1、.,課題2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù),專題2 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,.,一、課題背景,1、尿素的利用,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、細(xì)菌利用尿素的原因,土壤中的細(xì)菌分解尿素是因為它們能合成脲酶,3、本課題目的,從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌,統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌,.,1、實例：,啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。,原因：因為熱泉溫度70800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有耐熱的Taq細(xì)菌被篩選出來。,DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制

2、的技術(shù)，此項技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。,一、研究思路, 篩選菌株, 統(tǒng)計菌落數(shù)目, 設(shè)置對照,.,要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等； 方法： 抑制大多數(shù)微生物的生長 造成有利于該菌生長的環(huán)境 結(jié)果：培養(yǎng)一定時間后，該菌數(shù)量上升，再通過平板劃線法或稀釋涂布平板法等方法對它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。,2、實驗室中微生物的篩選原理：,人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。,選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。,.,3、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分

3、離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,思考1,.,從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于 培養(yǎng)基，是由于加入了凝固劑 。 從功能上看屬于 培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基的 只有尿素，能利用尿素的微生物可分泌脲酶，因此能在此培養(yǎng)基上生長，此培養(yǎng)基屬于 培養(yǎng)基。,思考2該培養(yǎng)基對微生物 （具有，不具有）選擇作用。如果具有，其選擇機(jī)制是 。,具有,只有能夠以尿素作為氮源的微生物才能在該培養(yǎng)基上生長,選擇,固體,瓊脂,選擇,氮源,思考3,.,培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到

4、抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。,4、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理,.,活學(xué)活用,1.在缺乏氮源的培養(yǎng)基上，大部分微生物無法生長；在培養(yǎng)基中加入青霉素可以抑制細(xì)菌和放線菌的生長；在培養(yǎng)基中加入10%的酚可以抑制細(xì)菌和霉菌的生長。利用上述選擇培養(yǎng)基依次能從混雜的微生物群體中分離出( ) A.乳酸菌、金黃色葡萄球菌、放線菌 B.固氮細(xì)菌、大腸桿菌、放線菌 C.固氮細(xì)菌、霉菌、放線菌 D.固氮細(xì)菌、金黃色葡萄球菌、放線菌,C,.,（1）原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。

5、 （2）常用方法：稀釋涂布平板法。,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目：,1.活菌計數(shù)法,（3）計算公式：,（間接計數(shù)法）,.,想一想，如何根據(jù)平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)？,統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計3個平板，計算出平板上的菌落數(shù)的平均值，然后按以下公式進(jìn)行計算。,旁欄思考題,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,.,實例分析P22,第二位同學(xué)

6、的統(tǒng)計結(jié)果更接近真實值。因為第一位同學(xué)只涂布了一個平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說服力。,你認(rèn)為哪個同學(xué)的結(jié)果更接近真實值？,你認(rèn)為這兩位同學(xué)的實驗需要改進(jìn)嗎？如果需要，如何改進(jìn)？,都需要。第一位同學(xué)在該濃度下可以多涂布幾個平板；第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問題，涂布了三個平板，但是其中1個平板的計數(shù)結(jié)果與另外2個相差太遠(yuǎn)，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地將3個平板的計數(shù)值用來求平均值，可以在該濃度下重新進(jìn)行實驗。,.,注意事項 為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計數(shù)。 為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度涂布三個或三個以上的平板，培養(yǎng)統(tǒng)計菌落數(shù)，計算出

7、菌落平均值。 統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。 恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵，一般以三個稀釋度中的第二個稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右時為最好。,.,2、顯微鏡直接計數(shù)：,利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,（二）.統(tǒng)計菌落數(shù)目：,不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計數(shù)； 需要相對高的細(xì)菌濃度； 個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；,缺點,.,將含已知數(shù)目的紅細(xì)胞液體與待測的菌液按1：1均勻混合，在顯微鏡下數(shù)出各自的數(shù)目，然后求菌液中的細(xì)胞數(shù)目。,（比例計數(shù)法，類似與標(biāo)志重捕法）,待測樣品,等量的已知含量的紅細(xì)胞,混勻,涂抹,測定：,計算單位體積內(nèi)

