1、HPV的檢測及其臨床應(yīng)用,陜 西 省 人 民 醫(yī) 院 檢 驗(yàn) 科 劉 文 康,HPV,乳頭瘤病毒科屬小DNA病毒 乳頭瘤病毒的基因組主要編碼三組基因 三個癌基因，包括E5、E6和E7，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程； 兩個調(diào)節(jié)基因，包括E1和E2，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和病毒基因組的復(fù)制； 兩個結(jié)構(gòu)蛋白基因，包括L1和L2，組成病毒顆粒,HPV感染,屬于常見的性傳播感染 直接的皮膚-皮膚接觸是傳播的最有效途徑 病毒不通過血液或體液傳播（例如精液）,HPV感染,生殖器HPV感染的潛伏期變化極大。一般來說，生殖器疣在HPV感染3-6月后顯現(xiàn)，然而也有研究表明潛伏期有數(shù)個月甚至幾十年； 絕大多數(shù)的HPV感染是一過性的

2、，新發(fā)感染大多1-2年內(nèi)會發(fā)生自愈； 僅有少數(shù)的HPV感染會保持潛伏性，幾年或幾十年后會再激活。,多數(shù)生殖道HPV感染無臨床癥狀 與HPV相關(guān)的宮頸疾病包括：宮頸濕疣、宮頸病變和宮頸癌等 從HPV感染到釋放病毒約有3周。但是，HPV感染至出現(xiàn)損傷之間可能數(shù)周到數(shù)月。病毒感染的早期可能存在免疫逃逸，故沒有炎癥反應(yīng),完整的HPV感染循環(huán),HPV感染顆粒突破下肛殖道表皮 HPV感染顆粒進(jìn)入表皮細(xì)胞的基底層 隨著基底層干細(xì)胞的子細(xì)胞分裂以及在垂直方向上的成熟化，病毒在基底層以上鱗狀細(xì)胞中復(fù)制 成熟的病毒在表面細(xì)胞分離時釋放到環(huán)境中,HPV分型,最重要的分類學(xué)單元是型(type) 與宮頸癌相關(guān)程度較為清

3、楚的HPV型歸為高危型HPV（16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 ）和疑似高危型HPV（ 26, 53, 66 ） 與尖銳濕疣等良性疾病相關(guān)的HPV被歸入低危型HPV（ 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81，89 ），一般認(rèn)為這類HPV的感染不會誘導(dǎo)宮頸癌的發(fā)生,HPV與宮頸癌的相關(guān)性,年輕性活躍的女性HPV感染率最高，感染高峰年齡為1828歲 多屬于一過性感染，通過自身免疫將HPV消滅 只有持續(xù)感染HPV的婦女,才成為子宮頸癌高發(fā)人群 HPV感染到發(fā)展成為子宮頸癌需要9-2

4、5年時間 30%發(fā)展成為CIN1,10%發(fā)展成為CIN2,10%進(jìn)一步發(fā)展成為CIN3，1%發(fā)展成為子宮頸癌,宮頸癌前病變,宮頸上皮細(xì)胞內(nèi)瘤變 （CIN）；包括宮頸非典型增生和宮頸原位癌，反映宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的過程。從細(xì)胞學(xué)分為CINI、III級，包含宮頸鱗狀上皮細(xì)胞內(nèi)病變和腺細(xì)胞內(nèi)病變。,宮頸癌現(xiàn)狀,女性第二大常見惡性腫瘤 全世界每年新病例數(shù)為56.5萬 在發(fā)展中國家宮頸癌的發(fā)生率為發(fā)達(dá)國家6倍，有50%的病例發(fā)生在中國和印度 中國每年新病例為18.15萬 中國每年有3萬多的婦女死于宮頸癌,發(fā)展中國家的新發(fā)病例多是晚期患者,未能早期診斷 細(xì)胞學(xué)檢查未能普及 陰道鏡應(yīng)用條件受到限制 民眾對宮頸

5、癌的防范意識欠缺,發(fā)病年齡,原位癌的發(fā)病年齡為35-39歲 浸潤癌為40-49歲,宮頸癌的新動向,近年來由于生活方式的改變 發(fā)病率: 有上升趨勢 發(fā)病年齡: 趨向年輕化,HPV 感染和宮頸癌在不同年齡組的發(fā)生率,年齡 (Years),HPV 感染率 (%),40-44,15-19,20-24,25-29,30-34,35-39,45-49,50-54,0,5,10,15,20,25,30,0,5,10,15,20,25,30,每10萬人中宮頸癌發(fā)生率,哪些些婦女更容易患宮頸癌,性生活過早 早孕多產(chǎn)或多次人工流產(chǎn) 自己或性伴侶有多個性伴侶 曾經(jīng)或正患有生殖道HPV感染 有或曾經(jīng)患有其它性病 吸煙

6、、吸毒和營養(yǎng)不良 內(nèi)分泌紊亂或免疫力低下的婦女,現(xiàn)在基本明確宮頸癌的病因就是高危型HPV的持續(xù)性感染。 感染HPV病毒到發(fā)展成浸潤癌需要大約十年的歷程，這是重要不可忽視的時間，只要定期進(jìn)行婦科健康檢查，就可以及早發(fā)現(xiàn)子宮頸癌癌前病變并加以治療，就可有效地扼制其癌變;預(yù)防子宮頸癌的發(fā)生。,宮頸癌可以預(yù)防和治愈,引起宮頸癌幾個方面因素,HPV致宮頸癌機(jī)理,5-10years,HPV感染,持續(xù)HPV感染,細(xì)胞 分化異常CIN,高度 CIN,30,30,宮頸癌,輔助 致癌劑,免疫因素,HPV E6癌蛋白與宮頸惡性病變的關(guān)系,HPV E7癌蛋白的分子生物學(xué)特性,宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生異常和瘤變的進(jìn)化過程,HP

