1、.,1,第二章 PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用,.,2,故事發(fā)生在1983年 的春夏之交,.,3,Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。 他原本是要合成DNA引物來進(jìn)行測(cè)序工作， 卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個(gè)晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個(gè)引物（而不是一個(gè)引物）去擴(kuò)增模板DNA 的想法.,很少有在公司工作的科研人員得 諾貝爾獎(jiǎng)， Mullis是其中之一,.,4,Mullis開車的時(shí)候, 瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對(duì)面開來的車象是DNA聚合酶，面對(duì)面地合成著DNA， ,.,5,Mullis的第一

2、個(gè)PCR實(shí)驗(yàn),1983年9月中旬。 Mullis在反應(yīng)體系中加 入DNA聚合酶后在37 一直保溫。結(jié)果第二 天在瓊脂糖電泳上沒有 看到任何條帶。于是他認(rèn)識(shí)到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標(biāo)記的PCR條帶。,.,6,.,7,第一種高溫菌DNA聚合酶的分離,美國黃石國家公園,.,8,Thermus aquaticus,.,9,The Thermus aquaticus DNA polymerase Taq Not permanently destroyed at 94C Optimal temperature is 72C

3、,.,10,耐高溫DNA聚合酶的種類,Taq DNA聚合酶 (Thermus aquaticus，Cetus/Roche) Tth DNA聚合酶 (Thermus thermophilus，Toyobo) Pfu DNA聚合酶 （Pyrococcus furiosus，Stratagene） Deep Vent DNA聚合酶 (Bio-labs） Tfl DNA聚合酶 （Thermus flavus，Promega) Tli DNA聚合酶 (Thermococcus litoralis，Promega) Vent DNA聚合酶 (Bio-labs） Pwo DNA聚合酶 ( Pyrococcu

4、s woesei，Roche) Pfx DNA聚合酶 (Thermococcus kodakaraensis, Invitrogen) Dynazyme DNA聚合酶（Thermus brockianus，F(xiàn)innazyme） FD DNA聚合酶 (Thermus sterophilus？，復(fù)旦大學(xué)) Tma, Tne, KOD, ,.,11,PCR儀器的變遷,三個(gè)水浴鍋， 用手移動(dòng) （Mullis等人當(dāng)時(shí)用的） 電加熱塊 自來水冷卻 （PE，1988） 電加熱塊 內(nèi)置循環(huán)液冷卻 （PE，1989） 三個(gè)加熱塊 機(jī)械手 （Stratagene，1994） 半導(dǎo)體制冷和加熱 （MJ, PE, B

5、ioMetra, Eppendrof） 溫度梯度, 熒光檢測(cè) (如 Roche的Lightcycler) 風(fēng)加熱 Lab-on-chip式的PCR儀(所謂的芯片PCR) 中國的狀況 1991年出現(xiàn)三個(gè)水浴鍋+機(jī)械手的原始PCR儀（華美，復(fù)日等） 現(xiàn)在以半導(dǎo)體（Peltier板）制冷式為主（杭州博日,上海天呈, 廈門安普利等）,.,12,PCR的發(fā)展史,1983年春，Mullis發(fā)展出PCR的概念； 1983年9月，Mullis用大腸桿菌DNA聚合酶做了第一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)，只用一個(gè)循環(huán)； 1983年12月，用同位素標(biāo)記法看到了10個(gè)循環(huán)后的49 bp長度的第一個(gè)PCR片斷； 1985年12月20日

6、，Mullis的同事Saiki在Science上發(fā)了一篇論文，方法中用了PCR技術(shù)，導(dǎo)致Mullis的文章到處被拒； 1985年10月25日申請(qǐng)了PCR的專利，1987年7月28日批準(zhǔn)（專利號(hào)4,683,202 ），這回Mullis是第一發(fā)明人。 1986年5月，Mullis在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開始學(xué)習(xí)PCR的方法； 1986年6月，Cetus公司純化了第一種高溫菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，這是85年春天Mullis建議做的； 1988年，第一臺(tái)PCR儀問世； 1991年，Hoffman LaRoche以3億美元的代價(jià)從Cetus公司獲得全權(quán)開發(fā)權(quán)。,