8、的細(xì)菌數(shù)目,【補(bǔ)充】顯微鏡直接計數(shù)是測定微生物的方法。,.,舉例：已知紅細(xì)胞濃度為M個/mL，從體積為N mL的大腸桿菌培養(yǎng)液中取出大桿菌液與紅細(xì)胞液等量均勻混合后，涂片，染色，鏡檢。在同一視野中發(fā)出有紅細(xì)胞W個，大腸桿菌Y個，求NmL大腸桿培養(yǎng)液中大腸桿菌的個數(shù)X是多少？,觀察到的紅細(xì)胞平均數(shù)/觀察到的細(xì)菌平均數(shù) 紅細(xì)胞含量/細(xì)菌含量 （類似于標(biāo)志重捕法）,公 式,W / Y M / X(每mL中）,NmL大腸桿培養(yǎng)液中大腸桿菌的個數(shù)X為：,.,2.用稀釋涂布平板法來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目。在某稀釋濃度下某同學(xué)做了若干個平板并統(tǒng)計每個平板的菌落數(shù)，最接近樣品中菌體數(shù)真實值的是( ) A.菌落數(shù)

9、量最多的平板 B.菌落數(shù)量最少的平板 C.菌落數(shù)量適中的平板 D.取若干個平板菌落數(shù)量的平均值,D,活學(xué)活用,.,設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。,（三）設(shè)置對照：,設(shè)置對照的方法： 空白對照：不給對照組任何處理因素； 條件對照： 給對照組施以部分實驗因素，但不是所要研究的處理因素； 自身對照： 對照組和實驗組都在同一研究對象上進(jìn)行； 相互對照： 不單設(shè)對照組，而是幾個實驗組相互對照。,.,教材提供的案例中A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有兩種： 一是由于土樣不同； 二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。 如何設(shè)置對照實驗來確定原因？ 方案一：

10、其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實驗。 如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A同學(xué)操作無誤； 如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,實例：教材P23,.,教材提供的案例中A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有兩種： 一是由于土樣不同； 二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。 如何設(shè)置對照實驗來確定原因？ 方案二： 將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,實例：教材P23,小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照實驗的設(shè)置是必不可少的。,.,9,.,實驗設(shè)計：,實驗設(shè)計包括對實驗方案，所需儀器、材料、用具和藥品，具體的實施步

11、驟以及時間安排等的綜合考慮和安排。,.,二 實驗設(shè)計與操作,下面是土壤中尿素分解菌的分離與計數(shù)的實驗流程示意圖，請結(jié)合教材提供的資料，進(jìn)行實驗設(shè)計，并寫出詳細(xì)的實驗方案：,.,實驗設(shè)計：,實驗方案：,.,（一）土壤取樣,（三）樣品的稀釋,（四）取樣涂布,（五）微生物的培養(yǎng)與觀察并計數(shù),（六）鑒定,實驗的具體操作,（二）制備培養(yǎng)基：,.,應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。 在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行,分離不同的微生物采用不同的稀釋度。 原因：不同微生物在土壤中含量不同。 目的：保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計數(shù)的平板。,（三）樣品的稀釋,特別注意的幾個具體操作,.,為什么分離不

12、同的微生物要采用不同的稀釋度？,土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。,測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？,為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。,旁欄思考題,保證獲得菌落數(shù)在30300的平板進(jìn)行計數(shù)。,稀釋度,.,（四）取樣涂布,實驗時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。,特別注意的

13、幾個具體操作,.,3.下列是關(guān)于“檢測土壤中細(xì)菌總數(shù)”實驗操作的敘述，其中錯誤的是( ) A.用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板。 B.取104、105、106倍的土壤稀釋液和無菌水各0.1 mL，分別涂布于各組平板上。 C.將實驗組和對照組平板倒置，37 恒溫培養(yǎng)2448小時。 D.確定對照組無菌后，選擇菌落數(shù)在300以上的實驗組平板進(jìn)行計數(shù)。,活學(xué)活用,D,.,4.測定土壤中細(xì)菌數(shù)量一般選用104、105和106倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，而測定真菌的數(shù)量一般選用102、103和104倍稀釋，其原因是( ) A.細(xì)菌個體小，真菌個體大 B.細(xì)菌易稀釋，真菌不易稀釋 C.細(xì)

