1、生物工程綜合實驗植物生物技術模塊生物工程教研組編2017年春學期目錄實驗一 植物組培實驗室設計和實驗設備、實驗用品認知10實驗二 MS培養(yǎng)基母液的配制13實驗三 MS培養(yǎng)基配制與滅菌16實驗四 無菌接種操作19實驗五 外植體分化生長的誘導培養(yǎng)19實驗六 外植體脫分化生長的誘導培養(yǎng)24實驗七 組培苗的煉苗27實驗一 植物組培實驗室設計和實驗設備、實驗用品認知一、目的與要求1、結合對植物細胞工程安徽省工程技術研究中心植物組織培養(yǎng)生產車間和研究實驗室的現場認知，了解掌握植物組織培養(yǎng)實驗室的組成和所需的基本儀器設備，學會植物組織培養(yǎng)實驗室的設計； 2、為后續(xù)植物組培實驗課程學習與實訓準備所需的相關用品

2、。二、教學場所 1、植物細胞工程技術研究中心；2、生物工程綜合實驗分室（A514）。三、內容與方法（一）關于植物組培實驗室的認知與設計1、組培實驗室設計原則 要求環(huán)境干燥清潔；符合無菌操作規(guī)程要求；滿足生產技術流程需要。2、組培實驗室的一般組成與設備包括化學實驗室、洗滌準備室、培養(yǎng)基制備室、無菌操作室、培養(yǎng)室、細胞學觀察研究室，等。（1）化學實驗室各種相關藥品的貯存、溶液配制等。主要設備：藥品柜，防塵櫥，冰箱，天平，蒸餾水發(fā)生器，加熱器（電磁爐等），玻璃器皿，等。（2）洗滌準備室用于完成相關器具的洗滌、干燥、堆放存儲等。主要設備：洗滌池，洗瓶機，操作臺，烘箱，儲物架（柜）等。（3）培養(yǎng)基制備室

3、用于進行培養(yǎng)基的生產。主要設備：冰箱，天平，蒸餾水發(fā)生器，酸度計，加熱器（電磁爐等），玻璃器皿，分裝機，滅菌設備，操作臺，等。（4）無菌操作室主要用于植物材料的消毒、接種、培養(yǎng)物的繼代等。無菌室的房間不宜太大，數量根據需要設置。要求干爽清潔，相對密閉，墻地光滑防潮，配置平移門。每一無菌室設內外二間，外間為緩沖室，內間較大，為接種室。主要設備：紫外燈，超凈工作臺，臭氧發(fā)生器，酒精燈，接種器械（鑷子、剪刀、解剖刀、接種針），手推車，等。（5）培養(yǎng)室是將接種的材料進行培養(yǎng)生長的場所，大小依規(guī)模而定。培養(yǎng)室的設計以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。主要設備：空調機，加熱器，增濕器，培養(yǎng)架，光照設備，培養(yǎng)箱

4、，轉床，人字梯，等。（6）細胞學觀察室用于進行培養(yǎng)物的取樣觀察和分析。主要設備：顯微鏡，細胞染色、計數、制片設備，天平，離心機，等。（二）組培實驗用品的準備1、玻璃器皿及規(guī)格（1）培養(yǎng)瓶：100500 mL的玻璃或塑料培養(yǎng)瓶等； （2）培養(yǎng)皿：915 cm； （3）燒杯：1005000 mL； （4）量筒：101000 mL； （5）移液管：110 mL；（6）試劑瓶：1001000 mL； （7）容量瓶：1001000 mL。2、接種器械酒精燈，不銹鋼鑷子、剪刀、解剖刀等。3、其它用品培養(yǎng)瓶封口膜（蓋），棉線，記號筆，打包紙（牛皮紙、報紙），轉運筐，等。四、預習思考與作業(yè) 1、試分析植物組培

