1、4 無菌操作技術(shù),一、外植體的選擇與處理 二、外植體的接種和培養(yǎng) 三、試管苗的馴化與移栽 四、常見問題與解決措施,一、外植體的選擇與處理 （一） 外植體的選擇 （二） 外植體的處理 （三）污染問題及解決措施,（一）外植體的選擇 植物組織培養(yǎng)的主要作業(yè)大致包括：外植體的選擇與處理、培養(yǎng)基的制備、器具的消毒、無菌操作和環(huán)境條件的調(diào)控。,1. 選擇優(yōu)良的種質(zhì) 無論是離體培養(yǎng)繁殖種苗，或者是進(jìn)行生物技術(shù)研究，培養(yǎng)材料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)，或特殊的基因型。對(duì)材料的選擇要有明確的目的，具有一定的代表性，提高成功機(jī)率，增加其實(shí)用價(jià)值。,2. 選擇健壯的植株 組織培養(yǎng)用的材料，最好從

2、生長健壯的無病蟲的植株上，選取發(fā)育正常的器官或組織。因?yàn)檫@些器官或組織代謝旺盛，再生能力強(qiáng)，比較容易培養(yǎng)成功。,3.選擇最適的時(shí)期 組織培養(yǎng)選擇材料時(shí)，要注意植物的生長季節(jié)和植物的生長發(fā)育階段。如快速繁殖時(shí)應(yīng)在植株生長的最適時(shí)期取材，這樣不僅成活率高，而且生長速度快，增殖率高；花藥培養(yǎng)應(yīng)在花粉發(fā)育到單核期時(shí)取材，這時(shí)比較容易形成愈傷組織。,4.選取適宜的大小 建立無菌材料時(shí)，取材的大小根據(jù)不同植物材料而異。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈傷組織，甚至難于成活。一般選取培養(yǎng)材料的大小，在0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小。,(二)外植體的處理 外植體在接

3、種前先要滅菌，在滅菌前，又先要進(jìn)行預(yù)處理。植物材料一般采取的預(yù)處理方法是，先對(duì)植物組織進(jìn)行修整，去掉不需要的部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料在流水中沖洗干凈。經(jīng)過預(yù)處理的植物材料，其表面仍有很多細(xì)菌和真菌，因此還需進(jìn)一步滅菌。,常規(guī)的表面滅菌處理方法 把材料放進(jìn)75%的酒精中約30 60s。 用2.5%的CaCl0（次氯酸鈣）溶液浸泡1520min。 無菌蒸餾水沖洗35次。 滅菌時(shí)進(jìn)行搖動(dòng)，使植物材料與滅菌劑有良好的接觸。 在滅菌劑里滴入數(shù)滴0.1%的Tween20（吐溫）或Tween80濕潤劑，能增強(qiáng)滅菌效果。,常用滅菌藥劑的使用和效果,（三）污染問題及解決措施 1. 污染的原因 污染是指在組織培

4、養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。 污染的原因：從病源菌方面來分析主要有細(xì)菌及真菌兩大類；從污染的途徑而言，主要是由于外植體帶菌、培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底、操作人員未遵守操作規(guī)程等引起的。,細(xì)菌污染的特點(diǎn)：菌斑呈粘液狀物，而且在接種后12天即可發(fā)現(xiàn)。 原因：材料帶菌 培養(yǎng)基滅菌不徹底 操作人員未遵守操作規(guī)程 因此接種人員的手應(yīng)經(jīng)常用70%灑精擦凈，鑷子和接種針在使用前必須在火焰上燒紅。,真菌污染的特點(diǎn)：污染部分長有不同顏色的霉菌，在接種后310天才能發(fā)現(xiàn)。 原因：周圍環(huán)境不清潔 超凈工作臺(tái)的過濾裝置失效 培養(yǎng)用器皿的口徑過大 為了減少損失，提高工作效率，必須在每個(gè)操作環(huán)節(jié)注意

