1、DNA序列測定,脫氧 核糖,含氮堿基,磷酸,A,G,C,T,DNA的基本單位脫氧核苷酸,腺嘌呤,鳥嘌呤,胞嘧啶,胸腺嘧啶,DNA測序：測定未知序列 確定重組DNA的方向與結(jié)構(gòu) 對突變進(jìn)行定位和鑒定 比較研究,成熟的DNA測序技術(shù)始于20世紀(jì)70年代中期。 1977年Maxam 和Gilbert報道了通過化學(xué)降解測定DNA序列的方法。 同一時期, Sanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法 20世紀(jì)90年代初出現(xiàn)的熒光自動測序技術(shù)將DNA測序帶入自動化測序的時代。 這些技術(shù)統(tǒng)稱為第一代DNA測序技術(shù)。,第二代測序技術(shù),三種第二代測序技術(shù)對比,第三代測序技術(shù),第二代測序技術(shù)在制備測序文庫的時候都需要經(jīng)過PC

2、R擴(kuò)增，而這一PCR過程可能引入突變或者改變樣品中核酸分子的比例關(guān)系。另外，第二代測序的讀長普遍偏短，在進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接時會遇到麻煩。為了克服這樣的缺點，業(yè)界發(fā)展出了以單分子實時測序和納米孔為標(biāo)志的第三代測序技術(shù)。,Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法,基本原理：,直接或間接特異性識別4 種堿基 特定化學(xué)試劑可對堿基進(jìn)行特異性修飾在修飾堿基處(5或3)打斷磷酸二酯鍵,將一個 DNA 片段的 5 端磷酸基作放射性標(biāo)記，再分別采用不同的化學(xué)方法修飾和裂解特定堿基，從而產(chǎn)生一系列長度不一而 5 端被標(biāo)記的 DNA 片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過凝膠電泳分離，再經(jīng)放射線自顯影，確定各片段末

3、端堿基，從而得出目的 DNA 的堿基序列。,操作步驟,將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂?每個單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記,以便顯示DNA條帶 分別用不同方法處理,獲得只差一個核苷酸的降解DNA群體 電泳,讀取DNA的核苷酸順序, 先用限制性內(nèi)切酶把DNA切成10200bp 的測序材料； 用堿性磷酸化酶處理該片段，消除5末端上的磷酸； 在5OH端標(biāo)記 32P，用多核苷酸磷酸激酶催化； 標(biāo)記片段變性為單鏈； 用特異的化學(xué)試劑作用于不同的堿基進(jìn)行修飾，然后用哌啶甲酸切斷反應(yīng)堿基的多核苷酸鏈，緊接著用四組不同的特異反應(yīng)可以使末端標(biāo)記的DNA分子切成不同長度的片段， 產(chǎn)生一組其末端都是該特異堿基的長度

4、不等的DNA片段； 經(jīng)電泳和放射性自顯影后，從4個反應(yīng)系統(tǒng)統(tǒng)一閱讀，待測DNA的全部核苷酸序列就可直接讀出,該反應(yīng)的關(guān)鍵在于使DNA的4種核苷酸中，只有1-2種發(fā)生特異性的化學(xué)切割反應(yīng)： 堿基的特異性修飾； 修飾的堿基從核糖環(huán)上轉(zhuǎn)移； 失去堿基的糖環(huán)部位發(fā)生DNA鏈斷裂。 專門用來對核苷酸作化學(xué)修飾，并打斷磷酸二酯鍵的化學(xué)試劑有硫酸二甲酯（dimethylsulphate)和肼(hydrazine)、哌啶甲酸等。,肼，又稱聯(lián)氨 NH2.NH2 在堿性環(huán)境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置導(dǎo)致糖苷鍵斷裂。 如果加入高濃度的鹽（1.5M NaCl），肼則主要作用于胞嘧啶C使之?dāng)嗔选?在高