5、苗工廠化生產的車間設計與設備選型。2、分組準備（領取、洗滌、保管）植物組培實驗主要用品。實驗二 MS培養(yǎng)基母液的配制一、目的與要求1、了解植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成，常用配方； 2、掌握培養(yǎng)基配制的步驟，母液的概念與配制方法。二、教學場所 生物工程綜合實驗分室（A514）。三、內容與方法（一）基本原理植物培養(yǎng)基配方中的成分多樣，為減少每次培養(yǎng)基配制的工作量和誤差，有必要將配方中的成分分為幾類，分別配制成若干濃縮倍數的母液備用。（二）實驗內容完成MS培養(yǎng)基各種母液的配制。四、材料與用品（一）主要化學試劑和藥品 詳見表1。（二）儀器用具天平、燒杯、試劑瓶、量筒、容量瓶、蒸餾水器、加熱器、電冰箱，等。

6、五、實驗操作（一）MS培養(yǎng)基的基礎配方與母液配制1、MS培養(yǎng)基的配方和母液配制用量 詳見表1。2、配制1 L培養(yǎng)基所取母液的量配制1 L培養(yǎng)基，所取上述各種母液的數量為：大量元素和鈣鹽母液各50 mL，鐵鹽、微量元素和有機物的母液各10 mL。鐵鹽配制：將稱好的FeSO47H2O和Na2-EDTA2H2O分別放到450 mL蒸餾水中，邊加熱邊不斷攪拌使它們溶解，然后將Fe鹽溶液倒入EDTA溶液中混合，并將pH調至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。 CuSO45H2O 和CoCl26H2O 因量較小，應先配成更高濃度250mg/L的母液(10000), 再根據母液體積取用。（二）植物

7、激素的母液配制6-BA、NAA、2,4-D等常用植物激素，可配制成0.1 mg/mL的母液，單獨配制和取用。配制時， 6-BA、NAA、2,4-D等，可先用少量1 M NaOH再加入熱水定容。表1 MS培養(yǎng)基的母液配制方法參考表母液序號母液名稱配方成分分子量配方用量（mg/L）母液倍數配制1 L母液稱取量（mg）I大量元素NH4NO380.0416502033000KNO3101.11190038000MgSO47H2O246.473707400KH2PO4136.091703400CaCl22H2O147.02440208800II微量元素KI166.010.8310083H3BO361.8

8、36.2620MnSO44H2O223.0122.32230ZnSO47H2O287.548.6860Na2MoO42H2O241.950.2525CuSO45H2O249.680.0252.5CoCl26H2O237.930.0252.5III鐵鹽FeSO47H2O278.0327.81002780Na2EDTA372.2537.33730IV有機物肌醇10010010000甘氨酸2200鹽酸吡哆醇(VB6)0.550鹽酸硫胺素(VB1)0.110煙酸0.550注意事項： （1）鈣鹽、鐵鹽單獨配制。鐵鹽需要用棕色試劑瓶盛裝。（2）煙酸在冷水中溶解度差，稱量后可先單獨用適量熱水溶解后，再加到相

9、應的母液中一起定容。附：MS培養(yǎng)基是目前使用最普遍的培養(yǎng)基。其具有較高的無機鹽濃度，能夠保證組織生長所需的礦質營養(yǎng)還能加速愈傷組織的生長。由于配方中的離子濃度高，在配制、貯存和消毒等過程中，即使有些成分略有出入，也不會影響離子間的平衡。MS固體培養(yǎng)基可用于誘導愈傷組織，也可用于胚、莖段、莖尖及花藥的培養(yǎng)，其液體培養(yǎng)基用于細胞懸浮培養(yǎng)時能獲得明顯的成功。MS培養(yǎng)基的無機養(yǎng)分的數量和比例比較合適，足以滿足植物細胞在營養(yǎng)上和生理上的需要。因此，一般情況下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有機附加成分。和其它培養(yǎng)基的基本成分相比，MS培養(yǎng)基中的硝酸鹽、鉀和銨的含量高，這是它的顯著特