5、防止污染的發(fā)生。,2.污染的預(yù)防措施 發(fā)現(xiàn)污染的材料應(yīng)及時(shí)處理，否則將導(dǎo)致培養(yǎng)室環(huán)境污染。對(duì)一些特別寶貴的材料，可以取出再次進(jìn)行更為嚴(yán)格的滅菌，然后接入新鮮的培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)。要處理的污染培養(yǎng)瓶最好在打開瓶蓋前，先集中進(jìn)行高壓滅菌，再清除污染物，然后洗凈備用。現(xiàn)就根據(jù)污染途徑，闡述污染的幾種預(yù)防措施。,（1）防止材料帶菌 用莖尖作外植體時(shí)，可在室內(nèi)或無菌條件下對(duì)枝條先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。枝條水洗凈插入無糖的營養(yǎng)液或自來水促使抽枝，以這種新抽的嫩枝條作為外植體接種。這樣便可大大減少材料的污染。 或在無菌條件下對(duì)采自田間的枝條進(jìn)行暗培養(yǎng)，待抽出徒長的黃化枝條時(shí)采枝，經(jīng)滅菌后接種也可明顯減少污染。,選擇合適

6、的時(shí)間去田間采取外植體 避免陰雨天去田間采取外植體。 在晴天采取外植體時(shí)，下午采取的外植體要比早晨采的污染少，因材料經(jīng)過日曬后可殺死部分細(xì)菌或真菌。,目前對(duì)材料內(nèi)部污染還沒有令人滿意的滅菌方法。在菌類長入組織內(nèi)部時(shí)，要?jiǎng)內(nèi)ド夏晟镊[片，甚至要除去韌皮組織，只接種內(nèi)部的分生組織，以收到一定的防污染效果。,（2）外植體的滅菌 多次滅菌法：一是將切好的外植體放入2.5%的次氯酸鹽溶液中消毒20-30min；二是在無菌蒸餾水中沖洗3次；三是將材料封閉在無菌的培養(yǎng)皿中過夜，保持一定溫度；四是第二天再將外植體用2.5%次氯酸鈉滅菌20-30min，然后用蒸餾水洗3次。對(duì)層積過的種子可用多次滅菌法，在種子吸

7、脹前后都要滅菌。,對(duì)易污染而難滅菌的材料用多種藥液交替浸泡消毒： 一是將外植體用洗滌液充分洗凈并修整干凈； 二是將材料放入75%灑精中滅菌30-60s； 三是在1：500的Roccal B（一種商品滅菌劑名）稀釋液中浸5min； 四是在2.5%次氯酸鈉溶液中滅菌2030min； 五是用無菌水沖洗5次，或放入無菌的0.1mol鹽酸（HCl）中浸15-20s，再用無菌水沖洗數(shù)次。,（3）玻璃器皿的滅菌 濕熱滅菌法即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行高溫高壓滅菌，滅菌時(shí)間可延長達(dá)25min30min。 干熱滅菌法即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進(jìn)行滅菌。 煮沸滅菌即將玻璃器皿放入水中煮沸進(jìn)行滅菌。,（4

8、）金屬器械的滅菌 火焰滅菌法：即把金屬器械放在95%的酒 精中浸一下，然后放在火焰上燃燒滅菌。 這一步驟應(yīng)當(dāng)在無菌操作過程中反復(fù)進(jìn) 行。 干熱滅菌法：即將拭凈或烘干的金屬器械用 紙包好，盛在金屬盒內(nèi)，放在烘箱中滅菌。,（5）布質(zhì)制品的滅菌 濕熱滅菌法：工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的的布質(zhì)品，放入高壓鍋中，用1.1公斤/厘米2 （即15磅/英寸2），121C的溫度，滅菌20 min30min。,（6）無菌操作室的滅菌 無菌操作室的地面、墻壁和工作臺(tái)的滅菌可用2%的新潔爾敏或75%的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約20min。使用前用75%的酒精噴霧，使空間灰塵落下。一年中要

