1、.常用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)簡介(2011-04-23 113333003333629)標(biāo)簽：分子生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué)一般使用實用技術(shù)基礎(chǔ)實驗室技術(shù)生物學(xué)實驗教學(xué)常用分子生物學(xué)基本技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交的高特異性和檢測方法的敏感性，是分子生物學(xué)中最常用的基本技術(shù)，廣泛應(yīng)用于基因克隆篩選、酶切圖譜構(gòu)建、基因序列的定量和定性分析、基因突變檢測等。基本原理是，在特定條件下(適當(dāng)?shù)臏厥液碗x子強度等)，具有特定同源的原始核酸單鏈可以有基本互補的原始雙鏈。雜交對象是正在檢測的核酸序列和探針(probe)，正在檢測的核酸序列可以是克隆的基因信息部，也可以是未復(fù)制的基因組DNA和細(xì)胞總RNA。核

2、酸探針是指已知的DNA或RNA片段，這些片段標(biāo)記為放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)，能與特定核酸序列進(jìn)行特異性互補。根據(jù)其起源和特性，可以分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。固相雜交固相雜交(solid-phase hybridization)把改性DNA固定在固體基質(zhì)(硝化纖維素膜或尼龍過濾器)上，然后與探針雜交，稱為膜上印跡雜交。斑點混合(dot hybridization)首先，使經(jīng)過測試的DNA或RNA變性，然后固定在濾膜上，然后放入標(biāo)記過多的DNA或RNA探針雜交。其特點是簡單的操作，無需酶消化或凝膠電永久分離核酸樣品，即可在一個膜中同時檢測多個樣品。根據(jù)斑點混

3、合的結(jié)果，可以估計雜交陽性副本的數(shù)量。該方法的缺點是無法確定被測試基因的相對分子質(zhì)量，特異性下降，存在一定比例的假陽性。壓印混合(blotting hybridization)Southern blotting hybridization:凝膠電離使受限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段電離，將單鏈DNA片段原位轉(zhuǎn)換為硝化纖維素膜或其他固體支撐物，干燥后烘焙固定，然后與對應(yīng)于該結(jié)構(gòu)的探針相互作用，通過放射性自身現(xiàn)象或酶反應(yīng)檢測特定大小的分子含量?？梢赃M(jìn)行克隆基因的酶切分析，基因組基因的定性和定量分析，基因突變分析和限制性長度多態(tài)性分析(RELP)。Northern blotting hybrid :是

4、從Southerm print hybridization演化而來的，樣本是RNA。被甲醛或聚糖?；男院碗娪痉蛛x后，移至固相支撐物進(jìn)行雜交反應(yīng)，確認(rèn)飛機內(nèi)特定mRNA分子的數(shù)量和大小。這是排斥基因表達(dá)程度的基因表達(dá)研究中常用的方法。差異混合(differential hybridization)將基因組庫中的重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜，將轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性癌癥組織的mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA等兩種混合cDNA探針分別與濾膜的DNA雜交，分析兩個濾膜的相應(yīng)位置雜交信息，分離差異表達(dá)的基因。對于基因組不太復(fù)雜的真核生物(如酵母)表達(dá)基因的比較，假陽性率較低。但是，像人一樣，基因組非常復(fù)雜的鹽酸

5、核生物，工作量太大，表達(dá)順序低(只有5%左右)，價值不大。CDNA microarray hybridizationcDNA克隆或CDNA的PCR產(chǎn)物以高度排列的形式排列，結(jié)合固相支撐物(例如尼龍薄膜或活動幻燈片)，制成微型光柵，然后混合不同的DNA探針，與微型光柵的DNA雜交。利用熒光、化學(xué)發(fā)光、共聚焦顯微鏡等掃描微型光柵的雜交信息。與差異混合技術(shù)相比，效率更高、速度更快、成本更低，適用于大規(guī)模分析。商品已經(jīng)上市了。也有不能克服對保守同族序列和雜交信息的中旬?dāng)_動的缺點。oligo nucle otide microarray hybridization s將核糖核苷酸原位合成在特殊的固相支持

6、物上，并結(jié)合在支持體表面，與平均長度為20-50nt的混合RNA或cDNA探針雜交，提高雜交的特異性和敏感性。使用共聚焦顯微鏡檢測分三個階段的雜交信息。區(qū)分基因家族不同成員的差異表達(dá)特性，或確認(rèn)在同一組織及細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的選擇性結(jié)合部，適合低豐度mRNA的檢測。有工作量大、費用高、速度慢的弱點。液體雜交(solution hbridization)酸單鏈(探針)，又稱變性核酸單鏈及放射性核素標(biāo)記，在溶液中絕熱，形成雜交復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)束后，通過羥基磷灰石法或酶水解，分離出未雜交的單鏈和雜交雙鏈，然后制作橫膈膜后，其他化妝分子中測定探針程度的核酸量。遞減混合(subtractive hybridiza

