1、.,第一節(jié) 病毒的純化,一、病毒純化前的準(zhǔn)備工作,繁殖病毒,利用生物學(xué)方法純化病毒,病毒感染的純化與診斷,.,二、標(biāo)本的采取與送檢,應(yīng)注意下列原則： 1.對(duì)本身帶有雜菌 (如咽拭子、糞便) 或易受污染的標(biāo)本，要進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)使用抗生素。 2.因病毒在室溫中易失去活性，標(biāo)本應(yīng)低溫保存并盡快送檢。 3.血清學(xué)診斷標(biāo)本的采取應(yīng)在發(fā)病初期和病后各取血清，以便對(duì)比雙份血清抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化。,.,三、病毒和病毒成份的提純,病毒純度的判定依據(jù)：,物理均一性； 病毒滴度與蛋白含量的比例； 免疫反應(yīng)單一而無非特異反應(yīng)； 結(jié)晶形成,.,在病毒不失活的前提下，從宿主細(xì)胞中釋放出來； 病毒的純化可以應(yīng)用提純

2、蛋白質(zhì)的技術(shù)方法； 對(duì)大小、形狀和密度高度一致的病毒粒子， 可以采用分級(jí)分離的技術(shù)。,病毒提純的主要原則：,.,四、病毒萃取液的分級(jí)純化,沉淀法,中性鹽沉淀法,聚乙二醇沉淀法,有機(jī)溶劑沉淀法,等電點(diǎn)沉淀法,離 心 法,差速離心法,密度梯度離心法,速率區(qū)帶離心法,等密度區(qū)帶法,凝膠色譜法,電泳法,.,病毒的感染單位（IU）：能夠引起宿主或宿主細(xì)胞發(fā)生一定特異性反應(yīng)的病毒最小劑量； 病毒效價(jià)：指單位體積(ml)病毒懸液的感染單位數(shù)目(IUml)或稱毒力 ； 噬菌體效價(jià)（pfu) ：又稱噬菌斑形成單位數(shù)指單位體積的噬菌體，能使感染細(xì)菌裂解，產(chǎn)生噬菌斑的數(shù)量。,因?yàn)椴《玖Ｗ訉?duì)細(xì)菌細(xì)胞感染率不會(huì)超過10

3、0，所以根據(jù)噬菌斑或空斑計(jì)算出的病毒粒子數(shù)總比噬菌體電鏡下觀察數(shù)低。,一、侵染力的測(cè)定,第二節(jié) 病毒的檢測(cè),.,半致死劑量(LD50) ： 使半數(shù)宿主細(xì)胞死亡的病毒劑量稱半致死劑量； 半致感染劑量(ID50) ：使半數(shù)宿主細(xì)胞發(fā)生感染的病毒劑量 ； 半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50) ：使半數(shù)組織培養(yǎng)物發(fā)生感染，產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)的病毒劑量。,.,二、病毒的培養(yǎng),1.動(dòng)物接種 是最原始的病毒培養(yǎng)方法，根據(jù)病毒種類不同，選擇敏感動(dòng)物及適宜接種部位，如嗜神經(jīng)性病毒（狂犬病毒）可接種于小鼠腦內(nèi)，痘病毒可接種于家兔角膜或皮內(nèi)。,2.雞胚培養(yǎng) 雞胚對(duì)多種病毒敏感。一般采用孵化914天的雞胚，根據(jù)病毒種類

4、不同，將病毒標(biāo)本接種于雞胚的不同部位，最常用的雞胚接種部位有：羊膜腔、尿囊腔、絨毛尿囊膜和卵黃囊等。,3.組織培養(yǎng)法 (tissueculture) 或細(xì)胞培養(yǎng) (cellculture)法 是將離體活組織塊或分散的組織細(xì)胞加以培養(yǎng)的技術(shù)總稱，為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。,.,.,細(xì)胞的變化 有些病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖時(shí)可引起特有的細(xì)胞病變，稱為細(xì)胞病變效應(yīng) (CPE)。常見的變化有細(xì)胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等。 有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等 作用于細(xì)胞膜，可使鄰近的細(xì)胞相互融合，形成多核巨細(xì)胞或稱融合細(xì)胞。 有些病毒 (如狂犬病病毒、麻疹病毒等) 可在培養(yǎng)細(xì)胞中形成胞漿或核內(nèi)

5、的包涵體。,病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的指標(biāo),2.紅細(xì)胞吸附 (hemadsorption,HAd) 流感或副流感病毒等感染細(xì)胞后，由于細(xì)胞膜上出現(xiàn)了血凝素(haemagglutinin,HA)，具有吸附脊椎動(dòng)物 (豚鼠、雞、猴等) 紅細(xì)胞的能力，這一現(xiàn)象稱紅細(xì)胞吸附，常用來測(cè)定具有HA的粘病毒與副粘病毒的增殖。若有相應(yīng)的抗血清，則能中和細(xì)胞膜上的HA，HAd不再發(fā)生，稱紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)。,.,3.干擾現(xiàn)象(interference) 某些病毒感染細(xì)胞時(shí)不出現(xiàn)CPE或其他易于測(cè)出的變化(如HAd)，但能干擾在其后感染的另一病毒的增殖。如風(fēng)疹病毒感染Vero細(xì)胞時(shí)CPE不明顯，但它能干擾后感染的埃可