5、溫強(qiáng)堿作用(90,1.2M NaOH)下可使腺嘌呤A位點發(fā)生劇烈的斷裂反應(yīng),但對胞嘧啶C的反應(yīng)較弱,哌啶甲酸(90,1mol/L)在修飾位點兩端使DNA的糖-磷酸鏈斷裂,胞嘧啶,胸腺嘧啶,硫酸二甲酯dimethyl sulphate ，DMS ，（CH3O）2SO2： 一種堿性化學(xué)試劑，可以使DNA鏈上的腺嘌呤A的N2和鳥嘌呤G的N甲基化，但是鳥嘌呤G的N甲基化速度比腺嘌呤A的N2甲基化速度要快4-10倍，并且在中性pH環(huán)境中，DMS主要作用于鳥嘌呤G，使之甲基化，導(dǎo)致糖苷鍵斷裂。,熱哌啶：使DNA鏈上的嘌呤在酸的作用下發(fā)生糖苷水解，導(dǎo)致DNA鏈在脫嘌呤位點（G和A）發(fā)生斷裂。,DNA化學(xué)降解

6、反應(yīng)體系 反應(yīng)體系 堿基修飾試劑 堿基修飾反應(yīng) 主鏈斷裂試劑 斷裂點 G 硫酸二甲酯 鳥嘌呤甲基化 六氫吡啶 G G+A 甲酸 脫嘌呤作用 六氫吡啶 G和A C+T 肼 嘧啶開環(huán) 六氫吡啶 C和T C 肼（加鹽） 胞嘧啶開環(huán) 六氫吡啶 C,DMS（硫酸二甲酯）在中性pH環(huán)境，主要作用于G，被六氫吡啶作用而造成該位點上DNA鏈的斷裂。 甲酸具有脫嘌呤作用。DNA鏈在脫嘌呤位點(G和A)發(fā)生斷裂。 肼，在堿性條件下，作用于T胸腺嘧啶和C胞嘧啶，在具有六氫吡啶的條件下，導(dǎo)致在這個核苷酸位置上發(fā)生DNA鏈的斷裂。如果在反應(yīng)體系中加入高濃度的鹽，同胸腺嘧啶的反應(yīng)速率便會下降，主要作用于C胞嘧啶。,A C

7、 肼 90C, NaOH (1.2M) 斷裂反應(yīng),在4種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異地斷裂DNA的機(jī)制是： G+A反應(yīng)-（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。 G反應(yīng)-硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后斷開了C8-C9間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。 T+C反應(yīng)-肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。 C反應(yīng)-在NaCl存在時，只有C才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。,在4種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異地斷裂DNA的機(jī)制是： G+A反應(yīng)-（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧核

8、糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。 G反應(yīng)-硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后斷開了C8-C9間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。 T+C反應(yīng)-肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。 C反應(yīng)-在NaCl存在時，只有C才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。,哌啶,5 GATCACTACTG 3 ,標(biāo)記,5 *GATCACTACTG 3 ,G：DMS,C：肼（加鹽）,G+A：甲酸,C+T：肼,5-*GATCACTACTG,5-*G,G,5-*GATCACTACTG,5-*GATCACTA,5-*GATCA,5-*GA,5-*G,5-*GAT

9、CACTAC,5-*GATCACT,5-*GATCAC,5-*GATC,5-*GAT,5-*GATCACTACT,5-*GATCACTACTG-,5-*GATCACTAC,5-*GATCAC,5-*GATC,-*GATCACTACTG-,在化學(xué)修飾反應(yīng)過程中，通過控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間，只有一小部分堿基被修飾(而不是全部被修飾)，隨后進(jìn)行的斷裂反應(yīng)也是定量反應(yīng)。因此，DNA鏈并不是在所有可被修飾的堿基位點斷裂，而是隨機(jī)斷裂。在4個反應(yīng)中，產(chǎn)生4套帶相同標(biāo)記末端、長短不一的寡聚核苷酸片段。只有帶標(biāo)記末端的片段可被識別，沒有標(biāo)記末端的片段可以忽略不計。,、,在化學(xué)修飾反應(yīng)過程中，通過控制反應(yīng)溫度和