7、V致宮頸癌進(jìn)展示意圖,LSIL LSIL,CIS,CA,810年（100%治愈）,25年（死亡）,正常,低度 病變,高度 病變,原位癌,浸潤癌,關(guān)于HPV感染,HPV感染多數(shù)不發(fā)展成為宮頸癌，可以在9-16(8-10)個月消失; 間隔半年2次HPV（）; HPV持續(xù)感染; 28%的持續(xù)感染者,在2年內(nèi)發(fā)展為CIN I；70% 的持續(xù)感染者4年內(nèi)發(fā)展為CINII;,HPV實(shí)驗(yàn)室檢測,臨床常用的HPV檢測方法,病理學(xué)檢查 細(xì)胞學(xué)檢查 免疫組化檢測 原位雜交技術(shù)檢測 聚合酶鏈反應(yīng)( PCR)技術(shù) DNA芯片分型檢測 雜交捕獲DNA分析,病理學(xué)檢查,鱗狀上皮疣狀乳頭狀增生 表皮角化不全 棘層不規(guī)則增厚

8、 基底層增生 上皮腳延長 中表層出現(xiàn)灶狀分布的挖空細(xì)胞等。,細(xì)胞學(xué)檢查,凹空細(xì)胞、角化不良及濕疣外底層細(xì)胞 細(xì)胞學(xué)診斷HPV感染敏感性較差,免疫組化檢測,檢測HPV的衣殼抗原來進(jìn)一步明確HPV感染 所得陽性反應(yīng)定位明確,判斷可靠 必須在HPV-DNA 復(fù)制成熟后才有衣殼裝備 敏感性較低,原位分子雜交,用來測定基因或特定核苷酸序列在核酸分子的所在部位，檢測重組體DNA） 通過非放射性探針對石蠟組織進(jìn)行檢測,能作定位檢測,假陽性率低,但靈敏度不高,大大降低了臨床使用價值。,聚合酶鏈反應(yīng)( PCR)技術(shù),設(shè)計(jì)與HPV-DNA互補(bǔ)的一對特異性核苷酸引物,以HPV-DNA為模板以指數(shù)增長的速率進(jìn)行體外擴(kuò)

9、增 敏感性最高,可對HPV進(jìn)行分型,測定病毒載量,發(fā)現(xiàn)新基因型,對基因進(jìn)行序列分析 缺點(diǎn)為樣品間易交叉污染導(dǎo)致假陽性,雜交捕獲DNA分析,標(biāo)本中的HPV-DNA 與液相中的RNA探針結(jié)合,形成特異性的RNA-DNA雜交體,被微孔板內(nèi)的特異抗體所捕獲,然后被所加的發(fā)光底物檢測,其發(fā)光的強(qiáng)度與標(biāo)本中的DNA 量成比例,因而可對HPV進(jìn)行半定量檢測 效率高,適于大量人群檢測,臨床上操作簡便,DNA裂解 RNA-DNA雜交 抗體捕獲 化學(xué)發(fā)光 計(jì)算機(jī)判讀,裂解 加入探針 雜交 加入二抗和發(fā)光劑,hC2方法，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高，并能做到定量，但不能分出亞型。芯片技術(shù)，可在相同的條件下，分出亞型，但不能定

10、量。因此， HPV亞型分類和定量檢測研究將成為今后的重要課題。亞型和量化，可能對疾病的演變和轉(zhuǎn)歸提供更有利的證據(jù)。,宮頸癌的篩查,篩查對象,21歲以上有性生活史或具有性生活三年以上的任何婦女。 高危人群：有多個性伴侶、性生活過早、HIV / HPV感染、機(jī)體免疫功能低下、衛(wèi)生條件差/性保健知識缺乏。 某些情況無需進(jìn)行篩查，如因良性疾病摘除子宮的婦女。,起始年齡： 在我國經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)為2530歲；經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)為3540歲。對于高危婦女人群，篩查起始年齡應(yīng)適當(dāng)提前。 終止年齡： 65歲后患子宮頸癌的危險性極低，故一般不主張對65歲以上的婦女進(jìn)行子宮頸癌篩查。,篩查間隔,1、每年一次細(xì)胞學(xué)檢查，連

11、續(xù)2次（-）， 可3年一次 2、連續(xù)2次HPV（-），細(xì)胞學(xué)檢查（-） 可58年一次 3、高危人群：最好每年一次 （CIN及以上、特殊職業(yè)、30歲以上高危HPV感染者）,篩查方案,根據(jù)中國癌癥預(yù)防與控制規(guī)劃綱要（2004-2010）推薦，一般可以選擇下面兩種篩查方案。,醋酸或碘染色后肉眼觀察（VIA/VILI）,陽性 陰性 陰道鏡+病理 定期篩查（1次/年） 相應(yīng)治療 初級篩查方案流程圖,醫(yī)生取材HPV檢測+傳統(tǒng)巴氏涂片（TBS分級）,HPV（-） HPV（+） HPV （-） HPV （+） 細(xì)胞學(xué) ASCUS 細(xì)胞學(xué) ASCUS 細(xì)胞學(xué) ASC-H 細(xì)胞學(xué) ASC-H 陰道鏡檢查/ 多點(diǎn)活檢+ECC 篩查（1次/35年） 隨訪（1次/年） 相應(yīng)治療 一般篩查方案流程圖,取材HPV檢測+液基細(xì)胞學(xué)檢查（TBS分級）,HPV（-） HPV（+） HPV（-） HPV（+） 細(xì)胞學(xué)ASCUS 細(xì)胞學(xué) ASCUS 細(xì)