10、點。六、預習思考與作業(yè)1、MS培養(yǎng)基配方中，CuSO45H2O和CoCl26H2O的用量小，配制母液時直接稱量相對較困難，如何操作可減少此困難并降低誤差？ 2、配制濃縮倍數較高的大量元素母液時，為何往往會發(fā)生沉淀，如何避免？3、表1中的試劑，有的含有結晶水，假如提供的試劑的結晶水的個數與配方中的不一樣，應如何處理？實驗三 MS培養(yǎng)基配制與滅菌一、目的與要求1、學習掌握植物組培培養(yǎng)基（含分化誘導培養(yǎng)基）的配制方法與流程；2、了解、掌握培養(yǎng)基高溫高壓滅菌的方法與流程；二、實驗內容1、設計和配制用于誘導和增殖的培養(yǎng)基；2、外植體消毒所需用品的準備。三、教學場所 生物工程綜合實驗分室。四、材料與用品（

11、一）主要試劑和材料 已配制的MS各種母液，蔗糖，瓊脂粉，HCl和NaOH自選。（二）儀器用具天平、燒杯、玻棒、量筒、移液管、培養(yǎng)瓶、電磁爐、平底煮鍋、酸度計、培養(yǎng)皿，等。五、實驗操作（一）培養(yǎng)基的配制設計并配制用于誘導和增殖生長的培養(yǎng)基。1、培養(yǎng)基的基礎配方MS + 蔗糖 30 g/L + 瓊脂 4.5 g/L （以下簡寫為MS）2、誘導培養(yǎng)基中的激素組合 分化生長培養(yǎng)基1) MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L2) MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L3) MS + 6-BA 0.1 mg/L + NAA 2.0mg/L4) MS

12、+ 6-BA 0.2 mg/L + NAA 2.0 mg/L脫分化培養(yǎng)基1) MS + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.5 mg/L2) MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 1.0 mg/L3) MS + 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L4) MS + 2,4-D 0.5 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L3、培養(yǎng)基的制備（1）以實驗小組為操作單元，每小組20瓶（每瓶分裝量約50 mL），計算所需培養(yǎng)基的總體積；然后根據培養(yǎng)基的總體積，計算和稱取瓊脂粉、蔗糖，量取各種母液存放于燒杯中。（2）量取約為培養(yǎng)基總體積2/3比例的純凈水，放入

13、煮鍋，置于電磁爐上，加入瓊脂粉，加熱并不斷攪拌，直至瓊脂粉完全融化、澄清透明。（3）加入蔗糖并攪拌至融化；倒入已量取好的母液，攪拌混勻；倒入大容器，補加純水定容至預定的體積數。（4）取樣，用酸度計測pH值；用1 M的HCl或NaOH溶液調節(jié)pH值至6.0左右。（5）各實驗小組分別按照選定的一個激素組合，計算并用移液管吸取加入相應的激素母液，混勻。（6）分裝到培養(yǎng)瓶，封好瓶口，作好分組標記。（7）高壓濕熱滅菌；冷凝備用。（二）外植體消毒所需用品的準備1、外植體消毒所需的用品無菌水，滅菌后的500 mL燒杯、15 cm培養(yǎng)皿以及吸水濾紙，等。2、消毒用品的準備用750 mL蘭花培養(yǎng)瓶盛裝自來水或純

14、水（裝水體積不得超過培養(yǎng)瓶容積的2/3），封口；玻璃器皿（500 mL燒杯，15 cm培養(yǎng)皿等）、吸水濾紙等，分別用牛皮紙或報紙打包捆扎好。然后，進行高壓滅菌。滅菌完畢后，取出，烘干表面水分，轉移到無菌室儲物架上存放備用。注意事項： （1）培養(yǎng)基分裝時，盡量不要沾到瓶口，若有沾染要擦除后再封口；滅菌和轉運時，培養(yǎng)基不能過于傾斜，以免瓶口部位沾染培養(yǎng)基，容易造成后期染菌。 （2）使用高壓滅菌鍋時，一定要先檢查鍋底水位。滅菌完畢開蓋取物時，要避免被燙傷。六、預習思考與作業(yè)1、了解植物組培常用的植物激素種類，各類激素對植物離體培養(yǎng)物的生理作用和效應。2、實驗室高壓滅菌的基本操作步驟如何？哪些因素可能

