(shù)量級(jí)。氯酚紅-D-半乳吡喃糖苷（CPRG）是另一個(gè)可用比色法檢測(cè)酶活性的底物，其靈敏度比ONPG高近10倍。以MUG和

12、熒光素二半乳糖苷（FDG）為底物則可用熒光法檢測(cè)其活性。此法可檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的酶活性，并可用于流式細(xì)胞學(xué)（FACS）分析。如以二氧雜環(huán)丁烷為底物，可用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)酶活性，其檢測(cè)動(dòng)力學(xué)范圍最大，靈敏度最高，與用生物發(fā)光法檢測(cè)熒光素酶活性的靈敏度相似。半乳糖苷酶是動(dòng)物和微生物基因工程中最常用、最成熟的一種報(bào)告基因。-半乳糖苷酶基因作為報(bào)告基因的應(yīng)用主要有以下幾個(gè)方面： 用于研究啟動(dòng)子的效能和啟動(dòng)子不同位點(diǎn)突變對(duì)表達(dá)效能的影響； 用于研究表達(dá)系統(tǒng)中增強(qiáng)序列等調(diào)控序列的功能； 用來(lái)衡量載體的表達(dá)特性和外源物質(zhì)對(duì)表達(dá)調(diào)控的影響； 以融合基因的形式用于研究外源基因的表達(dá)及其規(guī)律。檢測(cè)方法：1.用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞

13、制備細(xì)胞抽提物。2. 對(duì)于每個(gè)用于測(cè)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物樣品，混合： 100xMg2+溶液 3ul 1xONPG 66ul 細(xì)胞抽提物 30ul 0.1mol/L 磷酸鈉（PH7.5) 201ul3. 反應(yīng)液在 37C 孵育 30 min 或者直到淡黃色出現(xiàn)。大多數(shù)細(xì)胞類型中，內(nèi)源性-半乳糖苷酶的背景非常低，允許孵育時(shí)間長(zhǎng)到 46 h。4. 每管加入 500ul 1mol/L Na2CO3使反應(yīng)終止。在分光光度計(jì)上讀 420nm 波長(zhǎng)的光密度值。常用載體：2.6 熒光素酶（Luc）報(bào)告基因熒光素酶報(bào)告基因是指以熒光素(luciferin)為底物來(lái)檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶(fireflylucifera

14、se)活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過(guò)程中，會(huì)發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。熒光素酶是能夠催化不同底物氧化發(fā)光的一類酶，哺乳細(xì)胞無(wú)內(nèi)源性熒光素酶。最常用的熒光素酶有細(xì)菌熒光素酶、螢火蟲(chóng)熒光素酶和Renilla熒光素酶。細(xì)菌熒光素酶對(duì)熱敏感，因此在哺乳細(xì)胞的應(yīng)用中受到限制。螢火蟲(chóng)熒光素酶靈敏度高，檢測(cè)線性范圍寬達(dá)78個(gè)數(shù)量級(jí)，是最常用于哺乳細(xì)胞的報(bào)道基因，用熒光比色計(jì)即可檢測(cè)酶活性，因而適用于高通量篩選。隨著具有膜通透性和光裂解作用的螢火蟲(chóng)熒光素酶的應(yīng)用，無(wú)需裂解細(xì)胞即可檢測(cè)酶活性。Renilla

15、熒光素酶催化腸腔素（coelenterazine）氧化，產(chǎn)物可透過(guò)生物膜，可能是最適用于活細(xì)胞的報(bào)告分子。將熒光素酶報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，可用熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)靈敏方便地測(cè)定熒光素酶基因的表達(dá)。自1986年起，螢火蟲(chóng)熒光素酶基因被用作測(cè)定基因表達(dá)的報(bào)告基因，獲得了廣泛的應(yīng)用。Promega公司的pGL3及pGL2系列載體，含SV40啟動(dòng)子及增強(qiáng)子的不同組合，有助于分析DNA片段的轉(zhuǎn)錄活性。熒光素酶報(bào)告基因有許多優(yōu)點(diǎn)：非放射性；比CAT及其他報(bào)告基因速度快；比CAT靈敏100倍；熒光素酶在哺乳細(xì)胞中的半衰期為3小時(shí)，在植物中的半衰期為35小時(shí)。由于半衰期短，故啟動(dòng)子的改變會(huì)即時(shí)導(dǎo)致熒光素酶活性

16、的改變，而熒光素酶不會(huì)積累。相反，CAT在哺乳細(xì)胞中的半衰期為50小時(shí)。熒光素酶濃度在1016mol/L（10pS/L）到10-8mol/L（1mg/L）范圍內(nèi)，熒光信號(hào)強(qiáng)度與酶濃度成正比。在理想條件下，可檢測(cè)到l0-20mol/L的熒光素酶。檢測(cè)步驟：（1） 用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。（2）設(shè)計(jì)引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動(dòng)子片段，將此片段插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（pGL3-basic）中。（3）篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序。擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。（4） 擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒，提純備用。同時(shí)準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對(duì)照，提純備用。（5） 培養(yǎng)293（或其它目的