7、tio)是利用兩個具有不同穩(wěn)態(tài)的組織細(xì)胞提取mRNA(或反轉(zhuǎn)錄cDNA)，在一定條件下，過量驅(qū)動mRNA或cDNA，與經(jīng)測試的短鏈cDNA或mRNA進(jìn)行液相雜交，通過羥基磷灰石色譜篩選去除兩者之間同源的雜交體通過多次雜交政策，去除其間的相同基因成分，保存特定表達(dá)的目的基因或工作基因片段。此后篩選cDNA庫，可以獲得特定表達(dá)的目的基因cDNA全長序列。核酸原位雜交技術(shù)的研究。以核酸(特定標(biāo)記的已知順序)為探針，在細(xì)胞級或組織切片中雜交和檢測核酸和核糖核酸的方法稱為核酸內(nèi)雜交(簡稱situ)。與細(xì)胞內(nèi)RNA雜交，研究細(xì)胞內(nèi)特定基因表達(dá)的秀潤，用于確定細(xì)胞核或染色休相中DNA的分布。還用于細(xì)胞，組織

8、內(nèi)非特異性細(xì)菌，病毒檢測研究。該方法的優(yōu)點是特異性高，能準(zhǔn)確定位。無論同一組織的其他組成部分如何，都可以在構(gòu)成復(fù)雜的組織中進(jìn)行單細(xì)胞研究。不需要從組織中提取核酸，對組織含量極低的目標(biāo)順序非常敏感。能完美地維持組織和細(xì)胞的形態(tài)。因此，它被廣泛用于基因定位、基因丟失、基因移位、特異性基因整合部物色檢測等醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究。近年來，在質(zhì)的發(fā)展中，數(shù)量、方法進(jìn)一步改進(jìn)。DNA分子克隆技術(shù)(也稱為基因克隆技術(shù))將DNA分子片段與向量DNA片段聯(lián)系起來，使DNA分子克隆(或基因克隆)在細(xì)胞的大量復(fù)制過程中發(fā)生。其基本步驟包括“準(zhǔn)備目的基因”“將目的基因和載體切割并連接成限制性內(nèi)切酶”“導(dǎo)入宿主細(xì)胞”“篩選”，

9、“鑒定”“擴增并表達(dá)”等。載體(vecors)在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，把重組后的分子片段增殖在一起，形成很多DNA分子片段。主要目的是獲取特定基因或NDA片段的大量拷貝，通過與父母分子完全相同的分子克隆深入分析基因的結(jié)構(gòu)和功能，根據(jù)引入的DNA片段，有兩個DNA庫：基因組庫和cDNA庫。載體是帶目標(biāo)DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴增和表達(dá)的工具。細(xì)菌質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外的小雙鏈環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA，分子大小為1-20kb，對細(xì)菌的特定代謝活動和耐藥性表型有一定的作用。質(zhì)粒載體是以天然質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工變形結(jié)合的。最常用的質(zhì)粒是pBR322。噬菌體是感染細(xì)菌的病毒，根據(jù)生活周期分為溶解細(xì)菌和溶解原型兩種。野生型噬

10、菌體轉(zhuǎn)化制成的噬菌體載體是線性雙鏈DNA，基因組約為50kb，最常用的亞型是DNA及其衍生物系列。粘彈性質(zhì)粒(Cosmid)是由質(zhì)粒和噬菌體DNA組成的4-6kb環(huán)雜交DNA。表達(dá)載體將上述細(xì)菌質(zhì)?；蚴删w載體連接到啟動基因及聚核糖體的基因序列，構(gòu)成表達(dá)載體?；蜚y行建設(shè)包含某一生物所有基本日歷的隨機片段的重組DNA復(fù)制群體包含對光敏感的基因片段的重組包含標(biāo)記探針與基因池中的重組雜交而獲得的克隆經(jīng)過純化和擴增，可以用于一步研究。主要步驟如下：(1)基因池的快速載體構(gòu)建；(2)DNA片段的制備；(3)DNA片段與矢量DNA的連接；(4)包裝和免疫。構(gòu)建CDNA庫是指復(fù)制的DNA片段，逆轉(zhuǎn)錄酶是m

11、RNA制造的cDNA。cDNA庫包含特定細(xì)胞所有CDNA復(fù)制的庫，不包含人體。特定基因的篩選一般方法如下：(1)克隆篩選，即探針篩選方法；(2)分泌蛋白質(zhì)篩選目標(biāo)基因的抗體檢測方法；(3)放射免疫篩選方法檢測分泌特定抗原的基因；(4)免疫沉淀法，特定基因篩選。核酸序列分析DNA的堿基序列決定基因的特征，分子生物學(xué)的重要基本技術(shù)“測序”就是其DNA序列分析?；虺刂斜贿x擇的腫瘤基因或PCR擴增的基因最終通過核酸序列分析，了解基因的精密結(jié)構(gòu)，獲得其限制性內(nèi)切酶圖譜，分析基因突變及其對功能的影響，人工海馬體由基因制成，設(shè)計引物，研究腫瘤的分子病因。測序是在高分辨率改性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上制