15、會影響高壓滅菌的實際效果？實驗四 無菌接種操作過程一、目的與要求1、以草本或藤本植物為材料，學習外植體消毒和無菌接種操作方法；二、實驗原理 植物組織培養(yǎng)技術是植物生物技術的基礎。植物組織培養(yǎng)的基本原理是植物細胞的全能性（totipotency）。無菌操作是植物組培的基本要求。 三、教學場所 植物細胞工程技術研究中心組培室。四、材料與用品（一）實驗材料草本或藤本植物的莖尖，芽尖或莖段。（二）培養(yǎng)基已分組配制好的培養(yǎng)基。（三）主要試劑70%75%乙醇，0.1%升汞（HgCl2），等。（四）用品用具超凈工作臺，酒精燈，酒精棉球，無菌水，已滅菌的500 mL燒杯、15 cm培養(yǎng)皿，接種用工具（醫(yī)用剪刀

16、、鑷子、手術刀具），廢液杯，工作帽，口罩，工作服，記號筆，等。五、實驗操作（一）外植體的預處理 先將外植體在加入少量洗潔精的自來水中清洗表面，瀝水，然后放入燒杯，帶進接種室。（二）無菌室消毒接種操作前半小時，先將培養(yǎng)基、無菌水、燒杯、培養(yǎng)皿、外植體材料等有序放置在超凈工作臺上，打開紫外燈（不開照明燈）進行空間消毒；20 min后，關閉紫外燈（仍不開照明燈），開啟超凈工作臺；至超凈工作臺運行10 min后，進入無菌室操作。（三）外植體的消毒操作者坐在超凈工作臺前，用酒精棉球擦拭雙手和手臂，蘸酒精灼燒托盤、剪刀、鑷子等接種工具。先將外植體材料轉入一只無菌燒杯，用75%乙醇浸潤8 s左右（時間不宜太

17、長），倒出乙醇，立即加入無菌水洗滌2遍，瀝水；將材料轉移到另一無菌燒杯中，再用0.1%升汞溶液浸泡消毒10 min，用無菌水清洗4次，瀝水；然后轉移到無菌的大培養(yǎng)皿中，待剪切接種。（四）外植體的接種培養(yǎng)將消毒后的外植體放入無菌培養(yǎng)皿托盤，左手持鑷子，右手持手術刀，進行切割。然后接種到培養(yǎng)基上，每瓶接種3塊，生物學上端朝上，用鑷子輕壓，但不能完全埋入培養(yǎng)基中。接種完成后，將培養(yǎng)基轉移到培養(yǎng)室，培養(yǎng)溫度28左右，光照培養(yǎng)，光照強度1200 lux左右，每天照光812 h。注意事項： （1）使用的0.1%升汞溶液有毒，操作時若不慎濺到皮膚上，不必緊張，及時用吸水紙吸去并用自來水沖洗即可。升汞消毒液可

18、回收再用。（2）剪切和接種操作要快，以免因暴露吹風時間太長，引起材料過度失水。六、觀察記錄組培室實行開放式管理，各實驗小組可根據培養(yǎng)進程自行安排時間前往觀察、管理、記錄和拍照。七、預習思考與作業(yè)1、試分析哪些因素或操作會引起外植體接種培養(yǎng)的污染。實驗五 外植體分化生長的誘導培養(yǎng)一、目的與要求1、了解植物離體培養(yǎng)的形態(tài)建成的原理與技術路線；2、以草本或藤本植物為材料，學習外植體消毒和無菌接種操作方法；3、理解不同的植物生長調節(jié)劑及其組合對植物細胞的形態(tài)建成的影響。二、實驗原理 植物組織培養(yǎng)技術是植物生物技術的基礎。植物組織培養(yǎng)的基本原理是植物細胞的全能性（totipotency）。在適宜的基本培