7、.,13,PCR不只是一個(gè)方法改進(jìn),Mullis的上司有句“名言”，“我們要擴(kuò)增這么多DNA樣品有什么用”； 到了1991，Cetus公司以3億美元的轉(zhuǎn)讓費(fèi)將PCR相關(guān)專利轉(zhuǎn)讓給瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的經(jīng)營中又獲得了數(shù)億美元的分紅； Mullis于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，PCR和DNA重組技術(shù)一樣意義深遠(yuǎn)。,.,14,PCR相關(guān)的術(shù)語和產(chǎn)品層出不窮,T-vector HotStart Taq RT-PCR RAPD-PCR DDRT-PCR LM-PCR Inverse PCR Nested PCR Real-time PCR RACE Flow chip PCR

8、,TAS Multiplex PCR Immuno PCR Asymmetric PCR LP-PCR NASBA Recombinant PCR AFLP SSCP In situ PCR TaqMan/SYBR green,.,15,1st cycle,2nd cycle,3rd cycle,過 程,變 性,引 物 退 火,DNA 復(fù)制,（一）PCR的基本原理,.,16,（二）PCR的種類 1.普通PCR,.,17,PCR,瓊脂糖凝膠電泳,最終產(chǎn)物,紫外光觀察,3-4 小時(shí),.,18,PCR具有極高的靈敏度,樣品,正對(duì)照,負(fù)對(duì)照,標(biāo)準(zhǔn)分子量,污染是PCR實(shí)驗(yàn)的常見問題。只要實(shí)驗(yàn)室里曾經(jīng)擴(kuò)增

9、過某個(gè)片段，就有可能以后的實(shí)驗(yàn)中發(fā)生污染。,因此，做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候絕對(duì)不要忘了負(fù)對(duì)照。 用紫外燈破壞污染物也是一個(gè)辦法,.,19,（二）PCR的種類 2.RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcriptase-PCR) 原理：RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。 特點(diǎn)：作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT

10、及基因特異性引物(GSP)中的一種。對(duì)于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種都可。 應(yīng)用：RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，分析基因的轉(zhuǎn)錄水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量，直接克隆特定基因的cDNA序列。,.,20,兩步法RT-PCR示意圖,一步法RT-PCR示意圖,.,21,一步法和兩步法RT-PCR的比較,.,22,cDNA合成過程示意圖,.,23,cDNA序列的克隆,.,24,（二）PCR的種類 2.Nested PCR：巢式PCR 原理：利用兩套PCR引物（巢式引物）對(duì)進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。 優(yōu)點(diǎn)：由于巢

11、式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性（因?yàn)榕c兩套引物都互補(bǔ)的引物很少）增加了檢測(cè)的敏感性；兩對(duì)PCR引物與檢測(cè)模板的配對(duì)，增加了檢測(cè)的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5RACE）的特異性。 應(yīng)用：一般應(yīng)用于動(dòng)物方面。如：病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等。,.,25,Nested PCR原理示意圖,.,26,（二）PCR的種類 3.Inverse PCR：反向PCR 原理：用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切裂解含核心區(qū)的DNA，以產(chǎn)生適合于PCR擴(kuò)增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環(huán)狀分子。PCR的引物同源于環(huán)上核心區(qū)的末端序列，但其