12、作的。目前最常見的方法是Maxam-Gilbert的化學(xué)分解和Sanger的雙脫氧方法等，近年來出現(xiàn)了DNA序列自動分析儀?；瘜W(xué)分解法在DNA片段的5端標(biāo)記核素，然后用特異性化學(xué)試劑對DNA進(jìn)行特異性分解，利用電泳及自行開發(fā)后從標(biāo)記端延伸的片段，獲得讀取順序，進(jìn)行比較。你通?？梢蚤喿x200到250個核苷酸序列。2 ，在3- ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP的情況下，通過使用核苷酸鏈終止劑混合到DNA鏈中，結(jié)束鏈延長，將4種正常dNTP混合的混合物分成4個組，進(jìn)行反應(yīng)，讀取凝膠電泳分離和發(fā)射的合成DNA核苷酸序列，可以根據(jù)堿基互補原則估計模板DNA化學(xué)分解法只需要化學(xué)試劑，重復(fù)性好

13、，容易掌握。雙脫酸消化方法需要單鏈模板、特定寡核苷酸引物和高質(zhì)量DNA聚合酶，因此根據(jù)M13噬菌體載體的發(fā)明和使用，合成引物容易獲得，排序技術(shù)不斷改進(jìn)，得到廣泛應(yīng)用。自動激光熒光排序可以快速簡便地進(jìn)行測量工作，并確保高重復(fù)性。RNA測序通常使用將mRNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，然后通過相同的測序逆轉(zhuǎn)RNA序列的方法聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)被稱為PCR技術(shù)的聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)利用DNA變性和復(fù)性原理，在體外高效擴增特定DNA片段，檢測出微量目標(biāo)序列，數(shù)量不超過一個。模板DNA、引物及4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，依賴DNA聚合酶的酶合成反應(yīng)。只需很少的模板，就可以在一對引物參數(shù)下，在幾個小時內(nèi)增強到100-20

14、0萬個拷貝。PCR反應(yīng)分為變質(zhì)、退火和擴張三個階段。上面的第三步是使用循環(huán)，每個循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個模板，使用9個小時的循環(huán)，每個循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板，在經(jīng)過幾個小時的循環(huán)后，可以得到大量復(fù)制的特定DNA片段。反應(yīng)條件通常為94變性30秒，55 退火30秒，70 72 延長30 60秒，共循環(huán)約30次，最后在72延長5分鐘，4冷卻終止反應(yīng)。1.RNA擴增中使用的逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)。2.反轉(zhuǎn)錄PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection c-rt-PCR)低豐度RNA定量化的好方法。3.將多對引物

15、添加到多個多PCR(PCR)相同的PCR系統(tǒng)中會導(dǎo)致默認(rèn)長度較長、缺少多個引物嗎？Br4.多個PCR同時添加多組生物素標(biāo)記引物，引起水速PCR反應(yīng)。5.反向分子鏈反應(yīng)(I verse polymerase chain reaction，pcr)放大和研究已知DNA片段兩側(cè)的未知序列。6.不對稱PCR在擴增周期中引入不同的引物濃度，獲得單鏈DNA，了解目標(biāo)基因的序列。7.錨定的分段式機箱更改(PCR)有助于克服未知序列或未知序列導(dǎo)致的故障。在未知序列的末端添加均聚物尾部序列，將互補引物連接到具有限制性內(nèi)切酶部位的一個錨，在錨引物和基因另一側(cè)的特定引物的作用下，擴增未知序列。8.彩色互補檢測或熒光

16、熒光熒光熒光PCR(顏色組合assay or fluorescent PCR)的原理是，用不同的熒光染色分別升高，貼在不同的寡核苷酸引物上，同時擴增多個DNA片段，反應(yīng)結(jié)束后，使用分子篩選去除多余的引物。如果用紫外線照射放大產(chǎn)物，可以顯示在某個DNA部位組合熒光染料顏色，在某個DNA部位組合熒光染色劑顏色，如果缺少某個DNA帶，就會相應(yīng)地缺乏顏色。9.雙溫度two-temperature PCR(PCR)僅執(zhí)行兩階段溫度程序。組合退火和擴展溫度。常用溫度為94-95 和46-47 。能提高反應(yīng)的速度和特異性。這些PCR技術(shù)的應(yīng)用：(1)PCR技術(shù)放大特定序列，使用多種方法(如PCR-RFLP、PCR-SSCP)從克隆的雙鏈DNA中生成特定序列作為分子探針。(2)在cDNA中選擇性擴增特定序列，用作分子探針。(2)選擇性擴增cDNA的特殊片段，為尚未復(fù)制的基因生成探針。(3) cDNA文庫由微mRNA生成。(4)大量DNA用于序列分析；生成。(5)基因突變分析；(6)采取染色體階段。10.in situ PCR技術(shù)：PCR可以擴增包括福爾馬林固定、石蠟包埋組織在內(nèi)的各種標(biāo)本的DNA，但擴增的DNA或RNA產(chǎn)物不能位于組織細(xì)胞中，因此不能直接與特定組織細(xì)胞特性相關(guān)，這是該技術(shù)的局限性。In situ hybridization的定位力很好，但還不能檢測