19、養(yǎng)基中，添加不同植物激素（例如生長素與細胞分裂素的組合），對于植物離體培養(yǎng)的形態(tài)建成具有重要影響，甚至起著決定性作用。 已分化的外植體材料，可在適宜的培養(yǎng)基上誘導脫分化，并可再分化。三、教學場所 植物細胞工程技術研究中心組培室。四、材料與用品（一）實驗材料草本或藤本植物的莖尖，芽尖或莖段。（二）培養(yǎng)基實驗三中已分組配制好的培養(yǎng)基。（三）主要試劑70%75%乙醇，0.1%升汞（HgCl2），等。（四）用品用具超凈工作臺，酒精燈，酒精棉球，無菌水，已滅菌的500 mL燒杯、15 cm培養(yǎng)皿，接種用工具（醫(yī)用剪刀、鑷子、手術刀具），廢液杯，工作帽，口罩，工作服，記號筆，等。五、實驗操作（一）外植體的

20、預處理 先將外植體在加入少量洗潔精的自來水中清洗表面，瀝水，然后放入燒杯，帶進接種室。（二）無菌室消毒接種操作前半小時，先將培養(yǎng)基、無菌水、燒杯、培養(yǎng)皿、外植體材料等有序放置在超凈工作臺上，打開紫外燈（不開照明燈）進行空間消毒；20 min后，關閉紫外燈（仍不開照明燈），開啟超凈工作臺；至超凈工作臺運行10 min后，進入無菌室操作。（三）外植體的消毒操作者坐在超凈工作臺前，用酒精棉球擦拭雙手和手臂，蘸酒精灼燒托盤、剪刀、鑷子等接種工具。先將外植體材料轉入一只無菌燒杯，用75%乙醇浸潤8 s左右（時間不宜太長），倒出乙醇，立即加入無菌水洗滌2遍，瀝水；將材料轉移到另一無菌燒杯中，再用0.1%升

21、汞溶液浸泡消毒10 min，用無菌水清洗4次，瀝水；然后轉移到無菌的大培養(yǎng)皿中，待剪切接種。（四）外植體的接種培養(yǎng)將消毒后的外植體放入無菌培養(yǎng)皿托盤，左手持鑷子，右手持手術刀，進行切割。然后接種到培養(yǎng)基上，每瓶接種3塊，生物學上端朝上，用鑷子輕壓，但不能完全埋入培養(yǎng)基中。接種完成后，將培養(yǎng)基轉移到培養(yǎng)室，培養(yǎng)溫度28左右，光照培養(yǎng)，光照強度1200 lux左右，每天照光812 h。六、觀察記錄組培室實行開放式管理，各實驗小組可根據培養(yǎng)進程自行安排時間前往觀察、管理、記錄和拍照（如果本小組的實驗失敗，須分析原因；并參與其它實驗小組的情況觀察或重做）。 實驗記錄和指標分析： 接種外植體總數；誘導分

22、化發(fā)生率（%，發(fā)生分化的塊數與接種總塊數的比值）；分化發(fā)生時間（接種后第n天）、平均發(fā)生數量；形態(tài)或生長速度。七、預習思考與作業(yè)1、通過觀察分析，確定所選材料誘導分化（生根、長芽）的適宜激素組合。實驗六 外植體脫分化生長的誘導培養(yǎng)一、目的與要求學習和掌握植物愈傷組織誘導與繼代培養(yǎng)方法。二、實驗原理 植物細胞具有全能性（totipotency）。已分化的外植體材料，可在適宜的培養(yǎng)基上誘導發(fā)生脫分化，形成愈傷組織。愈傷組織可進一步繼代增殖，或誘導發(fā)生再分化，形成新的器官乃至新個體。三、教學場所 植物細胞工程技術研究中心組培室。四、材料與用品（一）實驗材料草本植物的幼嫩葉片等外植體材料。（二）培養(yǎng)基