10、反應(yīng)時間，只有一小部分堿基被修飾(而不是全部被修飾)，隨后進(jìn)行的斷裂反應(yīng)也是定量反應(yīng)。因此，DNA鏈并不是在所有可被修飾的堿基位點斷裂，而是隨機(jī)斷裂。在4個反應(yīng)中，產(chǎn)生4套帶相同標(biāo)記末端、長短不一的寡聚核苷酸片段。只有帶標(biāo)記末端的片段可被識別，沒有標(biāo)記末端的片段可以忽略不計。,電泳和讀譜,具體的測定過程中，首先將3端或5端的雙鏈DNA溶解在總體積為50L的、分別含有0.03mol/LNaOH、10%甘油、1mmol/L EDTA、0.05%二甲苯藍(lán)和0.05%溴甲酚藍(lán)的溶液中，使雙鏈DNA變性。然后加到由5%10%的丙烯酰胺、0.16%0.33%的雙丙烯酰胺、50mmol/LTris-硼酸、p

11、H8.3的1mmol/L EDTA組成的凝膠板上，進(jìn)行電泳和放射性自顯影等處理，制得一端帶標(biāo)記的單鏈DNA。,電泳檢測-310,步驟：毛細(xì)管灌膠,步驟：樣品盤移動,步驟：電進(jìn)樣及電泳,步驟：熒光激發(fā)及檢測,化學(xué)法讀序的方法,化學(xué)法測序放射自顯影圖譜的識讀，比較復(fù)雜一些，這是因為化學(xué)裂解反應(yīng)并不完全是堿基特異性的，每組測序圖譜為4或5條垂直的階梯帶，AC反應(yīng)可以不做。該片從膠底部一個個向頂部讀，G+A和C+T兩列中含有所有相差一個堿基的DNA片段。如果G+A中出現(xiàn)1條帶就看G列中是否有同樣大小的帶，若有即為G堿基，無則為A堿基；同理，C+T中則檢查C列中有無同樣大小條帶，有即為C，無則為T。在做

12、了AC反應(yīng)時，出現(xiàn)較深的帶時，可以幫助確定為A堿基?；瘜W(xué)法必須4或5個反應(yīng)管統(tǒng)一閱讀，DNA中4個堿基每個位置都有1個相應(yīng)的片段，待測的DNA全部序列可直接讀出。 化學(xué)法測序采用32P標(biāo)記DNA進(jìn)行，條帶會較末端法更模糊，更寬，由于分辨率不足，從單塊凝膠上能得到可靠序列數(shù)量約為200-300bp以內(nèi)。,聚丙烯酰胺凝膠電泳將DNA鏈按長短分開,根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直接讀出DNA的核苷酸序列。,如果G+A中出現(xiàn)1條帶就看G列中是否有同樣大小的帶，若有即為G堿基，無則為A堿基；同理，C+T中則檢查C列中有無同樣大小條帶，有即為C，無則為T。,在做了AC反應(yīng)時，出現(xiàn)較深的帶時，可以幫助確定為A堿基。,DNA序列測定的應(yīng)用,1) 測序 PCR克隆測序驗證 突變體檢測 新基因測序 全基因組測序 系統(tǒng)發(fā)育及物種鑒定 2) 片段分離 個體識別：親緣鑒定 SNP關(guān)聯(lián)分析 疾病診斷等,Maxam-Gilbert化學(xué)降解法的測序長度約250bp,優(yōu)點：不需要進(jìn)行酶催化反應(yīng)，因此不會產(chǎn)生由于酶催化反應(yīng)而帶來的誤差；對未經(jīng)克隆的 DNA 片段可以直接測序；化學(xué)降解測序法特別適用于測定含有如 5-甲基腺嘌呤 A 或者 G ， C 含量較高的 DNA 片段，以及短鏈的寡核苷酸片段的序