12、方向可使鏈的延長經(jīng)過環(huán)上的未知區(qū)而不是分開引物的核心區(qū)。這種反向PCR方法可用于擴(kuò)增本來就在核心區(qū)旁邊的序列，還可應(yīng)用于制備未知序列探針或測(cè)定邊側(cè)區(qū)域本身的上、下游序列。 優(yōu)點(diǎn)：可使已知序列的核心區(qū)邊側(cè)的未知DNA成幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增。 應(yīng)用：一般應(yīng)用于未知序列的擴(kuò)增，有時(shí)也用于定點(diǎn)突變。,.,27,Inverse PCR原理示意圖,.,28,（二）PCR的種類,4.PCR-RFLP: 多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)-限制性片段長度多態(tài)性 (restriction fragment length Polymorphism，RFLP) 原理：PCR產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶切多態(tài)性分析，DNA發(fā)生重排后，酶切位點(diǎn)發(fā)生改

13、變。 優(yōu)點(diǎn)：具有分辯率高，無需標(biāo)記,重復(fù)性好，簡便快速直觀等。主要用于核酸變異性分析與比較, 微生物的分群分型分亞型，癌基因分析，遺傳病的診斷等。 局限：只能應(yīng)用突變引起限制性酶切位點(diǎn)改變的情況下，一次只能完成一個(gè)特定位點(diǎn)突變篩選，檢測(cè)效率低。,.,29,PCR-RFLP原理示意圖,.,30,5.PCR-SSCP：聚合酶鏈反應(yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism) 原理：是將經(jīng)擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)過變性處理，形成單鏈，由于序列不同，單鏈構(gòu)象就有差異，在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳的遷移率不同，通過與標(biāo)準(zhǔn)物的對(duì)比，即可檢測(cè)出有無變異。 特點(diǎn)：

14、剛建立時(shí)是將同位素?fù)饺隤CR擴(kuò)增的產(chǎn)物中，通過放射自顯影顯示結(jié)果。后用銀染取代同位素顯示DNA帶型，大大降低了成本，具有經(jīng)濟(jì)、快速、靈敏等特點(diǎn)。1993年起用EB染色法顯示DNA帶型。 優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)基因變異，具有操作簡便、快速、不需特殊設(shè)備，適用于大樣本篩選。己廣泛應(yīng)用于檢測(cè)各種病原體基因的點(diǎn)突變及缺失突變，基因的多態(tài)性分析等。,（一）PCR的種類,.,31,PCR-SSCP示意圖,.,32,從定性到定量的革命,.,33,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可對(duì)特定核苷酸片斷進(jìn)行指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增 。在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，我們可以通過凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析，也可以通過 放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃

15、描來進(jìn)行定量的分析 。無論定性還是定量分析，分析的都是 PCR 終產(chǎn)物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經(jīng) PCR 信號(hào)放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達(dá)量。在這種需求下熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。,普通PCR定量分析的困惑,.,34,PCR產(chǎn)物生成曲線,logDNA,Cycles,.,35,logDNA,Cycles,不同樣品有不同的生成曲線,.,36,實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”，最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA (or

16、cDNA) 的起始濃度進(jìn)行定量的方法。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA) 拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方法。,.,37,Real Time PCR and Conventional PCR,VS,.,38,Repeat,Denaturation Primer Annealing Elongation,常規(guī) PCR Process,In theory, product accumulation is proportional to 2n, where n is the number of amplification cycle repeats,.,39,Reality vs. T

17、heory,Amplification is exponential, but the exponential increase is limited:,A linear increase follows exponential Eventually plateaus,.,40,定量的最佳時(shí)期,Quantitative information comes from monitoring the early stages of amplification.,Real Life,Detector,Theoretical,Log Target DNA,Cycle #,.,41,普通PCR和熒光定量P

18、CR的區(qū)別,常規(guī)PCR是通過電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的最終產(chǎn)物進(jìn)行定性分析（定量不準(zhǔn)確），無法進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)； 熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA (or cDNA) 的起始濃度進(jìn)行定量的方法（準(zhǔn)確定量） 。,.,42,普通PCR和定量PCR的區(qū)別,適用定性分析，不適合定量分析； PCR 產(chǎn)物的長度從100bp 數(shù)kb,實(shí)時(shí)檢測(cè):每個(gè)循環(huán)都產(chǎn)出熒光信號(hào) 絕對(duì)定量，靈敏度更高 PCR產(chǎn)物的長度一般在 60-150 bps,.,43,熒光定量PCR的原理,基本原理：擴(kuò)增呈指數(shù)增長，在反應(yīng)體系和條