23、實驗三中已分組配制好的培養(yǎng)基。（三）主要試劑70%75%乙醇，0.1%升汞（HgCl2），等。（四）用品用具超凈工作臺，酒精燈，酒精棉球，無菌水，已滅菌的500 mL燒杯、15 cm培養(yǎng)皿，接種用工具（醫(yī)用剪刀、鑷子、手術刀具），廢液杯，工作帽，口罩，工作服，記號筆，等。五、實驗操作（一）外植體的預處理將從校園綠化帶采集的光葉海桐的幼嫩枝條用自來水沖清干凈，然后適當修剪為適當大小的莖段和葉片兩類，瀝水，放入燒杯，帶進接種室。（二）無菌室消毒接種操作前半小時，先將培養(yǎng)基、無菌水、燒杯、培養(yǎng)皿、外植體材料等有序放置在超凈工作臺上，打開紫外燈（不開照明燈）進行空間消毒；20 min后，關閉紫外燈（仍

24、不開照明燈），開啟超凈工作臺；至超凈工作臺運行10 min后，進入無菌室操作。（三）外植體的消毒操作者在超凈工作臺前坐好，用酒精棉球擦拭雙手和手臂，蘸酒精灼燒托盤、剪刀、鑷子等接種工具。先將海桐外植體材料轉入一只無菌燒杯，用75%乙醇浸潤1015 s左右（時間不宜太長），倒出乙醇，立即加入無菌水洗滌2遍，瀝水；將材料轉移到另一無菌燒杯中，再用0.1%升汞溶液浸泡消毒10 min，用無菌水清洗4次，瀝水；然后轉移到無菌的大培養(yǎng)皿中，待剪切接種。（四）外植體的接種培養(yǎng)將消毒后的海桐外植體材料放入無菌培養(yǎng)皿托盤，左手持鑷子，右手持手術刀，進行切割。莖段切割為約1 cm長的無芽小段（棄掉節(jié)，僅用節(jié)間）

25、；葉片切成約0.50.8 cm寬的片段。然后，分類接種到各培養(yǎng)基上，每瓶3段（片），水平放置，用鑷子輕壓，但不能深埋入培養(yǎng)基中。接種完成后，將培養(yǎng)基轉移到培養(yǎng)室，培養(yǎng)溫度28左右。要求前3天用報紙或窗簾布等遮光暗培養(yǎng)，之后再照光培養(yǎng)。光照強度1200 lux左右，每天光照810 h。（五）觀察記錄組培室實行開放式管理，在上班時段內，各小組可根據培養(yǎng)進程自行安排時間前往觀察、管理、記錄和拍照（如果本小組的實驗失敗，須分析原因；并參與其它實驗小組的情況觀察或重做）。 實驗記錄和指標分析： 接種的外植體總數；愈傷組織發(fā)生的外植體數；誘導發(fā)生率（%）；愈傷初發(fā)時間（接種后第n天）；愈傷組織的形態(tài)（顏色

26、、質地、疏松度）。六、愈傷組織繼代培養(yǎng) 此部分內容，根據各實驗小組的前期愈傷組織誘導效果酌情安排。（一）培養(yǎng)基參照愈傷組織誘導的適宜培養(yǎng)基，適當降低生長素的濃度。（二）繼代培養(yǎng)按無菌操作規(guī)程，將誘導發(fā)生的愈傷組織從相應外植體上剝離，接種到新配制的繼代增殖培養(yǎng)基上，進行光照培養(yǎng)。實驗記錄和指標分析： 繼代培養(yǎng)的愈傷組織的外觀形態(tài)（顏色、質地、疏松度）；愈傷組織的生長速度（增殖率）。接種鮮重(mg /瓶) = 接種后瓶重( mg)接種前瓶重(mg)收獲鮮重(mg /瓶) = 收獲前瓶重( mg)收獲后瓶重(mg)增殖率(% ) = (收獲鮮重接種鮮重) /接種鮮重100%七、預習思考與作業(yè)1、愈傷組織誘導發(fā)生的基本原理是什么，植物激素對于愈傷組織的誘導產生有何作用。2、如何設計植物組織培養(yǎng)基的多因子實驗（正交實驗）？實驗七 組培苗的煉苗一、目的與要求學習和掌握熟練掌握組培苗移栽馴化技術二、實驗原理 瓶苗是在無菌、營養(yǎng)供給全面、光照適宜、溫度適宜、相對濕度為10