14、菌在土壤中數(shù)量比真菌多 D.隨機(jī)的，沒有原因,C,活學(xué)活用,.,（五）微生物的培養(yǎng)與觀察并計數(shù),在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。 細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在30300的平板進(jìn)行計數(shù)。在同一稀釋度下，至少對3個平板進(jìn)行重復(fù)計數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。,特別注意的幾個具體操作,.,微生物的培養(yǎng)與觀察,關(guān)注菌落的形狀、大小、隆起程度

15、、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。,.,.,注意研究未知的微生物，一定要注意進(jìn)行規(guī)范的無菌操作，以防被致病的微生物感染，實驗后，一定要洗手。,（六）鑒定：篩選后必鑒定 鑒定（鑒別）培養(yǎng)基：加入某種指示劑或化學(xué)藥品，不影響微生物的生存。 1、酚紅培養(yǎng)基：鑒定分解尿素的細(xì)菌是否存在,2、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基：鑒定大腸桿菌是否存在,特別注意的幾個具體操作,.,1、酚紅培養(yǎng)基： 鑒定分解尿素的細(xì)菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨培養(yǎng)基堿性增強(qiáng) 酚紅變紅脲酶陽性 2、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基： 鑒定大腸桿菌。 原理：代謝產(chǎn)物與伊紅美藍(lán)結(jié)合 菌落呈深紫色并帶有金屬光澤。,鑒定（鑒別）培養(yǎng)基的實例：,.,1.實驗設(shè)計

16、和操作提示,3 cm,選擇,滅菌,選擇,中性,尿素,對照,填一填,.,高,稀釋度,10,90,1,9,0.1,平板涂布,低,火焰,103107,標(biāo)記,.,3037,選擇,多于,.,平均值,重新實驗,穩(wěn)定,30300,3,2個或2個以上,.,三、操作提示,無菌操作,做好標(biāo)記,制定計劃,四、結(jié)果分析與評價,（一）如何判斷培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落？,對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。 牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。,.,（二）如何判斷樣品的稀釋操作是否成功？,如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在3

17、0300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)。,如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，需要進(jìn)一步分析產(chǎn)生差異的原因。,（三）重復(fù)組的結(jié)果是否一致的判定方法：,四、結(jié)果分析與評價,.,課題 小結(jié),稀釋涂布平板法 顯微鏡直接計數(shù)法,目的菌株,.,1.對細(xì)菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（ ） A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 B.至少接種一種細(xì)菌 C.接種一個細(xì)菌 D.及時補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細(xì)菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別 3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和

18、氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,課堂訓(xùn)練,A,C,D,.,4.下列說法不正確的是（ ） A.科學(xué)家從7080度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶 B.統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值 C.設(shè)置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度 D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。 5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（ ） A.較多的氮源物質(zhì) B.較多的碳源物質(zhì) C.青霉素類藥物 D.高濃度食鹽,B

19、,C,.,（寧夏，15分）（1）在大腸桿菌培養(yǎng)過程中，除考慮營養(yǎng)條件外，還要考慮_、_和滲透壓等條件。由于該細(xì)菌具有體積小、結(jié)構(gòu)簡單、變異類型容易選擇、_、_等優(yōu)點，因此常作為遺傳學(xué)研究的實驗材料。 （2）在微生物培養(yǎng)操作過程中，為防止雜菌污染，需對培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進(jìn)行_（消毒、滅菌）；操作者的雙手需要進(jìn)行清洗和_；靜止空氣中的細(xì)菌可用紫外線殺滅，其原因是紫外線能使蛋白質(zhì)變性，還能_。 （3）若用稀釋涂布平板法計數(shù)大腸桿菌活菌的個數(shù)，要想使所得估計值更接近實際值，除應(yīng)嚴(yán)格操作、多次重復(fù)外，還應(yīng)保證待測樣品稀釋的_。 （4）通常，對獲得的純菌種還可以依據(jù)菌落的形狀、大小等菌落特征對細(xì)菌進(jìn)行初步的_