19、件完全一致的情況下，樣本DNA含量與擴(kuò)增產(chǎn)物的對(duì)數(shù)成正比。由于反應(yīng)體系中的熒光染料或熒光標(biāo)記物(熒光探針)與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光，其熒光量與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比。因此，通過熒光量的檢測(cè)就可以測(cè)定樣本核酸量。 熒光化合物分為兩類 （1）非特異性的嵌入熒光染料：利用嵌入熒光染料檢測(cè)，只是簡單地反映PCR反應(yīng)體系中總的核酸量，是一種非特異性的檢測(cè)方法。 （2）特異性熒光(引物)探針：增加了探針的識(shí)別步驟,特異性、專一性更高。,.,44,非特異性的嵌入熒光染料 （Non-specific DNA binding dyes）,SYBR Green I SYBR Gold Ethidium Bromide,.,4

20、5,Real-Time PCR，SYBR green,Molecular Probe公司的一個(gè)專利產(chǎn)品， US Patent 5,436,134 1993年7月12日申請(qǐng),.,46,SYBR green 的優(yōu)缺點(diǎn),簡便 可以使用已有的引物 普遍通用 可以檢測(cè)所有的雙鏈DNA，包括引物二聚體； 需要化大力氣優(yōu)化反應(yīng)條件，以消除非特異性擴(kuò)增； 價(jià)格 $1 / PCR 反應(yīng) 定量的靈敏度有所欠缺,.,47,Extension,Extension Continued Apply Excitation Wavelength,Repeat,DNA binding dyes,.,48,特異性的熒光探針,特異

21、性的熒光探針是把熒光化合物標(biāo)記到特異性的寡核苷酸上形成熒光標(biāo)記的DNA探針。通過探針與PCR產(chǎn)物特異性的結(jié)合,在PCR過程中可對(duì)產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)均相、實(shí)時(shí)、定量檢測(cè),也適用于多通道檢測(cè)。 TaqMan探針,.,49,定量 PCR，TaqMan體系,ABI 公司首先推出(PRISM 7000系列) US Patent 5,723,591, 1995年11月申請(qǐng)。 實(shí)時(shí)檢測(cè): 每個(gè)循環(huán)都會(huì)產(chǎn)生與PCR產(chǎn)物成正比的熒光物質(zhì),.,50,TaqMan探針是一段5端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)(R),3端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)(Q)的寡核苷酸,其序列與模板DNA中的一段完全互補(bǔ)。 當(dāng)探針單獨(dú)存在時(shí),由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生,R的

22、熒光受到Q的猝滅。在PCR過程中,由于TaqDNA酶的5-3外切酶活性的作用,使探針的5端的R被切斷,加大了與Q的距離而使熒光恢復(fù)。 一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號(hào)的產(chǎn)生。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加,釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此,Taqman探針檢測(cè)的是積累熒光。,.,51,Cleavage-based assay: TaqManTM,d.NTPs,Thermal Stable DNA Polymerase,Primers,Add Master Mix and Sample,Denaturation,Annealing,Reaction Tube,l,.,52,5,3,Extensio

23、n Step,1. Strand Displacement,2. Cleavage,3. Polymerization Complete,4. Detection,l,Cleavage-based assay: TaqManTM,.,53,Cycle,一般而言，熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段 , 熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。 PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信

24、號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR 產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。 為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT 值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是 3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值。,.,54,Ct value and Real-Time Quantitative PCR Theory,Ct值 (Threshold Cycle) PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)超過基線值（進(jìn)入指數(shù)增長期）時(shí)的循環(huán)數(shù)。,.,55,principle of quantitative real-time PCR use when rather than how much,fluorescent signal,PCR cycles,real-time PCR amplification plots (7 x 10-fold dilns. + NT