17、細(xì)胞），并接種于24孔板中，生長(zhǎng)10-24小時(shí)（80%匯合度）。（6） 將報(bào)告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。（7） 提取蛋白并用于熒光素酶檢測(cè)。（8） 加入底物，測(cè)定熒光素酶的活性。（9） 計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度，并與空載對(duì)照比較。具體實(shí)驗(yàn)步驟：注：該操作流程通常用來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)染了螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的真核細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)的活性，不適用于對(duì)細(xì)菌熒光素酶進(jìn)行檢測(cè)。1實(shí)驗(yàn)第一天，消化并接種細(xì)胞（根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)選擇合適的細(xì)胞）于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于5CO2、飽和濕度的37培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。2等細(xì)胞密度達(dá)到70時(shí)用Luciferase報(bào)告基因質(zhì)粒、LacZ的表達(dá)質(zhì)粒及其它質(zhì)粒（根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)確定）共轉(zhuǎn)染

18、細(xì)胞（根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)選擇轉(zhuǎn)染方法，如磷酸鈣沉淀法、PEI、lipofectamine2000等均可）。3轉(zhuǎn)染2436h后，吸去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS（無(wú)鈣和鎂離子）洗滌細(xì)胞。注：熒光酶的酶促反應(yīng)會(huì)被痕量的鈣所抑制，故用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在收集細(xì)胞前應(yīng)充分洗滌除去含鈣介質(zhì)。4在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入350l預(yù)冷的harvest buffer,于4 或冰上放置10min裂解細(xì)胞。5在細(xì)胞裂解期間，準(zhǔn)備足量的1.5 ml微量離心管，將ATP buffer 與luciferinbuffer 以1：3.6比例混合成反應(yīng)液后分裝，每管100l。6依次取等體積的細(xì)胞裂解液（100l）至步驟5中的離心管中，迅速混勻，在

19、發(fā)光儀（Luminometer）上讀取吸光值。注：發(fā)光反應(yīng)會(huì)迅速衰減，將細(xì)胞裂解液加入反應(yīng)液后5s內(nèi)必須讀取吸光值。7確保以相同操作手法讀取全部樣品吸光值后。8取剩余裂解液測(cè)定LacZ的活性，其讀數(shù)作為內(nèi)標(biāo)用以矯正熒光素酶的讀數(shù)。9. 用矯正后的讀數(shù)作圖，分析數(shù)據(jù)。注：熒光素見(jiàn)光易氧化，已稀釋未用的熒光素應(yīng)丟棄。注意事項(xiàng)：1.熒光素酶檢測(cè)試劑需在15-25條件下預(yù)平衡后再進(jìn)行反應(yīng)，而后依據(jù)具體條件進(jìn)行自動(dòng)或手動(dòng)檢測(cè)。當(dāng)用液閃計(jì)數(shù)儀時(shí)，加入熒光素酶檢測(cè)試劑后立即輕輕混勻。2.如果細(xì)胞裂解后不能立即對(duì)提取物進(jìn)行檢測(cè)，樣品可以在冰上保存大約5h，在-70可保存數(shù)月。不要反復(fù)凍融以避免酶活性的降低。3

20、.利用上述方法檢測(cè)冷的樣品時(shí)，其信號(hào)強(qiáng)度將下降5-15%。4.在熒光素酶活性較高的情況下，導(dǎo)致信號(hào)超出線性范圍（信號(hào)溢出）可用裂解液將樣品進(jìn)行稀釋。5.不要儲(chǔ)存稀釋過(guò)的樣品。如果必須保存，要在稀釋的樣品中加入BSA至終濃度為2.5mg/ml，這樣可以保持樣品的穩(wěn)定性。6.一些熒光儀在進(jìn)行檢測(cè)前需要1-2s的穩(wěn)定，因此建議在開(kāi)機(jī)后過(guò)一段時(shí)間再進(jìn)行檢測(cè)操作。常用載體：三、常用的報(bào)告基因優(yōu)缺點(diǎn)比較：1.氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶（CAT）：適用于體外熒光或免疫檢測(cè)，不適合用于體內(nèi)分析。優(yōu)點(diǎn)：哺乳動(dòng)物中內(nèi)源性活性極小，蛋白穩(wěn)定，有不同的分析方法。缺點(diǎn)：mRNA半衰期短，操作繁瑣，線性范圍較窄。2.人生長(zhǎng)激素基

21、因（hGH）：適用于體外放射免疫分析，不適合用于體內(nèi)分析。優(yōu)點(diǎn)：屬于分泌型報(bào)告分子，可直接檢測(cè)蛋白水平，可以在96孔板內(nèi)進(jìn)行高通量分析，操作簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：需要用125I分析，增加安全危險(xiǎn)，靈敏度相對(duì)低，費(fèi)用昂貴，線性范圍小。3.分泌型堿性磷酸酶（SEAP）：適用于體外生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光分析，不適合用于體內(nèi)分析。優(yōu)點(diǎn)：非放射性，分泌型報(bào)告因子，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)可以有大的線性范圍，有利于在96孔板內(nèi)進(jìn)行高通量檢測(cè)。缺點(diǎn)：不適用于低水平胎盤(pán)型堿性磷酸酶的細(xì)胞，不適用于分析分泌功能實(shí)驗(yàn)。4.綠色熒光蛋白（GFP）：適用于體內(nèi)熒光檢測(cè)，不常用于體外分析。優(yōu)點(diǎn)：報(bào)告或細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位，熒光發(fā)射無(wú)種屬依賴性，不需要陪附加基因產(chǎn)物、底物或輔助因子，高的抗熒光漂白特