20、。 （5）培養(yǎng)大腸桿菌時，在接種前需要檢測培養(yǎng)基是否被污染。對于固體培養(yǎng)基應(yīng)采用的檢測方法是_。 （6）若用大腸桿菌進(jìn)行實驗，使用過的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物必須經(jīng)過_處理后才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴(kuò)散。,溫度,酸堿度,易培養(yǎng),生活周期短,滅菌,消毒,損傷DNA的結(jié)構(gòu),比例合適,鑒定(或分類),將未接種的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置適宜的時間,觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生。,滅菌,.,8,.,當(dāng)堂檢測,1.通常用來作為菌種鑒定的重要依據(jù)是( ) A.菌落 B.細(xì)菌形態(tài) C.細(xì)菌體積 D.細(xì)菌結(jié)構(gòu),A,2.從土壤中分離以尿素為氮源的細(xì)菌，下列實驗操作不正確的是( ) A.將土壤用無菌水稀釋，制備103106土

21、壤稀釋液 B.將不同濃度的土壤稀釋液涂布于不同平板上 C.用加入剛果紅指示劑的選擇培養(yǎng)基篩選分解尿素的細(xì)菌 D.從周圍出現(xiàn)紅色環(huán)帶的菌落中挑取能夠分泌脲酶的菌株,C,.,3.請選出下列正確的操作步驟( ) 土壤取樣稱取10 g土壤，取出加入盛有90 mL無菌水的錐形瓶中吸取0.1 mL土壤溶液進(jìn)行平板涂布依次稀釋至101、102、103、104、105、106、107稀釋度 A. B. C. D.,C,4.在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑的目的是( ) A.篩選出能分解尿素的細(xì)菌 B.對分離的菌種作進(jìn)一步鑒定 C.作細(xì)菌的營養(yǎng)成分 D.如指示劑變藍(lán)就能準(zhǔn)確地認(rèn)定該菌能分解尿素,B,.

22、,5. 甘蔗是南方地區(qū)燃料酒精生產(chǎn)的重要原料。利用甘蔗生產(chǎn)燃料酒精的一般工藝流程為：甘蔗榨汁(蔗糖)酵母菌發(fā)酵蒸餾成品(燃料酒精)。 (1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精發(fā)酵菌種，對野生酵母菌進(jìn)行誘變后通過篩選可以得到具有這些特性的突變菌，誘變及篩選過程如下： 步驟1：野生菌液體培養(yǎng)一段時間后接受紫外線照射誘變處理。,步驟2：制備選擇培養(yǎng)基。在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，注意_和 ，加瓊脂后滅菌，制成固體平板。 步驟3：將紫外線照射后的菌液稀釋涂布平板。 步驟4：根據(jù)_，篩選出突變菌。,添加高濃度蔗糖(葡萄糖),調(diào)低pH,是否能在選擇培養(yǎng)基上生長,.,(2)上述步驟2、3和4的依據(jù)分別是_

23、_ 。,5. 甘蔗是南方地區(qū)燃料酒精生產(chǎn)的重要原料。利用甘蔗生產(chǎn)燃料酒精的一般工藝流程為：甘蔗榨汁(蔗糖)酵母菌發(fā)酵蒸餾成品(燃料酒精)。 (1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精發(fā)酵菌種，對野生酵母菌進(jìn)行誘變后通過篩選可以得到具有這些特性的突變菌，誘變及篩選過程如下：,步驟2：制備選擇培養(yǎng)基。在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，注意_和 ，加瓊脂后滅菌，制成固體平板。 步驟3：將紫外線照射后的菌液稀釋涂布平板。 步驟4：根據(jù)_，篩選出突變菌。,添加高濃度蔗糖(葡萄糖),調(diào)低pH,是否能在選擇培養(yǎng)基上生長,獲得單菌落；能生長的菌落具有耐高糖和耐酸的特性,提供高糖和酸性的篩選環(huán)境；,.,課后練習(xí),2.提示：反芻動物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會