6、病毒 (ECHOV) 的增殖，從而阻抑后者所特有的CPE。,4.細(xì)胞代謝的改變 病毒感染細(xì)胞的結(jié)果可使培養(yǎng)液的pH值改變，說明細(xì)胞的代謝在病毒感染后發(fā)生了變化。這種培養(yǎng)環(huán)境的生化改變也可作為判斷病毒增殖的指標(biāo)。,.,(二) 病毒的數(shù)量與感染性測(cè)定,1.蝕斑測(cè)定 是一種檢查和準(zhǔn)確滴定病毒感染性的方法。將稀釋的病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。病毒吸附后，再覆蓋一層融化的半固體營養(yǎng)瓊脂，使病毒在單層細(xì)胞培養(yǎng)中有限擴(kuò)散。結(jié)果是每一個(gè)有感染性的病毒在單層細(xì)胞中可產(chǎn)生一個(gè)局限性的感染灶。用活性染料 (如中性紅) 染色，則活細(xì)胞著色，受病毒感染而破壞的細(xì)胞不著色，形成肉眼可見的蝕斑(plaque)。每個(gè)蝕斑是

7、由一個(gè)感染性病毒顆粒形成的，稱作蝕斑形成單位 (plaque forming unit,PFU)。病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用PFUml表示。,.,2.50%組織細(xì)胞感染量 (TCID50)測(cè)定法 該方法是測(cè)定病毒能使50%的組織培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生感染的最小量。一般是將病毒懸液作10倍的系列稀釋，分別接種細(xì)胞，經(jīng)一定時(shí)間后觀察CPE、血細(xì)胞吸附等指標(biāo)，以最高稀釋度能感染50%細(xì)胞的量為終點(diǎn)。最后用統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算出50%組織細(xì)胞感染量。,.,三、病毒感染的血清學(xué)診斷,原理是用已知病毒抗原來檢測(cè)病人血清中有無相應(yīng)抗體，故須待病人感染后體內(nèi)產(chǎn)生抗體時(shí)才能檢出。 另外，在采取臨床標(biāo)本及病人血清應(yīng)注意病程

8、，必須采取患者急性期血清與恢復(fù)期血清 (雙份血清) 進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)。若第2次血清抗體滴度比第1次高出4倍以上時(shí)，才有診斷意義。,.,2.中和試驗(yàn)(neutralizing test,NT test),是病毒在活體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗(yàn)。 中和抗體是作用于病毒表面抗原 (衣殼或包膜) 的抗體，同種不同型病毒間一般無交叉，特異性高，而且抗體在體內(nèi)維持時(shí)間長。中和抗體陽性不一定表示正在感染中，也可能因以前有過隱性感染所致。因此，中和試驗(yàn)適用于人群免疫情況的調(diào)查，在臨床診斷上較少使用。,1.免疫沉淀法,使Ag-Ab形成不溶性的沉淀。,.,3.補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) (complem

9、ent fixation test,CF test),如果反應(yīng)系統(tǒng)中存在待測(cè)的抗體（或抗原），則抗原抗體發(fā)生反應(yīng)后可結(jié)合補(bǔ)體；再加入指示系統(tǒng)時(shí)，由于反應(yīng)液中已沒有游離的補(bǔ)體而不出現(xiàn)溶血，是為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽性。如果反應(yīng)系統(tǒng)中不存在的待檢的抗體（或抗原），則在液體中仍有游離的補(bǔ)體存在，當(dāng)加入指示系統(tǒng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)溶血，是為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陰性。因此補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可用已知抗原來檢測(cè)相應(yīng)抗體，或用已知抗體來檢測(cè)相應(yīng)抗原。,.,補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)圖示,受檢系統(tǒng),指示系統(tǒng),溶血反應(yīng),補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn),1、僅有抗原或抗體,補(bǔ)體,紅細(xì)胞,溶血素,陽性,陰性,2、抗原抗體反應(yīng),紅細(xì)胞,溶血素,陰性,陽性,抗原,抗體,補(bǔ)體,抗原/抗體

10、,.,5. 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay 簡稱ELISA ）,以待測(cè)抗原（或抗體）與酶標(biāo)抗體（或抗原）的特異結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過酶活力測(cè)定來確定抗原（或抗體）含量。,4.凝膠擴(kuò)散法,Ag和Ab相遇形成沉降帶。,.,ELISA的基本類型,先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相裁體上，并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)，將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離成分。然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行定性或定量測(cè)定。 根據(jù)檢測(cè)目的和操作步驟不同，有競(jìng)爭法、雙抗體夾心法、間接法三種類型的

11、常用方法。,.,此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例, 將抗原吸附于固相載體；加入待測(cè)抗原和一定量特異性抗體，使固相抗原與待測(cè)抗原二者競(jìng)爭與抗體結(jié)合；經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的抗體與待測(cè)抗原含量呈負(fù)相關(guān)。,競(jìng)爭法,.,此法常用于測(cè)定抗原, 將已知抗體吸附于固相載體, 加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測(cè)定。,雙抗體夾心法,.,此法是測(cè)定抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體(酶標(biāo)抗抗體)和底物進(jìn)行測(cè)定。,間接法,.,四、病毒核酸檢測(cè),雜交法 用于病毒檢測(cè)的有斑點(diǎn)雜交、細(xì)胞內(nèi)原位雜交 、DNA印跡雜交、RNA印跡雜交等。 PCR法 目前多數(shù)病毒基因已通過分子克隆技術(shù)被明確了核苷酸序列，使得DNA擴(kuò)增技術(shù)逐步發(fā)展為常規(guī)診斷技術(shù)之一。,反轉(zhuǎn)錄PCR,.,基因芯片技術(shù),又稱DNA芯片、生物芯片（biochip）。 其原理是