9、定期一、二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。 （7）操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)格按照無菌操作的程序進(jìn)行,二、外植體的接種和培養(yǎng) （一）外植體的接種 （二）外植體的培養(yǎng),外植體的接種是把經(jīng)過表面消毒后的植物材料切碎 或分離出器官、組織、細(xì)胞，并將它們轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng) 基上的全部操作過程。整個(gè)接種過程均須無菌操作。操 作過程中引起的污染，主要由空氣中的細(xì)菌和工作人員 本身引起的。因此除接種室空氣消毒外，應(yīng)特別注意防 止工作人員本身引起的污染。,（一）外植體的接種,1操作人員需著經(jīng)消毒的白色工作服，戴口罩。進(jìn)入接種室前，工作人員的雙手必須進(jìn)行消毒，用肥皂和水洗滌能達(dá)到良好的效果, 進(jìn)行操作前再用75%的酒精擦洗雙

10、手。,無菌操作室的滅菌 無菌操作室的地面、墻壁和工作臺(tái)的滅菌可用75%的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約20min。使用前用75%的酒精噴霧，使空間灰塵落下。一年中要定期1-2次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。,2操作期間經(jīng)常用75%的酒精擦拭雙手和臺(tái)面。特別注意防止“雙重傳遞”的污染，例如：器械被手污染后又污染培養(yǎng)基。,3在打開培養(yǎng)瓶時(shí)，最大的污染危險(xiǎn)是管口邊沿沾染 的微生物落入管內(nèi)，解決這個(gè)問題，可在打開前用火 焰燒瓶口。 如果培養(yǎng)液接觸了瓶口，則瓶口要燒到足夠的熱 度，以殺死存在的細(xì)菌。 為避免灰塵污染瓶口，可用紙或者保鮮膜包扎瓶 口和塞子，以遮蓋瓶子頸部和試管口，相對(duì)地減少污 染機(jī)會(huì)。,4工具用后及

11、時(shí)消毒，避免交叉污染。 5工作人員的呼吸也是污染的主要途徑。通常在平靜呼吸時(shí)細(xì)菌是很少的，但是談話或咳嗽時(shí)細(xì)菌便增多，因此操作過程應(yīng)禁止不必要的談話并戴上口罩。,6由于空氣中有灰塵，因此在操作時(shí)，仍要注意避免灰塵的落入。盡量把蓋子蓋好，當(dāng)打開瓶子或試管時(shí)，應(yīng)拿成斜角，以免灰塵落入瓶中。 刀、剪、鑷等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中或插在器械滅菌器中，用時(shí)在火焰上消毒，待冷卻后使用。每次使用前均需進(jìn)行用具消毒。,（二）外植體的培養(yǎng) 接種后的外植體應(yīng)送到培養(yǎng)室去培養(yǎng)。組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)之一就是在人工控制的環(huán)境條件下，使培養(yǎng)物生長發(fā)育，研究植物的生命活動(dòng)。 培養(yǎng)室的培養(yǎng)條件要根據(jù)植物對(duì)環(huán)境條件的不同

12、需求進(jìn)行調(diào)控。其中最主要的是光照、溫度、濕度、氧氣和培養(yǎng)基的pH值等。,1光照 對(duì)離體培養(yǎng)物的生長發(fā)育，光照條件有重 要的作用。通常對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)，在黑暗條件下 有利，在有光條件下培養(yǎng)的愈傷組織質(zhì)地和顏色也 有不同。但分化器官需要光照，并隨著芽苗的生長 需要加強(qiáng)光照。加強(qiáng)光照，可以使小苗生長健壯， 促進(jìn)“異養(yǎng)”向“自養(yǎng)”轉(zhuǎn)化，提高移植的成活率。,普通培養(yǎng)室要求每日光照12h-16h，光照強(qiáng)度1000lx- 5000lx。如果培養(yǎng)材料要求在黑暗中生長，可用鋁箔或者適合的黑色材料包裹在容器的周圍，或置于暗室中培養(yǎng)。,2溫度 離體培養(yǎng)中對(duì)溫度的調(diào)控要比光照顯得更為突出。不同的植物有不同的最適生長溫度，大多數(shù)植物最適溫度在23C-32C之間。培養(yǎng)室一般所用的溫度是25C2C。低于15C或高于35C，對(duì)生長都是不利的。,3濕度 組織培養(yǎng)中的濕度影響主要